Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Podsumowanie

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Streszczenie

Komórki grzebienia neuronalnego (NCCs) to przejściowa populacja komórek występująca w rozwoju kręgowców, które emigrują z grzbietowej części cewy nerwowej (NT) po przejściu przejścia epitelialno-mezenchymalnego ^1,2. Po EMT komórki NCC migrują na duże odległości wzdłuż stereotypowych szlaków, aż dotrą do swoich celów. NCC różnicują się w szeroki wachlarz typów komórek, w tym neurony, glej, melanocyty i komórki chromafinne ^1-3. Zdolność NCC do dotarcia do odpowiednich miejsc docelowych i ich rozpoznania jest fundamentalna dla prawidłowego formowania się wszystkich struktur zawierających komponenty pochodzące z NCC tułowia ³. Wyjaśnienie mechanizmów kierowania migracją NCC tułowia miało zatem ogromne znaczenie. Wykazano, że liczne cząsteczki kierują migracją NCC ⁴. Na przykład wiadomo, że NCC tułowia są odpychane przez negatywne sygnały kierujące, takie jak ligandy semaforyny, efryny i slit ^5-8. Jednak dopiero niedawno zidentyfikowano chemoatraktanty NCC tułowia ⁹.

Konwencjonalne podejścia in vitro do badania zachowań chemotaktycznych komórek adherentnych sprawdzają się najlepiej w przypadku komórek unieśmiertelnionych, rozmieszczonych homogenicznie, jednak są trudniejsze do zastosowania w określonych kulturach pierwotnych komórek macierzystych, które początkowo nie wykazują homogennego rozkładu i szybko ulegają różnicowaniu (tak jak NCC). Jedną z metod homogenizacji rozkładu NCC z tułowia na potrzeby badań chemotaksji jest izolacja NCC z tułowia z pierwotnych kultur eksplantów NT, a następnie ich odklejenie i ponowne wysianie tak, aby osiągnęły niemal 100% konfluencji. Jednak to podejście do wysiewania wymaga znacznych nakładów czasu i pracy w celu wyizolowania odpowiedniej liczby komórek, jest agresywne i powoduje rozmieszczenie NCC z tułowia w sposób odmienny od warunków występujących in vivo.

W niniejszej pracy opisujemy metodę in vitro umożliwiającą ocenę chemotaksji oraz innych reakcji migracyjnych komórek grzebienia neuronalnego (NCC) tułowia bez konieczności zapewnienia jednorodnego rozkładu komórek. Technika ta wykorzystuje obrazowanie time-lapse pierwotnych, niezakłóconych NCC tułowia w zmodyfikowanej komorze Zigmonda (standardowa komora Zigmonda została opisana w innym opracowaniu¹⁰). Poprzez wystawienie NCC tułowia znajdujących się na obrzeżach hodowli na gradient chemotaktyczny prostopadły do ich przewidywanego naturalnego kierunku ruchu, można wykryć zmiany w polarności migracji indukowane zastosowanym gradientem chemotaktycznym. Metoda ta jest niedroga, wymaga hodowli tylko dwóch eksplantów z cewy nerwowej (NT) na każdą powtórkę traktowania, pozwala uniknąć agresywnego odrywania komórek (takiego jak trypsynizacja), pozostawia NCC tułowia w rozkładzie bardziej zbliżonym do warunków in vivo, skraca czas między eksplantacją a eksperymentem (co prawdopodobnie zmniejsza ryzyko różnicowania) oraz umożliwia ocenę wielu cech migracyjnych w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Dzień 1: Izolacja cewekt neuralnych tułowia do hodowli nocnej na szkiełkach nakrywkowych

