Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Podsumowanie

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Streszczenie

Komórki grzebienia neuronalnego (NCCs) to przejściowa populacja komórek występująca w rozwoju kręgowców, które emigrują z grzbietowej części cewy nerwowej (NT) po przejściu przejścia epitelialno-mezenchymalnego ^1,2. Po EMT komórki NCC migrują na duże odległości wzdłuż stereotypowych szlaków, aż dotrą do swoich celów. NCC różnicują się w szeroki wachlarz typów komórek, w tym neurony, glej, melanocyty i komórki chromafinne ^1-3. Zdolność NCC do dotarcia do odpowiednich miejsc docelowych i ich rozpoznania jest fundamentalna dla prawidłowego formowania się wszystkich struktur zawierających komponenty pochodzące z NCC tułowia ³. Wyjaśnienie mechanizmów kierowania migracją NCC tułowia miało zatem ogromne znaczenie. Wykazano, że liczne cząsteczki kierują migracją NCC ⁴. Na przykład wiadomo, że NCC tułowia są odpychane przez negatywne sygnały kierujące, takie jak ligandy semaforyny, efryny i slit ^5-8. Jednak dopiero niedawno zidentyfikowano chemoatraktanty NCC tułowia ⁹.

Konwencjonalne podejścia in vitro do badania zachowań chemotaktycznych komórek adherentnych sprawdzają się najlepiej w przypadku komórek unieśmiertelnionych, rozmieszczonych homogenicznie, jednak są trudniejsze do zastosowania w określonych kulturach pierwotnych komórek macierzystych, które początkowo nie wykazują homogennego rozkładu i szybko ulegają różnicowaniu (tak jak NCC). Jedną z metod homogenizacji rozkładu NCC z tułowia na potrzeby badań chemotaksji jest izolacja NCC z tułowia z pierwotnych kultur eksplantów NT, a następnie ich odklejenie i ponowne wysianie tak, aby osiągnęły niemal 100% konfluencji. Jednak to podejście do wysiewania wymaga znacznych nakładów czasu i pracy w celu wyizolowania odpowiedniej liczby komórek, jest agresywne i powoduje rozmieszczenie NCC z tułowia w sposób odmienny od warunków występujących in vivo.

W niniejszej pracy opisujemy metodę in vitro umożliwiającą ocenę chemotaksji oraz innych reakcji migracyjnych komórek grzebienia neuronalnego (NCC) tułowia bez konieczności zapewnienia jednorodnego rozkładu komórek. Technika ta wykorzystuje obrazowanie time-lapse pierwotnych, niezakłóconych NCC tułowia w zmodyfikowanej komorze Zigmonda (standardowa komora Zigmonda została opisana w innym opracowaniu¹⁰). Poprzez wystawienie NCC tułowia znajdujących się na obrzeżach hodowli na gradient chemotaktyczny prostopadły do ich przewidywanego naturalnego kierunku ruchu, można wykryć zmiany w polarności migracji indukowane zastosowanym gradientem chemotaktycznym. Metoda ta jest niedroga, wymaga hodowli tylko dwóch eksplantów z cewy nerwowej (NT) na każdą powtórkę traktowania, pozwala uniknąć agresywnego odrywania komórek (takiego jak trypsynizacja), pozostawia NCC tułowia w rozkładzie bardziej zbliżonym do warunków in vivo, skraca czas między eksplantacją a eksperymentem (co prawdopodobnie zmniejsza ryzyko różnicowania) oraz umożliwia ocenę wielu cech migracyjnych w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Dzień 1: Izolacja rurek neuralnych tułowia do hodowli nocnej na szkiełkach nakrywkowych

