Analiza migracji komórek grzebienia nerwowego tułowia przy użyciu zmodyfikowanego testu komory Zigmonda

Summary

Opisano podejście do analizy migracji eksplantowanych komórek (komórek grzebienia nerwowego tułowia). Ta metoda jest niedroga, delikatna i zdolna do odróżnienia chemotaksji zarówno od chemokinezy, jak i innych wpływów na polarność migracyjną, takich jak te pochodzące z interakcji komórka-komórka w obrębie hodowli komórek grzebienia nerwowego pierwotnego tułowia.

Abstract

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to przejściowa populacja komórek obecnych w rozwoju kręgowców, które emigrują z grzbietowej cewy nerwowej (NT) po przejściu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnym ^1,2. Podążając za EMT, NCC migrują na duże odległości wzdłuż stereotypowych ścieżek, aż osiągną swoje cele. NCC różnicują się w szeroką gamę typów komórek, w tym neurony, glej, melanocyty i komórki chromochłonne ^1-3. Zdolność NCC do dotarcia i rozpoznania ich właściwych lokalizacji docelowych ma fundamentalne znaczenie dla prawidłowego tworzenia wszystkich struktur zawierających składniki pochodzące z NCC ³. Wyjaśnienie mechanizmów naprowadzania na migrację NCC było zatem sprawą o dużym znaczeniu. Wykazano, że liczne cząsteczki kierują migracją NCC ⁴. Na przykład NCC tułowia są znane z tego, że są odpychane przez negatywne sygnały naprowadzające, takie jak semaforyna, efryna i ligandy szczelinowe ^5-8. Jednak dopiero do niedawna nie zidentyfikowano żadnych chemoatraktantów NCC pnia ⁹.

Konwencjonalne podejścia in vitro do badania chemotaktycznego zachowania przylegających komórek działają najlepiej z unieśmiertelnionymi, jednorodnie rozmieszczonymi komórkami, ale są trudniejsze do zastosowania w niektórych pierwotnych hodowlach komórek macierzystych, które początkowo nie mają jednorodnego rozmieszczenia i szybko się różnicują (takie jak NCC). Jednym ze podejść do homogenizacji dystrybucji NCC pnia do badań chemotaksji jest wyizolowanie NCC pnia z pierwotnych kultur eksplantatów NT, a następnie podniesienie i ponowne platerowanie ich tak, aby były prawie w 100% zlewne. Jednak to podejście do posiewu wymaga znacznej ilości czasu i wysiłku, aby eksplantować wystarczającą liczbę komórek, jest surowe i rozprowadza NCC tułowia w sposób niepodobny do tego, który występuje w warunkach in vivo.

Tutaj opisujemy podejście in vitro, które jest w stanie ocenić chemotaksję i inne reakcje migracyjne NCC tułowia bez konieczności jednorodnego rozmieszczenia komórek. Technika ta wykorzystuje obrazowanie poklatkowe pierwotnych, niezakłóconych NCC tułowia wewnątrz zmodyfikowanej komory Zigmonda (standardowa komora Zigmonda jest opisana w innym miejscu¹⁰). Poprzez wystawienie NCC tułowia na obrzeżach kultury na gradient chemotakaktu, który jest prostopadły do ich przewidywanej naturalnej kierunkowości, można wykryć zmiany w polarności migracji wywołane zastosowanym gradientem chemotaktonu. Technika ta jest niedroga, wymaga hodowli tylko dwóch eksplantatów NT na powtórzony zabieg, pozwala uniknąć ostrego podnoszenia komórek (takiego jak trypsynazacja), pozostawia NCC pnia w bardziej podobnym rozmieszczeniu do warunków in vivo, skraca czas między eksplantacją a eksperymentami (co prawdopodobnie zmniejsza ryzyko różnicowania) i umożliwia ocenę poklatkową wielu cech migracyjnych.

Protocol

1. Dzień 1: Izolacja cew nerwowych tułowia do nocnego posiewu na szkiełkach nakrywkowych

1. Inkubować jaja piskląt przez 56 godzin w temperaturze 38°C. Usunąć jaja z inkubacji, delikatnie spryskać je 70% etanolem, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Rozbij jajka na szklanej tacy wysterylizowanej promieniami UV.
2. Wyjmij każdy zarodek z żółtka i umieść go w pisklątku Ringera. Zrób to, najpierw przecinając jego wyspy krwi zakrzywionymi nożyczkami; następnie kleszczami podnieś zarodek za błonę pozazarodkową i umieść go na sterylnej plastikowej szalce Petriego zawierającej roztwór Ringera dla piskląt.
3. Odizoluj pień każdego zarodka, odcinając ....

