Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy funkcjonalne od dawna odgrywają kluczową rolę w pomiarze immunogenności danej szczepionki. Konwencjonalnie wyraża się to poprzez miana bakteriobójcze surowicy. Badania mian bakteriobójczych surowicy w odpowiedzi na szczepionki dziecięce pozwoliły na opracowanie i walidację poziomów odcięcia dla ochronnych odpowiedzi immunologicznych, a takie wartości progowe są obecnie stosowane w rutynowej praktyce. Żadne podobne testy nie zostały wprowadzone do rutynowej oceny szczepionek, które indukują przede wszystkim odporność komórkową w formie odpowiedzi efektorowych limfocytów T, takich jak szczepionki przeciwko gruźlicy. W modelu zwierzęcym skuteczność kandydata na szczepionkę jest rutynowo oceniana w ustandaryzowanych testach bakteriobójczych, a wszystkie obecne nowe kandydatki na szczepionki przeciwko gruLikewise gruźlicy zostały poddane temu etapowi oceny przed rozpoczęciem I fazy badań klinicznych z udziałem ludzi. Ocena immunogenności, a tym samym prawdopodobieństwa skuteczności ochronnej nowych szczepionek przeciwgruźliczych, powinna obecnie idealnie przechodzić podobną wieloetapową ewaluację w modelach ludzkich, w tym pomiary w testach bakteriobójczych.
Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są już dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności. Jednak do tej pory żadne tego typu testy nie zostały włączone do badań klinicznych nowych szczepionek przeciwgruźliczych.
Mimo że nadal nie ma pewności co do dokładnych mechanizmów prowadzących do zabijania prątków wewnątrz ludzkich makrofagów, interakcja makrofagów i limfocytów T z prątkami jest ewidentnie niezbędna. Test opisany w niniejszej pracy reprezentuje nową generację testów bakteriobójczych, która umożliwia badanie tych kluczowych komponentów komórkowych w obecności wszystkich pozostałych czynników komórkowych i humoralnych występujących w krwi pełnej, bez konieczności przyjmowania założeń dotyczących ich względnego indywidualnego wkładu. Test opracowany przez naszą grupę wykorzystuje niewielkie objętości krwi pełnej i został już zastosowany w badaniach nad osobami dorosłymi i dziećmi w regionach endemicznych dla gruźlicy. Wykazaliśmy immunogenność szczepionki BCG, zwiększony wzrost prątków u pacjentów z dodatnim wynikiem w kierunku HIV, a także wpływ terapii antyretrowirusowej i witaminy D na przeżywalność prątków in vitro. W niniejszym opracowaniu podsumowujemy metodologię i przedstawiamy dane dotyczące powtarzalności tego stosunkowo prostego, niskokosztowego i łatwego do zastosowania w warunkach terenowych modelu.
Uwaga: Definicje/Skróty
BCG lux = M. bovis BCG, szczep Montreal, transformowany plazmidem wahadłowym pSMT1 niosącym geny luxAB z Vibrio harveyi, pod kontrolą prątkowego promotora GroEL (hsp60).
CFU = jednostka tworząca kolonię (miara żywotności prątków).
Protokół
1. Przygotowanie zapasu bakterii prątkowych BCG z reporterem lux
- Hodowla BCG luks (M. bovis szczep BCG Montreal przekształcony plazmidem wahadłowym pSMT1) przy wstrząsaniu z prędkością 20 obr./min do środkowej fazy logarytmicznej w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 i 10% wzbogacenia ADC.
- Przygotuj 1 ml rozcieńczenia BCG w stosunku 1:10 luks hodowlę w sterylnym PBS w probówce do lumnometru (900μl PBS + 100μl BCG luks hodowlę) w dublecie.
- Włożyć probówkę zawierającą aldehyd N-decylowy (substrat enzymu lucyferazy) do tylnej części urządzenia i upewnić się, że po....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności.
Pierwsza generacja testów bakteriobójczych u ludzi została opracowana z wykorzystaniem wyłącznie makrofagów zainfekowanych M. tuberculosis. Głównym parametrem określającym przeżywalno.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana ze stypendiów osobistych przyznanych przez Wellcome Trust dla Beate Kampmann (056608, GRO77273).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BCG luks | Różne | Przykro mi, ale nie dostarczyłeś tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą chcesz przełożyć na język polski. | |
| agar Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | |
| bulion Middlebrook 7H9 | BD Biosciences | 271310 (500 g) | |
| Wzbogacanie na podłożu Middlebrook ADC | BD Biosciences | 212352 | |
| suplement Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycyna B | Grupa Roche | 10843555001 (20 ml) | |
| N-decyloaldehyd | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Etanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterylny PBS | Wewnętrzny | Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia. | |
| RPMI-1640 z L-glutaminą i 25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterylna woda destylowana | Wewnątrzpracowniane | Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia. | |
| Luminometr do probówek (wymagany port wstrzykiwania) | Berthold Technologies | ||
| Probówki do luminometru, 12 x 75 mm, z pyrexu, bez kołnierza | Corning | 99445-12 | |
| kolby Erlenmeyera z nakrętkami z filtrem, sterylne, z poliwęglanu, 250 ml | Corning | 2150329 | |
| Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer (z heparyną bez konserwantów) | BD Biosciences | 367676 | |
| probówki Falcon 50 ml, stożkowe | BD Biosciences | 352077 | |
| 7 ml polipropylenowe probówki bijou Sterilin na próbki | VWR international | 99445-12 | |
| pojemniki Sterilin Universal (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Kuleczki szklane o średnicy 2 mm | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| pipety 10 ml oraz kontroler pipet (pipette boy) | Dowolny dostawca | ||
| 1000μl i 200μpipety i końcówki z filtrem | Dowolny dostawca | ||
| dygestorium biologiczne klasy II | |||
| Lodówka (4°C)°C) | |||
| Wirówka | |||
| Platforma do wytrząsania (1800) do mieszania probówek | |||
| Inkubator z wytrząsarką orbitalną ustawiony na 37°C°pożywka do hodowli kultur bakteryjnych |
Bibliografia
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