1. Inkubować jaja kurze przez 56 h w temperaturze 38°C° C. Wyjąć jaja z inkubatora, delikatnie spryskać je 70% etanolem, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Rozbić jaja do szklanej tacy wysterylizowanej promieniami UV.
2. Wyjmij każdy embrion z żółtka i umieść w roztworze Ringera dla kurcząt. W tym celu najpierw wytnij obszar wokół wysp krwi za pomocą zakrzywionych nożyczek, a następnie, używając pęsety tępiej, chwyć embrion za błonę pozazarodkową i przenieś go do sterylnej plastikowej płytki Petri zawierającej roztwór Ringera dla kurcząt.′roztwór.
3. Wyizoluj tułów każdego zarodka, odcinając nadmiar błon pozazarodkowych oraz poziomy osiowe czaszkowe, błędne i krzyżowe za pomocą igły wolframowej (Rys. 1). Najpierw wybierz około 9 zarodków znajdujących się w stadiach HH15-17. ¹¹W stadiach od HH15 wzwyż osie przedmózgowia i rąb mózgu tworzą kąt ostry, przez co głowa wydaje się być pochylona ku dołowi. W stadium HH17 obecny jest pączek ogonowy, który jest nachylony brzusznie, lecz nie zawiera jeszcze somytów. Za pomocą igły wolframowej przytnij błony pozazarodkowe do odległości około 2 mm od zarodka i odetnij wszelkie tkanki zarodkowe znajdujące się przed 10. somytem. Usuń również wszystkie tylne tkanki zarodkowe, zaczynając od okolic piątego z najnowszych somytów.
4. Umieścić wyizolowane tułowie embrionów w dyspazie (0,24 U/ml DMEM) i inkubować przez 1 h 15 min w temperaturze 37°C.° C i 5% CO2₂Gdy pnie zostaną poddane inkubacji, należy rozpocząć przygotowywanie 6 szkiełek podstawkowych (CS) do hodowli eksplantów NT (kroki 1.5-1.8).
5. Opłucz 6 szkiełek podstawowych (CS) w 70% etanolu (rozcieńczonego w sterylnej, ultraczystej wodzie), a następnie pozostaw je do wyschnięcia. Za pomocą markera laboratoryjnego narysuj na środku każdego szkiełka okrąg o średnicy około 1 cm (okrąg ten pomoże później zidentyfikować miejsce nałożenia powłoki z fibronektyny). Na tej samej stronie każdego szkiełka, poza narysowanym okręgiem, napisz słowo „be” (lub inny asymetryczny wyraz bądź kształt), co pozwoli określić, czy zaznaczona strona szkiełka jest skierowana do góry, czy do dołu.
6. Każdy plasterek CS należy umieścić w oddzielnej sterylnej szalce o wymiarach 40 x 10 mm, stroną z oznaczeniem skierowaną do dołu, a następnie pozostawić otwartą szalkę pod lampą UV o działaniu bakteriobójczym na 10 min.
7. Nanieść 60 μfibronektyna (FN; 10 μ(g/ml DMEM) na nieoznakowaną powierzchnię CS, upewniając się, że cały obszar w obrębie koła o średnicy 1 cm został pokryty. Płytki należy inkubować w temperaturze 37° inkubować przez 30 min, a następnie ostrożnie odessać fibronektynę z każdej studni CS.
8. Dodaj 250 μpożywkę hodowlaną [DMEM z L-glutaminą (2 mM), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 mcg/ml) i 8% płatkową surowicą bydlęcą (FBS)] na obszar CS pokryty fibronektyną (FN). Płytki zawierające poszczególne CS należy umieścić w temperaturze 37° C i 5% CO₂₂ ponownie, aż do momentu wyizolowania NT.
9. Przenieś wszystkie inkubowane tułowie embrionów do jednej szklanej szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej podłoże L15 i przystąp do wycinania każdej rurki nerwowej (NT), używając precyzyjnej pęsety oraz igły wolframowej (Rys. 1). Ostrożnie nacinaj wzdłuż granicy rurki nerwowej i somytów ostrą igłą wolframową, uważając, aby nie uszkodzić rurki nerwowej. Często łatwiej jest rozpocząć izolowanie każdej rurki nerwowej od najbardziej guzicznego końca tułowia.
10. Wybierz 6 najprostszych i najdłuższych rurek neuralnych (NT) do hodowli nocnej (zaleca się wybór NT o długości około 8 do 15 somitów). Używając końcówki mikropipety przygotowanej za pomocą hodowla pożywką, przenieś każdy z 6 NT do osobnego, wcześniej przygotowanego CS (zgodnie z krokami od 1.5 do 1.8). Upewnij się, że NT nie unosi się na powierzchni. Jeśli NT pływa, za pomocą mikropipety zakraplaj na niego pożywkę, aż zatonie.
11. Umieścić każdą płytkę w temperaturze 37°C° C i 5% CO₂₂ przez noc. Należy upewnić się, że każdy NT znajduje się w obszarze pokrytym FN na odpowiednim CS bezpośrednio przed umieszczeniem szalki w inkubatorze (korzystając z okręgu narysowanego w kroku 1.5 jako punktu odniesienia). W razie potrzeby można użyć mikropipety, aby dokładniej skorygować położenie każdego NT.
12. Należy nalać co najmniej 2 ml hodowla pożywkę (bez surowicy) do sterylnej probówki wirnikowej o pojemności 15 ml i inkubować przez noc w temperaturze 37° C i 5% CO2₂Pozostaw korek lekko odkręcony, aby pH medium mogło ustabilizować się przez noc. Preinkubacja medium jest istotna, ponieważ pomaga zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorze, co mogłoby zaburzyć ustanowienie gradientu molekularnego. Takie „preinkubowane” medium należy stosować we wszystkich kolejnych etapach. W czasie, gdy medium nie jest używane, powinno być inkubowane w temperaturze 37°C.° C.