1. Inkubować jaja kurze przez 56 h w temperaturze 38° CWyjąć jaja z inkubatora, delikatnie spryskać je 70% etanolem, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Rozbić jaja do szklanej tacy wysterylizowanej promieniami UV.
2. Wyjmij każdy embrion z żółtka i umieść go w roztworze Ringera dla kurcząt. W tym celu najpierw przetnij obszar wokół wysp krwi za pomocą zakrzywionych nożyczek, a następnie, używając pęsety tępej, chwyć embrion za błonę pozazarodkową i przenieś go do sterylnej plastikowej szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera dla kurcząt.
3. Wyizoluj tułów każdego zarodka, odcinając nadmiar błon pozazarodkowych oraz poziomy osiowe głowowe, błędne i krzyżowe za pomocą igły wolframowej (Rys. 1). Najpierw wybierz około 9 zarodków znajdujących się w stadiach HH15-17. ¹¹Dla stadiów od HH15 w górę osie przedmózgowia i rombencephalonu tworzą kąt ostry, przez co głowa wydaje się być pochylona kudalnie. W stadium HH17 obecny jest pączek ogonowy, który jest pochylony brzusznie, lecz nie zawiera jeszcze somytów. Za pomocą igły wolframowej przytnąć błony pozazarodkowe do odległości około 2 mm od zarodka i wyciąć wszelkie tkanki zarodkowe przed somytem 10. Należy również usunąć wszystkie kudalne tkanki zarodkowe, zaczynając od okolic piątego z nowo powstałych somytów.
4. Umieść wyizolowane tułowia embrionalne w dyspazie (0,24 U/ml DMEM) i inkubuj je przez 1 h 15 min w temperaturze 37° C oraz 5% CO2₂Gdy pnie zostaną poddane inkubacji, należy rozpocząć przygotowanie 6 szkiełek zakrywkowych (CS) do hodowli eksplantów NT (kroki 1.5–1.8).
5. Przepłucz 6 CS w 70% etanolu (rozcieńczonego w sterylnej wodzie ultrapure), a następnie pozostaw je do wyschnięcia. Za pomocą markera laboratoryjnego narysuj na środku każdego CS okrąg o średnicy około 1 cm (okrąg ten pomoże później zidentyfikować miejsce naniesienia warstwy fibronektyny). Na tej samej stronie każdego CS napisz słowo „be” (lub inne asymetryczne słowo bądź symbol) poza narysowanym okręgiem (ułatwi to zidentyfikowanie, czy zaznaczona strona CS jest skierowana do góry, czy do dołu).
6. Umieść każdy plasterek CS w oddzielnej sterylnej szalce o wymiarach 40 x 10 mm, stroną z oznakowaniem skierowaną w dół, a następnie pozostaw otwartą szalkę pod bakteriobójczą lampą UV na 10 min.
7. Zastosuj 60 μl fibonektyna (FN; 10 μg/ml DMEM) na nieoznaczoną powierzchnię CS, upewniając się, że cały obszar w obrębie okręgu o średnicy 1 cm został pokryty. Płytki należy inkubować w 37° C przez 30 min, a następnie ostrożnie odessać fibronektynę z każdej komory hodowlanej (CS).
8. Dodaj 250 μl pożywkę hodowlaną [DMEM z L-glutaminą (2 mM), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 mcg/ml) i 8% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)] na obszar CS pokryty FN. Umieść naczynia zawierające każdy CS w 37° C oraz 5% CO2₂ ponownie, aż do czasu wyizolowania NT.
9. Przenieś wszystkie inkubowane tułowie zarodków do jednej szklanej szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej pożywkę L15 i rozpocznij wycinanie każdej rurki neuralnej (NT), używając precyzyjnej pęsety i igły wolframowej (Ryc. 1). Ostrożnie nacinaj wzdłuż granicy rurki neuralnej i somytów za pomocą ostrej igły wolframowej, uważając, aby nie uszkodzić NT. Często łatwiej jest rozpocząć izolację każdej rurki neuralnej od najbardziej ogonowego końca tułowia.
10. Wybierz 6 najprostszych i najdłuższych cewek nerwowych (NT) do inkubacji przez noc (zalecane są NT o długości od około 8 do 15 somytów). Używając końcówki mikropipety przygotowanej za pomocą hodowla pożywkę, przenieść każdą z 6 NT do osobnego, wcześniej przygotowanego CS (zgodnie z krokami od 1.5 do 1.8). Należy upewnić się, że NT nie pozostaje na powierzchni. Jeśli NT pływa, należy za pomocą mikropipety zakraplać na nie pożywkę, aż zatonie.
11. Umieść każdą płytkę w 37° C oraz 5% CO2₂ przez noc. Należy upewnić się, że każda NT znajduje się w obszarze pokrytym FN na odpowiednim CS bezpośrednio przed umieszczeniem naczynia w inkubatorze (korzystając z okręgu narysowanego w kroku 1.5 jako punktu odniesienia). W razie potrzeby można użyć mikropipety, aby dokładniej skorygować położenie każdej NT.
12. Przenieś co najmniej 2 ml hodowla pożywkę (bez surowicy) do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 ml i inkubować przez noc w temperaturze 37° C oraz 5% CO2₂Pozostaw zakrętkę lekko odkręconą, aby pH medium mogło ustabilizować się w ciągu nocy. Preinkubacja medium jest istotna, ponieważ pomaga zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorze, co mogłoby zakłócić ustanowienie gradientu molekularnego. Takie „preinkubowane” medium należy stosować we wszystkich kolejnych etapach. Gdy medium nie jest używane, powinno być inkubowane w 37° C.

