Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Podsumowanie

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Streszczenie

Testy funkcjonalne od dawna odgrywają kluczową rolę w pomiarze immunogenności danej szczepionki. Konwencjonalnie wyraża się to poprzez miana bakteriobójcze surowicy. Badania mian bakteriobójczych surowicy w odpowiedzi na szczepionki dziecięce pozwoliły na opracowanie i walidację poziomów odcięcia dla ochronnych odpowiedzi immunologicznych, a takie wartości progowe są obecnie stosowane w rutynowej praktyce. Żadne podobne testy nie zostały wprowadzone do rutynowej oceny szczepionek, które indukują przede wszystkim odporność komórkową w formie odpowiedzi efektorowych limfocytów T, takich jak szczepionki przeciwko gruźlicy. W modelu zwierzęcym skuteczność kandydata na szczepionkę jest rutynowo oceniana w ustandaryzowanych testach bakteriobójczych, a wszystkie obecne nowe kandydatki na szczepionki przeciwko gruLikewise gruźlicy zostały poddane temu etapowi oceny przed rozpoczęciem I fazy badań klinicznych z udziałem ludzi. Ocena immunogenności, a tym samym prawdopodobieństwa skuteczności ochronnej nowych szczepionek przeciwgruźliczych, powinna obecnie idealnie przechodzić podobną wieloetapową ewaluację w modelach ludzkich, w tym pomiary w testach bakteriobójczych.

Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są już dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności. Jednak do tej pory żadne tego typu testy nie zostały włączone do badań klinicznych nowych szczepionek przeciwgruźliczych.

Mimo że nadal nie ma pewności co do dokładnych mechanizmów prowadzących do zabijania prątków wewnątrz ludzkich makrofagów, interakcja makrofagów i limfocytów T z prątkami jest ewidentnie niezbędna. Test opisany w niniejszej pracy reprezentuje nową generację testów bakteriobójczych, która umożliwia badanie tych kluczowych komponentów komórkowych w obecności wszystkich pozostałych czynników komórkowych i humoralnych występujących w krwi pełnej, bez konieczności przyjmowania założeń dotyczących ich względnego indywidualnego wkładu. Test opracowany przez naszą grupę wykorzystuje niewielkie objętości krwi pełnej i został już zastosowany w badaniach nad osobami dorosłymi i dziećmi w regionach endemicznych dla gruźlicy. Wykazaliśmy immunogenność szczepionki BCG, zwiększony wzrost prątków u pacjentów z dodatnim wynikiem w kierunku HIV, a także wpływ terapii antyretrowirusowej i witaminy D na przeżywalność prątków in vitro. W niniejszym opracowaniu podsumowujemy metodologię i przedstawiamy dane dotyczące powtarzalności tego stosunkowo prostego, niskokosztowego i łatwego do zastosowania w warunkach terenowych modelu.

Uwaga: Definicje/Skróty

BCG lux = M. bovis BCG, szczep Montreal, transformowany plazmidem wahadłowym pSMT1 niosącym geny luxAB z Vibrio harveyi, pod kontrolą prątkowego promotora GroEL (hsp60).
CFU = jednostka tworząca kolonię (miara żywotności prątków).

Protokół

1. Przygotowanie zapasu bakterii prątkowych BCG z reporterem lux

1. Hodowla BCG luks (M. bovis szczep BCG Montreal przekształcony plazmidem wahadłowym pSMT1) przy wstrząsaniu z prędkością 20 obr./min do środkowej fazy logarytmicznej w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 i 10% wzbogacenia ADC.
2. Przygotuj 1 ml rozcieńczenia BCG w stosunku 1:10 luks hodowlę w sterylnym PBS w probówce do lumnometru (900μl PBS + 100μl BCG luks hodowlę) w dublecie.
3. Włożyć probówkę zawierającą aldehyd N-decylowy (substrat enzymu lucyferazy) do tylnej części urządzenia i upewnić się, że pokrywa jest zabezpieczona, a probówki znajdują się na swoich miejscach.
4. Wypełnij wtryskiwacz luminometru podłożem za pomocą programu prime, ustawiając wtrysk 100 µl x 3 do każdej z 3 pustych probówek do wypełniania umieszczonych w luminometrze.
5. Włożyć obie probówki do luminometru i wykonać pomiary za pomocą programu ustawionego na wstrzyknięcie 10 µl substratu do każdej probówki i odczyt przez 20 s w odstępach 1 s.
6. Gdy stężenie roztworu zapasu osiągnie 1x10⁸ RLU/ml do 2x10⁸ RLU/ml (wymaga to około 3-4 dni wzrostu), dodać do hodowli w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml taką samą objętość sterylnego 30% glicerolu i delikatnie wymieszać.
7. Przenieś alikwoty o objętości 1,5 ml do opisanych probówek typu microtube o pojemności 2 ml z nakrętką i przechowuj w temperaturze -80°C.