2. Dzień 2: Wypełnianie zmodyfikowanej komory Zigmonda i analiza migracji komórek w trybie time-lapse

1. Z 6 hodowli NT wybierz 3 kultury najlepiej nadające się do analizy. Zazwyczaj należy wybierać kultury NCC, które mają przynajmniej jedną długą, prostą krawędź (Rys. 2A). Te 3 najlepsze kultury zostaną wykorzystane do załadowania i filmowania 3 zmodyfikowanych komór Zigmonda w ciągu dnia, z których każda zostanie poddana innej obróbce. Z 3 kultur wybierz jedną do załadowania do pierwszej komory, a pozostałe zwróć do inkubatora do późniejszego użycia.
2. Za pomocą patyczka bawełnianego nałóż cienką, równomierną warstwę wazeliny wokół zbiorników i mostka jednej zmodyfikowanej komory Zigmonda.
3. Za pomocą igły wolframowej delikatnie usuń NT z CS, pozostawiając otaczające NCC przytwierdzone do powierzchni CS. Oznacz płytkę pisakiem, aby zapamiętać orientację najprostszej krawędzi kultury NCC.
4. Nanieś kilka kropel preinkubowanego medium na mostek. Podnieś CS za pomocą precyzyjnych pęsety, osusz krawędź CS o ręcznik Kimwipe, aby usunąć większość starego medium hodowlanego, a następnie natychmiast umieść CS na zmodyfikowanej komorze Zigmonda tak, aby prosta krawędź kultury przeznaczonej do filmowania była wyśrodkowana nad długością mostka i znajdowała się mniej więcej prostopadle do granicy mostka i zbiornika (Rys. 2A,B).
5. Używając mikroskopu odwróconego, przesuń prostą granicę NCC tak, aby znajdowała się po stronie mostka najbliższej zbiornika, który będzie zawierał domniemany chemotaktykant (Rys. 2B; w przypadku kontroli będzie to zbiornik ładowany jako drugi). Następnie precyzyjniej ustaw prostą krawędź kultury prostopadle do granicy mostka i zbiornika.
6. Ostrożnie, ale pewnie dociśnij CS do wazeliny znajdującej się na komorze Zigmonda, upewniając się, że jest ona całkowicie uszczelniona na komorze, a następnie nanieś dodatkową wazelinę wzdłuż krawędzi CS, aby zapewnić całkowitą szczelność. Ponownie precyzyjnie skoryguj kąt granicy NCC, aby zniwelować wszelkie przesunięcia podczas procesu uszczelniania.
7. Najpierw napełnij zbiornik, który nie będzie zawierał domniemanego chemotaktykanta (Rys. 2B). W tym celu napełnij strzykawkę 1 ml (z dołączoną igłą 25 G x 1,5 cala) około 300 μl preinkubowanego medium i wstrzyknij medium do zbiornika aż do pełna (uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza w zbiorniku). Przed napełnieniem następnego zbiornika szczelnie zamknij oba boki zbiornika odpowiednią ilością wazeliny.