2. Dzień 2: Załadowanie zmodyfikowanej komory Zigmonda i analiza migracji komórek w trybie time-lapse

1. Z 6 hodowanych NT wybierz 3 hodowle najlepiej nadające się do analizy. Zazwyczaj należy wybierać hodowle NCC, które mają przynajmniej jedną długą, prostą krawędź (Ryc. 2A). Trzy najlepsze hodowle zostaną wykorzystane do załadowania i filmowania w trzech zmodyfikowanych komorach Zigmonda w ciągu dnia, z których każda będzie poddana innemu działaniu. Z tych 3 hodowli wybierz jedną do załadowania do pierwszej komory, a pozostałe zwróć do inkubatora do późniejszego użycia.
2. Za pomocą patyczka higienicznego nałóż cienką, równomierną warstwę wazeliny wokół zbiorników i mostka jednej zmodyfikowanej komory Zigmonda.
3. Za pomocą igły wolframowej delikatnie usuń NT z CS, pozostawiając otaczające NCC przytwierdzone do powierzchni CS. Zaznacz naczynie pisakiem, aby zapamiętać orientację najprostszej krawędzi hodowli NCC.
4. Nanieś kilka kropli preinkubowanego medium na mostek. Chwyć CS precyzyjną pęsetą, osusz krawędź CS o chusteczkę Kimwipe, aby usunąć większość starego medium hodowlanego, a następnie natychmiast umieść CS na zmodyfikowanej komorze Zigmonda tak, aby prosta krawędź hodowli przeznaczonej do filmowania była wyśrodkowana wzdłuż mostka i znajdowała się mniej więcej prostopadle do granicy mostek-zbiornik (Ryc. 2A,B).
5. Używając mikroskopu odwróconego, przesuń prostą granicę NCC tak, aby znajdowała się po stronie mostka najbliższej zbiornika, który będzie zawierać domniemany chemotaktykant (Ryc. 2B; w przypadku kontroli będzie to zbiornik załadowany jako drugi). Następnie precyzyjniej ustaw prostą krawędź hodowli prostopadle do granicy mostek-zbiornik.
6. Ostrożnie, ale pewnie dociśnij CS do wazeliny znajdującej się na komorze Zigmonda, upewniając się, że jest on całkowicie uszczelniony z komorą, a następnie nałóż dodatkową wazelinę wzdłuż krawędzi CS, aby dodatkowo zapewnić szczelność powietrzną. Ponownie precyzyjnie skoryguj kąt granicy NCC, aby zniwelować ewentualne przesunięcia podczas procesu uszczelniania.
7. Najpierw załaduj zbiornik, który nie będzie zawierał domniemanego chemotaktykantu (Ryc. 2B). Zrób to, nabierając do strzykawki 1 ml (z dołączoną igłą 25 G x 1,5 in.) około 300 μl preinkubowanego medium i wstrzykując je do zbiornika, aż zostanie on wypełniony (uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza w zbiorniku). Przed załadowaniem następnego zbiornika szczelnie zamknij zbiornik po obu stronach odpowiednią ilością wazeliny.