Discussion

Prowadzenie badań nad chemotaksją NCC tułowia okazało się wyzwaniem z wielu powodów. NCC tułowia stanowią niejednorodną populację komórek macierzystych, które różnicują się, jeśli są hodowane przez długi czas; w związku z tym NCC tułowia muszą być uzyskane z pierwotnej eksplantacji NT na poziomie pnia. Konwencjonalne metody badania odpowiedzi chemotaktycznej jednorodnie rozmieszczonych populacji komórek in vitro są trudne do przetestowania na NCC tułowia, ponieważ najpierw wymagają izolacji komórek i jednorodneg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicylina Streptomycyna Roztwór	Omega Scientific	PS-20	100X Stężenie zapasowe
L-glutamina	Omega Scientific	GS-60	100X Stężenie zapasowe
Surowica bydlęca	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (lub inna, która jest porównywalna)
Zmodyfikowana komora Zigmond	Domowa	N/A	Objętość zbiornika: ~ 160 μ l ea; dodatkowe specyfikacje znajdują się na rys. 4 i w dodatkowym protokole produkcyjnym
Naczynie do hodowli komórkowych	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Bulion przygotowany przez rozcieńczenie 1 mg FN w 1 ml H2O i 9 ml DMEM
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-548-B	Wstępnie oczyszczone; 22 x 22 mm
L15 średni	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
probówka wirówkowa	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Strzykawka o stężeniu zapasowym
	BD	309602	1 ml
Igła	BD	305127	25 G x 1,5 cala.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Zapas wynosi 2 mg/ml; 7 moli barwnika/mol IgM
Kleszcze preparacyjne	FST	Misc.Dumont	#5 lub 55; z prostą końcówką; stal nierdzewna lub tytan
Igła wolframowa	N/A	/A	Domowej roboty; umieszczona w uchwycie na szpilki
Kleszcze	Tiemann	160-18	Służy do przenoszenia zarodków do Ringera z żółtka jaja kurzego
Protokół dodatkowy: Produkcja zmodyfikowanej komory Zigmonda
Proszę zapoznać się z Rysunkiem 4 jako odniesieniem do poniższego protokołu:
Kup arkusz polerowanego akrylu o grubości 3/16" (rzeczywista grubość 4,45 mm). Za pomocą piły stołowej, Cięcie półfabrykatów komorowych ponadwymiarowych do przybliżonych wymiarów 33,25 mm x 64,57 mm. Pozwala to na uzyskanie 3,175 mm dodatkowego materiału do obróbki. Ustaw półfabrykat komory na imadle. Za pomocą frezarki i frezu palcowego 6,35 mm (1/4") zakończ obróbkę boków komory do ich dokładnych wymiarów: 30,07 mm x 61,39 mm. Ustaw półfabrykat komory na frezarce i zlokalizuj środek półfabrykatu wzdłuż osi x i y za pomocą szukacza krawędzi; następnie wyzeruj środkową lokalizację. Uzyskaj wysokość komory (oś z), dotykając wiertła frezu palcowego do górnej powierzchni i zeruj wysokość. Używając wiertła do frezów palcowych 3,91 mm (0,154"), przesuń wiertło o 3,03 mm wzdłuż osi x (kierunek dodatni) dla pierwszego zbiornika. Rozpocznij obróbkę w komorze na głębokość 2,84 mm, przesuwając się wzdłuż osi y (kierunek dodatni) do 7,62 mm (0,300"), a następnie przesuń do 7,62 mm (0,300") w przeciwnym (ujemnym) kierunku do pełnej długości zbiornika 15,24 mm (0,600"). Przesuń wiertło na 3,03 mm (0,119") wzdłuż osi x (kierunek ujemny) i powtórz ten sam proces dla drugiego zbiornika. Ustaw komorę na jej krawędzi i wywierć otwór za pomocą wiertła 1,09 mm (0,043 cala) na końcu każdego zbiornika (łącznie 4), który łączy koniec zbiornika z bokiem komory w celu załadowania medium podczas eksperymentowania. Dobrze namocz komorę w ciepłej wodzie z mydłem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia chemiczne. Namocz i dobrze wypłucz komorę w wodzie podwójnie destylowanej, aby usunąć mydło. Komory są teraz gotowe do użycia, jak opisano powyżej.