8. Powtórz krok 2.7, ale tym razem użyj preinkubowanego medium zawierającego kandydujący chemotaktykant. Przy tworzeniu gradientu molekularnego w poprzek kultury kluczowe jest, aby zbiornik zawierający testowaną cząsteczkę zawsze napełniać po napełnieniu zbiornika pozbawionego testowanej cząsteczki.
9. Umieść napełnioną komorę Zigmonda w temperaturze 37° C w celu inkubacji przez 1 h przed filmowaniem. Wykonuj obrazy najprostszej granicy kultury NCC przez 3 h w odstępach 90 s podczas inkubacji w temperaturze około 37° C (Rys. 2A,B). Przed stworzeniem filmu upewnij się, że kamera jest ustawiona tak, aby krawędzie obrazów były wyrównane i stykały się z krawędzią mostka graniczącą z ostatnio napełnionym zbiornikiem (Rys. 2B, górny panel; przerywana ramka przedstawia idealną pozycję do obrazowania). Ułatwi to późniejszą analizę programową poprzez standaryzację kierunkowości zastosowanego gradientu molekularnego oraz odległości od filmowanego zbiornika w każdym wyprodukowanym filmie.
10. W przypadku kontroli powtórz kroki 2.2-2.9 dla każda z dwóch pozostałych wybranych kultur NCC (w kroku 2.1), ale napełnij każdy zbiornik odpowiednim medium. Dla jednego rodzaju kontroli napełnij oba zbiorniki preinkubowanym medium niewsierającym testowanej cząsteczki. Dla drugiej kontroli przygotuj mostek, nanieksiąc kilka kropel preinkubowanego medium zawierającego domniemany chemotaktykant przed zamontowaniem CS. Następnie napełnij oba zbiorniki tym samym medium zawierającym domniemany chemotaktykant.
11. Użyj wtyczek ImageJ (NIH) Manual Tracking (rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) oraz Chemotaxis and Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html), aby śledzić migrację obwodowych NCC wzdłuż prostej granicy właśnie obrazowanej kultury i analizować różne parametry uzyskanych trajektorii migracyjnych (Rys. 2B-C).

3. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiono przykład trajektorii komórek z filmu, w którym wiele komórek NCC pnia reagowało na kandydujący chemoatraktant z zastosowaniem powyższej techniki (Rys. 2D). Większość komórek w tym przykładzie dodatniej odpowiedzi wykazała wypadkowy ruch w górę gradientu chemoatraktanta (zaznaczony na czerwono). Dane z trajektorii mogą być również wykorzystane do analizy innych właściwości migracji komórek.

W celu wizualnej oceny przyłożonego gradientu w zmodyfikowanej komorze Zigmonda, do drugiego zbiornika komory wprowadzono koniugat Alexa Fluor 488 IgM (MW ~ 900 kDa) (stężenie około 40 μg/ml H₂O). Gradient został ustanowiony w ciągu 1 h i był nadal częściowo obecny po 26 h, jednak znacznie zmalał po 50 h (Ryc. 3). Jeśli testowana cząsteczka jest mniejsza, przyłożony gradient będzie ulegał szybszej degradacji niż pokazano na przykładzie.