8. Powtórz krok 2.7, korzystając tym razem z preinkubowanego medium zawierającego kandydujący chemotaktykant. Podczas tworzenia gradientu molekularnego w poprzek hodowli kluczowe jest, aby zbiornik zawierający badaną cząsteczkę zawsze ładować po załadowaniu zbiornika pozbawionego badanej cząsteczki.
9. Umieść załadowaną komorę Zigmonda w temperaturze 37° C i inkubuj przez 1 h przed filmowaniem. Obrazuj najprostszą granicę hodowli NCC przez 3 h w odstępach 90 s, inkubując w temperaturze około 37° C (Ryc. 2A,B). Przed utworzeniem filmu upewnij się, że kamera jest ustawiona tak, aby krawędzie uzyskiwanych obrazów były wyrównane i stykały się z krawędzią mostka graniczącą z ostatnim załadowanym zbiornikiem (Ryc. 2B, panel górny; przerywana ramka przedstawia idealną pozycję do obrazowania). Ułatwi to późniejszą analizę programową poprzez standaryzację kierunkowości zastosowanego gradientu molekularnego oraz odległości od filmowanego zbiornika w każdym wygenerowanym filmie.
10. W przypadku kontroli powtórz kroki 2.2–2.9 dla każdej z dwóch pozostałych wybranych hodowli NCC (w kroku 2.1), ale wypełnij każdy zbiornik odpowiednim medium. W jednym typie kontroli wypełnij oba zbiorniki preinkubowanym medium nie zawierającym badanej cząsteczki. W drugim wariancie kontrolnym przed zamontowaniem CS nasyć mostek kilkoma kroplami preinkubowanego medium zawierającego domniemany chemotaktykant. Następnie wypełnij oba zbiorniki tym samym medium zawierającym domniemany chemotaktykant.
11. Użyj wtyczek Manual Tracking (rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) oraz Chemotaxis and Migration Tool v1.01 (www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html) w programie ImageJ (NIH), aby śledzić migrację peryferyjnych NCC wzdłuż prostej granicy właśnie obrazowanej hodowli oraz analizować różne parametry uzyskanych trajektorii migracyjnych (Ryc. 2B-C).

3. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiono przykładowe trajektorie komórek z filmu, w którym wiele NCC pnia reagowało na kandydujący chemoatraktant z zastosowaniem powyższej techniki (Ryc. 2D). Większość komórek w tym przykładzie odpowiedzi dodatniej wykazała wypadkowy ruch w górę gradientu chemoatraktanta (zaznaczono na czerwono). Dane dotyczące trajektorii mogą być wykorzystane również do analizy innych właściwości migracji komórek.

W celu wizualnej oceny zastosowanego gradientu w zmodyfikowanej komorze Zigmonda, do drugiego zbiornika zmodyfikowanej komory Zigmonda wprowadzono koniugat Alexa Fluor 488 IgM (MW ~ 900 kDa) (w stężeniu około 40 μg/ml H₂O). Gradient został ustanowiony po 1 h i był nadal częściowo obecny po 26 h, jednak uległ znacznemu osłabieniu do 50 h (Rys. 3). Jeśli badana cząsteczka jest mniejsza, zastosowany gradient będzie degradować szybciej niż pokazano.