2. Wyznaczanie korelacji RLU/CFU dla roztworu zapasowego oraz zawartości alikwotów

1. Do kolby Erlenmeyera o pojemności 20ml z wentylowaną zakrętką wlać 15ml pożywki Middlebrook 7H9 z 10% dodatkiem ADC.
2. Dodać 15μl hygromycyny i 30μl 20% Tween.
3. Wyjąć fiolkę z BCG lux z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej (RT) w komorze bezpieczeństwa. Zawartość fiolki przenieść do pożywki i mocno zakręcić kolbę.
4. Inkubować z wytrząsaniem przy 200rpm w temperaturze 37°C przez 4 dni.
5. Każdego dnia przygotować seryjne rozcieńczenia 10-krotne (1:10, 1:10, 1:10, 1:10 0 i 1:10 0) w celu oznaczenia CFU.
6. Przygotować równolegle takie same rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach w celu oznaczenia luminescencji (patrz część 1.2-1.6).
7. Przygotować dwie płyty z agarem Middlebrook 7H1 z trzema przedziałami (1 l pożywki płynnej zawierającej 0,5% glicerolu, 10% dodatku OADC, 1 ml 20% Tween oraz 1 ml hygromycyny).
8. Wysiać 10μl każdego rozcieńczenia na segment każdej płyty, używając osobnych rozprowadzaczy i rozkładając ciecz równomiernie w obrębie poszczególnych komór.
9. Każdą płytę zabezpieczyć parafilmem, umieścić w sterylnej plastikowej torebce, zamknąć taśmą autoklawacyjną i inkubować w temperaturze 37°C przez 2 tygodnie z odwróconymi pokrywkami.
10. Regularnie kontrolować do czasu pojawienia się CFU (2-3 tygodnie).
11. W celu policzenia kolonii wyjąć płyty z inkubatora i umieścić je na liczniku kolonii. Obliczyć średnią dla każdego rozcieńczenia z płyt powtórzonych.
12. Obliczyć stosunek RLU/CFU, wykorzystując odpowiadające sobie wartości RLU i CFU dla każdego rozcieńczenia. Stosunek ten powinien wynosić od 3 do 5 RLU/CFU.

3. Przygotowanie hodowli BCG lux do inokulacji do krwi pełnej

1. Do kolby Erlenmeyera o pojemności 20 ml z wentylowanym korkiem należy dodać 15 ml pożywki Middlebrook 7H9 z 10% dodatkiem ADC.
2. Dodać 15μl higromycyny i 30μl z 20% Tween.
3. Wyjąć fiolkę BCG luks wyjąć z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa. Zawartość fiolki dodać do pożywki i mocno zakręcić nakrętką.
4. Inkubować z wytrząsaniem przy 20 obr./min w temperaturze 37°C przez 2 do 4 dni.
5. Przygotuj 1 ml rozcieńczenia BCG w stosunku 1:10. luks hodowlę w sterylnym PBS w probówce do luminometru (900μl PBS + 100μl BCG luks kulturę) w dwóch powtórzeniach.
6. Nasyć luminometr podłożem (zgodnie z powyższym opisem), delikatnie wymieszaj obie probówki za pomocą vortexa, wprowadź je do luminometru i wykonaj pomiary (zgodnie z powyższym opisem).
7. Należy wykorzystać ten odczyt do rozcieńczenia hodowli w PBS, aby uzyskać równowartość 7x10⁶ RLU (zapewni to inokulum o wielkości około 2x10⁵ CFU/ml krwi oraz stosunek BCG do monocytów wynoszący około 1:1, przy założeniu liczby monocytów wynoszącej około 2x10⁵ do 4x10⁵ monocytów na ml krwi).