Rycina 1. Eksplantacja rurek neuralnych (NT) na poziomie tułowia w celu nocnej hodowli na szkiełkach podstawkowych pokrytych fibronektyną. Ponieważ komórki grzebienia neuronalnego (NCC) tułowia oddzielają się od grzbietowej części NT zlokalizowanej sąsiadująco z somytami 8-28, ten segment NT jest izolowany poprzez mikrodysekcję i hodowany przez noc na pokrytym fibronektyną szkiełku podstawkowym (CS), aby umożliwić emigrację NCC z eksplantu NT. Izolowane NT o długości od 8 do 15 somytów i stosunkowo prostym przebiegu są najlepiej odpowiednie do nocnej hodowli, ponieważ mają tendencję do generowania kultur NCC o dłuższych, prostych krawędziach. Obszary rurki neuralnej, z których pochodzą inne poziomy osiowe grzebienia neuronalnego, przedstawiono mniejszą czcionką. s, somyt.

Rysunek 2. Metoda oceny migracji wyeksplantowanych NCC pnia przy użyciu zmodyfikowanej komory Zigmonda. (A) Wydłużone kultury NCC pnia są przygotowywane poprzez nocną hodowlę NT, a następnie do eksperymentów wybierane są kultury NCC z przynajmniej jedną długą, prostą krawędzią. Najdłuższa prosta krawędź wybranej kultury jest następnie ustawiana prostopadle do krawędzi mostka-zbiornika, a zatem równolegle do wektora przyszłego przyłożonego gradientu. (B) Po precyzyjnym dostrojeniu położenia kultury NCC w komorze Zigmonda i uszczelnieniu szkiełka nakrywki z komorą, komora zostaje napełniona. Podczas testowania chemotaksji w pierwszej kolejności napełniany i uszczelniany jest zbiornik, który nie będzie zawierał podejrzewanego chemotaktyku (-). Następnie drugi zbiornik jest napełniany podejrzewanym chemotaktykiem (+) i uszczelniany. Obwodowe NCC wzdłuż wcześniej wybranej krawędzi mogą być następnie obrazowane i śledzone przy użyciu wtyczki Manual Tracking dla programu ImageJ (dolny panel). (C) Na podstawie danych z monitorowania można ocenić liczne cechy migracyjne w odpowiedzi na przyłożony gradient. Na przykład wskaźnik chemotaksji można wyprowadzić, dzieląc przemieszczenie komórki wzdłuż osi x przez całkowity dystans, jaki przebyła. (D) Przykład odpowiedzi atrakcyjnej przedstawiono na wykresie trajektorii komórek wygenerowanym początkowo przez wtyczkę Chemotaxis and Migration Tool dla programu ImageJ. Punkt początkowy każdej trajektorii jest ustawiony w punkcie (0,0). Zauważmy, że znacznie więcej komórek migruje w kierunku źródła chemoatraktanta. Środek masy wszystkich komórek w ich końcowej pozycji (niebieski krzyżyk; wszystkie komórki o równej wadze) znajduje się również bliżej źródła chemoatraktanta. NCC, komórki grzebienia neuronalnego; czerwone ścieżki, komórki, które migrowały w stronę zbiornika z podejrzewanym chemoatraktantem; czarne ścieżki, komórki, które migrowały w przeciwnym kierunku; (+), wyższe stężenie chemotaktyku; (-), niższe stężenie chemotaktyku.

Rysunek 3. Profilem intensywności w poprzek mostka zmodyfikowanej komory Zigmonda w różnych odstępach czasu po dodaniu koniugatu Alexa Fluor 488 IgM. Komorę załadowano w sposób analogiczny do opisanego w protokole, z głównymi wyjątkami polegającymi na tym, że do rozcieńczenia przeciwciał do 40 μg/ml użyto wody wstępnie inkubowanej (zamiast wstępnie inkubowanego medium), a na końcach mostka (z dala od przekroju, z którego pobrano powyższe profile intensywności) znajdowały się małe pęcherzyki powietrza. Początkowo w większości mostka nie występował gradient. Po 1 h gradient został utworzony i utrzymywał się aż do 26 h. Po 50 h obecność gradientu była niespójna w różnych obszarach mostka, a gdy występował, jego nachylenie było znacznie mniejsze. Wszystkie profile zostały wygenerowane z identycznego przekroju poprzecznego mostka (od jednej krawędzi mostek-rezerwuar do drugiej) przy użyciu oprogramowania AxioVision 4.6. Należy zauważyć, że mimo obecności pęcherzyków powietrza gradient nie został zakłócony. High, wysoka intensywność; Low, niska intensywność; oś x, odległość w poprzek całej szerokości mostka (2 mm); (+), rezerwuar załadowany koniugatem Alexa Fluor 488 IgM; (-), rezerwuar nie załadowany koniugatem.