Rycina 1. Eksplantacja NT na poziomie tułowia do inkubacji nocnej na szkiełkach podstawkowych powlekanych fibronektyną. Ponieważ NCC tułowia oddzielają się od grzbietowej części NT zlokalizowanej sąsiadująco z somytami 8-28, ten segment NT jest izolowany poprzez mikrosekcję i hodowany przez noc na powlekanym fibronektyną CS, aby umożliwić emigrację NCC z eksplantu NT. Do inkubacji nocnej najlepiej nadają się izolowane NT o długości od 8 do 15 somytów i stosunkowo prostym kształcie, ponieważ mają one tendencję do tworzenia kultur NCC z dłuższymi, prostymi krawędziami. Regiony cewy nerwowej, z których powstają inne osiowe poziomy grzebienia nerwowego, zaznaczono mniejszą czcionką. s, somyt.

Rycina 2. Metoda oceny migracji eksplantowanych NCC tułowia przy użyciu zmodyfikowanej komory Zigmonda. (A) Wydłużone hodowle NCC tułowia są przygotowywane poprzez nocną inkubację NT; do eksperymentów wybierane są hodowle NCC posiadające co najmniej jedną długą, prostą krawędź. Najdłuższą prostą krawędź wybranej hodowli ustawia się prostopadle do krawędzi mostka-zbiornika, a zatem równolegle do wektora przyszłego gradientu. (B) Po precyzyjnym ustawieniu pozycji hodowli NCC w komorze Zigmonda i przytwierdzeniu szkiełka podstawowego do komory, następuje napełnienie komory. Podczas badania chemotaksji, w pierwszej kolejności napełniany i zamykany jest zbiornik, który nie będzie zawierał podejrzewanego chemotaktyka (-). Następnie drugi zbiornik jest napełniany podejrzewanym chemotaktykiem (+) i zamykany. Obwodowe NCC wzdłuż wcześniej wybranej krawędzi mogą być następnie obrazowane i śledzone przy użyciu wtyczki Manual Tracking do programu ImageJ (dolny panel). (C) Na podstawie danych z trackingu można ocenić liczne cechy migracyjne w odpowiedzi na zastosowany gradient. Na przykład indeks chemotaksji można wyznaczyć, dzieląc przemieszczenie komórki wzdłuż osi x przez całkowity dystans, jaki przebyła. (D) Przykład odpowiedzi przyciągającej przedstawia wykres trajektorii komórek wygenerowany początkowo przez wtyczkę Chemotaxis and Migration Tool do programu ImageJ. Punkt startowy każdej trajektorii jest ustawiony w punkcie początkowym (0,0). Zauważmy, że znacznie więcej komórek migruje w stronę źródła chemoatraktanta. Środek masy wszystkich komórek w ich końcowej pozycji (niebieski krzyżyk; wszystkie komórki o równej wadze) znajduje się również bliżej źródła chemoatraktanta. NCC, komórki grzebienia neuronalnego; czerwone ścieżki, komórki, które migrowały w stronę zbiornika z podejrzewanym chemoatraktantem; czarne ścieżki, komórki, które migrowały w przeciwnym kierunku; (+), wyższe stężenie chemotaktyka; (-), niższe stężenie chemotaktyka.

Rysunek 3. Profile intensywności w poprzek mostka zmodyfikowanej komory Zigmonda w różnych odstępach czasu po dodaniu koniugatu Alexa Fluor 488 IgM. Komorę załadowano w sposób analogiczny do opisanego w protokole, z głównym wyjątkiem polegającym na zastosowaniu wody wstępnie inkubowanej (zamiast preinkubowane podłoża) użyto do rozcieńczenia przeciwciała do 40 μg/ml, a na końcach mostka (z dala od przekroju, z którego pobrano powyższe profile intensywności) występowały niewielkie pęcherzyki powietrza. Początkowo w większości obszaru mostka nie występował gradient. Po 1 h gradient został ustanowiony i utrzymywał się aż do 26 h. Po 50 h występowanie gradientu było niespójne w różnych obszarach mostka, a w miejscach, w których występował, jego nachylenie było znacznie mniejsze. Wszystkie profile zostały wygenerowane z identycznego przekroju mostka (od jednej do drugiej granicy mostka i rezerwuaru) przy użyciu oprogramowania AxioVision 4.6. Należy zauważyć, że gradient nie został zaburzony nawet w obecności pęcherzyków powietrza. High – wysoka intensywność; Low – niska intensywność; oś x – odległość w obrębie całej szerokości mostka (2 mm); (+), rezerwuar wypełniony koniugatem Alexa Fluor 488 IgM; (-), rezerwuar nie załadowany koniugatem.