4. Przygotowanie krwi pełnej

1. Pobrać od 3 do 5 ml krwi żylnej do probówki zawierającej heparynę bez konserwantów.
2. Przenieść krew do probówki Falcon 50 ml i rozcieńczyć równą objętością pożywki RPMI 1640 zawierającej glutaminę i 25 mM HEPES (bez pen/strep).
3. Odmierzyć trzykrotnie aliquoty po 90 μl rozcieńczonej krwi do sterylnych probówek bijou dla każdego punktu czasowego (łącznie 6 probówek: 3 dla 0 h i 3 dla 96 h). W razie potrzeby przygotować dodatkowe probówki dla kolejnych punktów czasowych.
4. Odmierzyć dwukrotnie aliquoty po 90 μl pożywki Middlebrooks 7H9 z 10% dodatkiem ADC + 50 μg/ml hygromycyny (tej samej pożywki, której użyto do hodowli BCG lux) dla kontroli wzrostu.
5. Dodać 10 μl rozcieńczonego szczepu BCG lux do każdej probówki z krwią oraz do 2 probówek kontroli wzrostu.
6. Dokładnie wymieszać i umieścić poziomo 3 probówki bijou dla punktu czasowego 96 h oraz 2 kontrole wzrostu w inkubatorze kołyszącym w temperaturze 37°C, przy 20 obr./min (CO₂ nie jest wymagany).

5. Pomiar luminescencji (w 0. i 96. godzinie)

1. Odwiruj 3 probówki bijou przy 200g przez 10 min.
2. Ostrożnie pobierz 30μl supernatantu, nie naruszając osadu, i przelej do mikroprowetek z nakrętką o pojemności 2ml, aby zamrozić je w temperaturze -80°C do późniejszej analizy cytokin.
3. Do każdej probówki bijou dodaj 30μl PBS, aby uzupełnić objętość pobranego supernatantu.
4. Odessa zawartość każdej probówki bijou do odpowiedniej probówki Falcon 50ml i dodaj do każdej z nich 8ml wody destylowanej. Uruchom czasomierz na 10 min.
   Uwaga: Jest to etap wrażliwy na czas i ta inkubacja nie może trwać dłużej niż 10 min, licząc od momentu pierwszego kontaktu komórek z wodą.
5. Przepłucz każdą probówkę bijou 2ml wody destylowanej i wierzgaj w wirówce (vortex) przez 5 sekund przed przelaniem zawartości do odpowiedniej probówki Falcon.
6. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji odwiruj probówki Falcon przy 20g przez 10 minut.
7. Zlej supernatantu do środka dezynfekcyjnego Surfanios.
8. Do każdego osadu dodaj kilka szklanych kulek i wierzgaj w wirówce.
9. Do każdej probówki dodaj 1ml sterylnego PBS i wierzgaj w wirówce.
10. W probówkach do luminometru przygotuj dwukrotne rozcieńczenia 1:10 dla każdej próbki w PBS (90μl PBS + 10μl próbki) w punkcie czasowym 96hr. Przygotuj analogiczne rozcieńczenia dla każdej z kontroli wzrostu.
11. Delikatnie wierzgaj probówki w wirówce, wprowadź je do luminometru i wykonaj pomiary (zgodnie z opisem powyżej).
    Uwaga: Wyniki pomiarów trzech powtórzeń tej samej próbki nie powinny różnić się od siebie o więcej niż 15%.

6. Reprezentatywne wyniki:

W przypadku analiz lux z krwi pełnej ważne jest użycie bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu, tj. hodowanych przez 48–72 godziny przed inokulacją próbek, ponieważ aktywność metaboliczna jest suboptymalna bezpośrednio po wyjęciu z zamrażarki lub w fazie stacjonarnej. W celu uniknięcia zmienności, czas wstępnego wzrostu dla serii eksperymentów powinien zostać ustandaryzowany na 48 lub 72 godziny. Rysunek 1 przedstawia krzywą wzrostu reprezentatywnej kultury BCG lux. Czas podwojenia wynosi około 24 godziny aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.

Rysunek 1. Reprezentatywna krzywa wzrostu BCG luks powyżej 96 godzin w podłożu 7H9 oraz korelacja RLU i CFU.

Chociaż wartości RLU są zawsze skorelowane z CFU, liczba RLU odpowiadająca pojedynczemu CFU może się różnić w zależności od partii materiału wyjściowego, dlatego dobrą praktyką jest stosowanie tego samego mrożonego stoku w całej serii doświadczeń, aby zagwarantować stałą wielokrotność infekcji (MOI).