Rysunek 4. Specyfikacje zmodyfikowanej komory Zigmonda. Przedstawiono schemat zmodyfikowanej komory Zigmonda użytej w tej pracy wraz z jej wymiarami (±0,2 mm). Wymiary mogą być w umiarkowanym stopniu dostosowane do indywidualnych preferencji.

Protokół uzupełniający: Wykonanie zmodyfikowanej komory Zigmonda

W odniesieniu do poniższego protokołu należy posiłkować się Rysunkiem 4:

1. Należy zakupić arkusz polerowanego akrylu o grubości 3/16″ (rzeczywista grubość 4,45 mm).
2. Za pomocą piły stołowej należy wyciąć nadwymiarowe klocki komory o wymiarach przybliżonych do 33,25 mm x 64,57 mm. Pozwala to na zachowanie 3,175 mm nadmiaru materiału do obróbki.
3. Klocka komory należy zamocować w imadle. Przy użyciu frezarki i frezu palca o średnicy 6,35 mm (1/4″) należy wyfrezować boki komory do ich dokładnych wymiarów: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. Należy ustawić klocka komory na frezarce i zlokalizować środek klocka wzdłuż osi x i y za pomocą poszukiwacza krawędzi, a następnie wyzerować położenie środka.
5. Należy wyznaczyć wysokość komory (oś z), przykładając frez palca do górnej powierzchni, a następnie wyzerować wysokość.
6. Przy użyciu frezu palca o średnicy 3,91 mm (0,154″) należy przesunąć frez o 3,03 mm wzdłuż osi x (kierunek dodatni) dla pierwszego zbiornika. Należy rozpocząć frezowanie wewnątrz komory na głębokość 2,84 mm, poruszając się wzdłuż osi y (kierunek dodatni) do 7,62 mm (0,300″), a następnie przesunąć się o 7,62 mm (0,300″) w przeciwnym (ujemnym) kierunku, aż do uzyskania całkowitej długości zbiornika wynoszącej 15,24 mm (0,600″). Następnie należy przesunąć frez o 3,03 mm (0,119″) wzdłuż osi x (kierunek ujemny) i powtórzyć ten proces dla drugiego zbiornika.
7. Należy ustawić komorę na krawędzi i wywiercić otwór wiertłem o średnicy 1,09 mm (0,043 in.) na końcu każdego zbiornika (łącznie 4 otwory), co połączy koniec zbiornika z bokiem komory w celu ładowania medium podczas eksperymentu.
8. Komorę należy dokładnie namoczyć w ciepłej wodzie z mydłem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia chemiczne.
9. Komorę należy dokładnie namoczyć i wypłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej, aby usunąć mydło. Komory są teraz gotowe do użycia zgodnie z powyższym opisem.