Rysunek 4. Specyfikacje zmodyfikowanej komory Zigmonda. Przedstawiono schemat zmodyfikowanej komory Zigmonda wykorzystanej w tej pracy wraz z jej specyfikacją wymiarową (±0.2 mm). Pomiary mogą być umiarkowanie dostosowane do indywidualnych preferencji.

Protokół uzupełniający: Wykonanie zmodyfikowanej komory Zigmonda

W poniższym protokole należy kierować się Rysunkiem 4:

1. Należy zakupić arkusz polerowanego akrylu o grubości 3/16″ (rzeczywista grubość 4,45 mm).
2. Za pomocą piły stołowej należy wyciąć klocki komory w nadmiarowych wymiarach orientacyjnych 33,25 mm x 64,57 mm. Zapewnia to 3,175 mm dodatkowego materiału do obróbki.
3. Klocek komory należy umieścić w imadle. Za pomocą frezarki i frezu palcowego 6,35 mm (1/4″) należy wyfrezować boki komory do dokładnych wymiarów: 30,07 mm x 61,39 mm.
4. Należy ustawić klocek komory na frezarce i zlokalizować środek klocka wzdłuż osi x i y za pomocą poszukiwacza krawędzi, a następnie wyzerować pozycję środka.
5. Wysokość komory (oś z) należy wyznaczyć poprzez dotknięcie wierzchołkiem frezu powierzchni górnej i wyzerowanie wysokości.
6. Używając frezu palcowego 3,91 mm (0,154″), należy przesunąć frez o 3,03 mm wzdłuż osi x (kierunek dodatni) dla pierwszego zbiornika. Należy rozpocząć frezowanie w komorze do głębokości 2,84 mm, poruszając się wzdłuż osi y (kierunek dodatni) do 7,62 mm (0,300″), a następnie przejść o 7,62 mm (0,300″) w przeciwnym (ujemnym) kierunku, aż do całkowitej długości zbiornika 15,24 mm (0,600″). Następnie należy przesunąć frez o 3,03 mm (0,119″) wzdłuż osi x (kierunek ujemny) i powtórzyć tę samą procedurę dla drugiego zbiornika.
7. Ustawiając komorę krawędzią do góry, należy wywiercić otwór wiertłem 1,09 mm (0,043 in.) na końcach każdego zbiornika (łącznie 4 otwory), co połączy koniec zbiornika z bokiem komory w celu wprowadzania medium podczas eksperymentu.
8. Komorę należy dokładnie namoczyć w ciepłej wodzie z mydłem, aby pomóc w usunięciu zanieczyszczeń chemicznych.
9. Komorę należy dokładnie namoczyć i wypłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej, aby usunąć resztki mydła. Komory są teraz gotowe do użycia zgodnie z powyższym opisem.