Tabela 1 przedstawia przykład surowych danych w momencie inokulacji (T₀) oraz po 96 godzinach. Współczynniki wzrostu oblicza się za pomocą wzoru T₉₆/T₀, lecz oczywiście można mierzyć również inne odstępy czasowe. Zaleca się jednak, aby nie prowadzić hodowli powyżej 96 godzin, ponieważ następuje wtedy znaczna śmierć komórek.

Tabela 1. Przykład surowych danych w momencie inokulacji (T0) i po 96 godzinach (T96) oraz obliczone współczynniki wzrostu od 3 dorosłych dawców.

W zależności od dostępnych odpowiedzi pamięciowych specyficznych dla antygenu, a być może również od liczby neutrofili, wskaźniki wzrostu różnią się między osobnikami, co przedstawiono tutaj na Rysunku 2 w krwi dzieci zakażeniem HIV i bez niego. Średnio małe dzieci wykazują wyższe wskaźniki wzrostu niż dorośli, osoby z dodatnim wynikiem próby tuberkulinowej (TST) mają niższe wskaźniki wzrostu niż osoby z ujemnym wynikiem TST, a pacjenci z zakażeniem HIV wykazują wysokie wskaźniki wzrostu ze względu na niedobór populacji limfocytów T CD4, które są jednymi z kluczowych mediatorów komórkowych odpowiedzi immunologicznej na prątki.

Rysunek 2. Zmienność między dawcami: Współczynniki wzrostu T₀ w porównaniu do 96 godzin dla grupy pacjentów, w zależności od stanu zakażenia HIV.

Powtarzalność współczynników wzrostu w określonym czasie przedstawiono na rysunku 3, który podsumowuje wyniki uzyskane od 64 dawców, od których pobrano krew dwukrotnie w ciągu 12 miesięcy, oraz od pojedynczego dawcy, od którego krew pobierano wielokrotnie w celu przeprowadzenia eksperymentów kontrolnych. Potencjalnymi przyczynami zmienności mogą być zmiany w uczuleniu na prątki grzybicy lub zmienność poziomów cytokin gospodarza, co obserwowano w wielu testach biologicznych.

Rycina 3. (a) Pojedynczy dawca w 12 przypadkach w ciągu 12 miesięcy. (b) wielu (64) dawców w dwóch okazjach w ciągu 12 miesięcy.

Dyskusja

Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności.

Pierwsza generacja testów bakteriobójczych u ludzi została opracowana z wykorzystaniem wyłącznie makrofagów zainfekowanych M. tuberculosis. Głównym parametrem określającym przeżywalno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BCG luks	Różne	Przykro mi, ale nie dostarczyłeś tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą chcesz przełożyć na język polski.
agar Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810
bulion Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310 (500 g)
Wzbogacanie na podłożu Middlebrook ADC	BD Biosciences	212352
suplement Middlebrook OADC	BD Biosciences	212240
Tween 80	Sigma-Aldrich	274364
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5150
Hygromycyna B	Grupa Roche	10843555001 (20 ml)
N-decyloaldehyd	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Etanol (>99.7%)	VWR international	101077
Sterylny PBS	Wewnętrzny	Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.
RPMI-1640 z L-glutaminą i 25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	R0883
Sterylna woda destylowana	Wewnątrzpracowniane	Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.
Luminometr do probówek (wymagany port wstrzykiwania)	Berthold Technologies
Probówki do luminometru, 12 x 75 mm, z pyrexu, bez kołnierza	Corning	99445-12
kolby Erlenmeyera z nakrętkami z filtrem, sterylne, z poliwęglanu, 250 ml	Corning	2150329
Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer (z heparyną bez konserwantów)	BD Biosciences	367676
probówki Falcon 50 ml, stożkowe	BD Biosciences	352077
7 ml polipropylenowe probówki bijou Sterilin na próbki	VWR international	99445-12
pojemniki Sterilin Universal (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Kuleczki szklane o średnicy 2 mm	Sigma-Aldrich	Z143928
pipety 10 ml oraz kontroler pipet (pipette boy)	Dowolny dostawca
1000μl i 200μpipety i końcówki z filtrem	Dowolny dostawca
dygestorium biologiczne klasy II
Lodówka (4°C)°C)
Wirówka
Platforma do wytrząsania (1800) do mieszania probówek
Inkubator z wytrząsarką orbitalną ustawiony na 37°C°pożywka do hodowli kultur bakteryjnych