Dyskusja

Prowadzenie badań nad chemotaksją komórek NCC tułowia okazało się trudne z kilku powodów. Komórki NCC tułowia stanowią heterogenną populację komórek macierzystych, które różnicują się podczas długotrwałej hodowli; w związku z tym komórki NCC tułowia muszą być pozyskiwane poprzez pierwotną eksplantację rurki neuralnej (NT) na poziomie tułowia. Konwencjonalne metody badania odpowiedzi chemotaktycznej homogenicznie rozłożonych populacji komórek in vitro są trudne do zastosowania w przypadku komórek NCC tułowia, pon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Omega Scientific	PS-20	stężenie roztworu stokowego 100X
L-glutamina	Omega Scientific	GS-60	stężenie roztworu stokowego 100X
Płodowa surowica bydlęca	Omega Scientific	FB-11	Partia# 105247 (lub inna porównywalna)
Modyfikowana komora Zigmonda	Własny wyrób	N/A	Objętość zbiornika: ~ 160 μl każdy; dodatkowe specyfikacje znajdują się na Rys. 4 oraz w uzupełniającym protokole wykonania
Szalka do hodowli komórek	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronektyna	BD	354008	Roztwór stokowy 10X przygotowany przez rozcieńczenie 1 mg FN w 1 ml H2O i 9 ml DMEM
Kryszalki	Fisher	12-548-B	Oczyszczone wstępnie; 22 x 22 mm
Pożywka L15	Thermo Scientific	SH30525.02
Wazelina	Comforts	011110794642	100%
Probówka do wirowania	Biologix	10-9152	15 ml
Dyspaza	Cell Systems	4Z0-850	stężenie roztworu stokowego 10X
Strzykawka	BD	309602	1 ml
Igła	BD	305127	25 G x 1,5 cala
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stężenie roztworu stokowego wynosi 2 mg/ml; 7 moli barwnika/mol IgM
Pinceta anatomiczna	FST	Różne	Dumont #5 lub 55; proste końcówki; stal nierdzewna lub tytan
Igła wolframowa	N/A	N/A	Własny wyrób; umieszczona w uchwycie
Pinceta tępa	Tiemann	160-18	Stosowana do przenoszenia embrionów z żółtka jaja do roztworu Ringera
Protokół uzupełniający: Wykonanie modyfikowanej komory Zigmonda
W poniższym protokole należy kierować się Rysunkiem 4:
Należy zakupić arkusz polerowanego akrylu o grubości 3/16" (rzeczywista grubość 4,45 mm). Za pomocą piły stołowej należy wyciąć klocki na komorę o wymiarach większych niż docelowe, tj. około 33,25 mm x 64,57 mm. Pozwala to na zachowanie 3,175 mm zapasu materiału do obróbki. Klocek na komorę należy zamocować w imadle. Używając frezarki i frezu czołowego 6,35 mm (1/4"), należy wyfrezować boki komory do dokładnych wymiarów: 30,07 mm x 61,39 mm. Klocek na komorę należy ustawić na frezarce i wyznaczyć środek klocka wzdłuż osi x i y za pomocą czujnika krawędzi, a następnie ustawić zero w punkcie środkowym. Wysokość komory (oś z) należy wyznaczyć, dotykając frezem górnej powierzchni, a następnie ustawić zero wysokości. Używając frezu czołowego 3,91 mm (0,154"), należy przesunąć frez o 3,03 mm wzdłuż osi x (kierunek dodatni) dla pierwszego zbiornika. Rozpocząć frezowanie komory na głębokość 2,84 mm, poruszając się wzdłuż osi y (kierunek dodatni) do 7,62 mm (0,300"), a następnie przesunąć się do 7,62 mm (0,300") w kierunku przeciwnym (ujemnym), aby uzyskać całkowitą długość zbiornika 15,24 mm (0,600"). Przesunąć frez o 3,03 mm (0,119") wzdłuż osi x (kierunek ujemny) i powtórzyć ten sam proces dla drugiego zbiornika. Ustawiając komorę krawędzią, należy wywiercić otwór za pomocą wiertła 1,09 mm (0,043 cala) na końcu każdego zbiornika (łącznie 4 otwory), co połączy koniec zbiornika z bokiem komory w celu wprowadzania pożywki podczas eksperymentu. Komorę należy dokładnie namoczyć w ciepłej wodzie z mydłem, aby pomóc w usunięciu zanieczyszczeń chemicznych. Komorę należy dokładnie namoczyć i wypłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej, aby usunąć resztki mydła. Komory są teraz gotowe do użycia zgodnie z powyższym opisem.