Dyskusja

Prowadzenie badań nad chemotaksją komórek NCC tułowia okazało się trudne z kilku powodów. Komórki NCC tułowia stanowią heterogenną populację komórek macierzystych, które różnicują się podczas długotrwałej hodowli; w związku z tym komórki NCC tułowia muszą być pozyskiwane poprzez pierwotną eksplantację rurki neuralnej (NT) na poziomie tułowia. Konwencjonalne metody badania odpowiedzi chemotaktycznej homogenicznie rozłożonych populacji komórek in vitro są trudne do zastosowania w przypadku komórek NCC tułowia, pon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Omega Scientific	PS-20	stężenie roztworu stokowego 100X
L-glutamina	Omega Scientific	GS-60	stężenie roztworu stokowego 100X
Płodowa surowica bydlęca	Omega Scientific	FB-11	Partia# 105247 (lub inna porównywalna)
Modyfikowana komora Zigmonda	Własny wyrób	N/A	Objętość zbiornika: ~ 160 μl każdy; dodatkowe specyfikacje znajdują się na Rys. 4 oraz w uzupełniającym protokole wykonania
Szalka do hodowli komórek	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronektyna	BD	354008	Roztwór stokowy 10X przygotowany przez rozcieńczenie 1 mg FN w 1 ml H2O i 9 ml DMEM
Kryszalki	Fisher	12-548-B	Oczyszczone wstępnie; 22 x 22 mm
Pożywka L15	Thermo Scientific	SH30525.02
Wazelina	Comforts	011110794642	100%
Probówka do wirowania	Biologix	10-9152	15 ml
Dyspaza	Cell Systems	4Z0-850	stężenie roztworu stokowego 10X
Strzykawka	BD	309602	1 ml
Igła	BD	305127	25 G x 1,5 cala
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stężenie roztworu stokowego wynosi 2 mg/ml; 7 moli barwnika/mol IgM
Pinceta anatomiczna	FST	Różne	Dumont #5 lub 55; proste końcówki; stal nierdzewna lub tytan
Igła wolframowa	N/A	N/A	Własny wyrób; umieszczona w uchwycie
Pinceta tępa	Tiemann	160-18	Stosowana do przenoszenia embrionów z żółtka jaja do roztworu Ringera
Protokół uzupełniający: Wykonanie modyfikowanej komory Zigmonda
W poniższym protokole należy kierować się Rysunkiem 4:
Należy zakupić arkusz polerowanego akrylu o grubości 3/16" (rzeczywista grubość 4,45 mm). Za pomocą piły stołowej należy wyciąć klocki na komorę o wymiarach większych niż docelowe, tj. około 33,25 mm x 64,57 mm. Pozwala to na zachowanie 3,175 mm zapasu materiału do obróbki. Klocek na komorę należy zamocować w imadle. Używając frezarki i frezu czołowego 6,35 mm (1/4"), należy wyfrezować boki komory do dokładnych wymiarów: 30,07 mm x 61,39 mm. Klocek na komorę należy ustawić na frezarce i wyznaczyć środek klocka wzdłuż osi x i y za pomocą czujnika krawędzi, a następnie ustawić zero w punkcie środkowym. Wysokość komory (oś z) należy wyznaczyć, dotykając frezem górnej powierzchni, a następnie ustawić zero wysokości. Używając frezu czołowego 3,91 mm (0,154"), należy przesunąć frez o 3,03 mm wzdłuż osi x (kierunek dodatni) dla pierwszego zbiornika. Rozpocząć frezowanie komory na głębokość 2,84 mm, poruszając się wzdłuż osi y (kierunek dodatni) do 7,62 mm (0,300"), a następnie przesunąć się do 7,62 mm (0,300") w kierunku przeciwnym (ujemnym), aby uzyskać całkowitą długość zbiornika 15,24 mm (0,600"). Przesunąć frez o 3,03 mm (0,119") wzdłuż osi x (kierunek ujemny) i powtórzyć ten sam proces dla drugiego zbiornika. Ustawiając komorę krawędzią, należy wywiercić otwór za pomocą wiertła 1,09 mm (0,043 cala) na końcu każdego zbiornika (łącznie 4 otwory), co połączy koniec zbiornika z bokiem komory w celu wprowadzania pożywki podczas eksperymentu. Komorę należy dokładnie namoczyć w ciepłej wodzie z mydłem, aby pomóc w usunięciu zanieczyszczeń chemicznych. Komorę należy dokładnie namoczyć i wypłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej, aby usunąć resztki mydła. Komory są teraz gotowe do użycia zgodnie z powyższym opisem.