Obrazowanie aktywności wywołanych zapachem w mysiej opuszce węchowej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokoły obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych i sygnałów autofluorescencyjnych flawoprotein do mapowania aktywności wywołanej zapachem na powierzchni opuszki węchowej u myszy.

Streszczenie

W mózgu, stymulacja sensoryczna aktywuje rozproszone populacje neuronów wśród modułów funkcjonalnych, które uczestniczą w kodowaniu bodźca. Funkcjonalne techniki obrazowania optycznego są korzystne do wizualizacji aktywacji tych modułów w korze czuciowej z wysoką rozdzielczością przestrzenną. W tym kontekście, endogenne sygnały optyczne, które powstają w wyniku mechanizmów molekularnych związanych z neuroenergetyką, są cennymi źródłami kontrastu w rejestrowaniu przestrzennych map bodźców sensorycznych na szerokich polach w mózgu gryzoni.

Tutaj prezentujemy dwie techniki oparte na zmianach endogennych właściwości optycznych tkanki mózgowej podczas aktywacji. Po pierwsze, wewnętrzne sygnały optyczne (IOS) są wytwarzane przez lokalną zmianę współczynnika odbicia światła czerwonego spowodowaną: (i) absorpcją przez zmiany poziomu natlenienia krwi i objętości krwi (ii) rozpraszaniem fotonów. Wykorzystanie IOS in vivo do rejestrowania map przestrzennych rozpoczęło się w połowie lat 80-tych XX wieku od obserwacji map optycznych beczek wąsów u szczura i kolumn orientacyjnych w korze wzrokowej kota¹. Obrazowanie IOS powierzchni głównej opuszki węchowej gryzonia (OB) w odpowiedzi na substancje zapachowe zostało później zademonstrowane przez grupę² Larry'ego Katza. Drugie podejście opiera się na sygnałach autofluorescencyjnych flawoprotein (FAS) spowodowanych zmianami stanu redoks tych mitochondrialnych produktów metabolicznych. Mówiąc dokładniej, technika ta opiera się na zielonej fluorescencji spowodowanej stanem utlenienia flawoprotein, gdy tkanka jest wzbudzana niebieskim światłem. Chociaż takie sygnały były prawdopodobnie jednymi z pierwszych cząsteczek fluorescencyjnych zarejestrowanych do badania aktywności mózgu przez pionierskie badania Brittona Chancesa i współpracowników³, dopiero niedawno wykorzystano je do mapowania aktywacji mózgu in vivo. Obrazowanie FAS zostało po raz pierwszy zastosowane do kory somatosensorycznej u gryzoni w odpowiedzi na stymulację tylnej łapy przez grupę⁴ Katsuei Shibuki.

System węchowy ma kluczowe znaczenie dla przetrwania zdecydowanej większości żyjących gatunków, ponieważ umożliwia skuteczne wykrywanie i identyfikację substancji chemicznych w środowisku (żywność, drapieżniki). OB jest pierwszym przekaźnikiem przetwarzania informacji węchowych w mózgu. Otrzymuje aferentne projekcje z pierwotnych neuronów czuciowych węchowych, które wykrywają lotne cząsteczki zapachowe. Każdy neuron czuciowy wyraża tylko jeden typ receptora zapachowego, a neurony przenoszące ten sam typ receptora wysyłają swoje procesy nerwowe do tych samych, dobrze zdefiniowanych mikroregionów ̃100 μm³ utworzonych z dyskretnego neuropilu, kłębuszka węchowego (ryc. 1). W ciągu ostatniej dekady obrazowanie IOS przyczyniło się do funkcjonalnej eksploracji OB^{5, 6, 7}, który stał się jedną z najlepiej zbadanych struktur sensorycznych. Mapowanie aktywności OB za pomocą obrazowania FAS nie zostało jeszcze wykonane.

Tutaj pokazujemy kolejne kroki skutecznego protokołu do obrazowania IOS i FAS do mapowania aktywności wywołanych zapachem w OB myszy.

Protokół

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania (zgodnie z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, dyrektywa 86/609/EWG)

1. Samce myszy C57BL6 w wieku od 6 do 8 tygodni są znieczulane koktajlem ketaminy (10 mg / kg) i ksylazyny (100 mg / kg) wstrzykiwanymi dootrzewnowo. Operacja rozpoczyna się, gdy mysz nie reaguje już na uszczypnięcie tylnej łapy. Podczas całego eksperymentu zwierzę umieszczane jest na poduszce grzewczej. Temperatura ciała jest stale monitorowana i utrzymywana na poziomie 37°C. Głębokość znieczulenia jest utrzymywana przez cały czas trwania operacji i sesji obrazowania, sprawdzając brak wycofania kończyny. W przeciwnym razie podaje się podskórne wstrzyknięcie 20% początkowego koktajlu znieczulającego.
2. Za pomocą maszynki do strzyżenia usuń włosy ze skóry głowy. Oczyść odsłoniętą skórę z resztek włosów za pomocą sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną.
3. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej. Pysk musi znajdować się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy, aby powierzchnia opuszki węchowej była ustawiona poziomo. Mocno zamocuj nauszniki i nos, aby zapobiec ruchom podczas obrazowania.
4. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i bólowi.
5. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne etanolem o temperaturze 70°, a obszar skóry głowy kolejnymi pociągnięciami betadyny.
6. Aby usunąć skórę pokrywającą czaszkę, zacznij od wykonania nacięcia w skórze nożyczkami z tyłu głowy między uszami. Następnie przeciąć z obu stron w kierunku podstawy ucha i w kierunku przednio-tylnym w kierunku czoła wzdłuż powiek. Zakończ usuwanie skóry głowy, przecinając skórę na czubku pyska w pobliżu paska na nos.
7. Pod obserwacją lornetkową użyj bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby delikatnie odłączyć okostną na szczycie czaszki. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą tkankę i zeskrobać powierzchnię czaszki skalpelem, aby uzyskać czysty preparat.
8. OB jest symetryczną strukturą składającą się z dwóch półcebulek, które znajdują się między powiekami. Są one ograniczone w kierunku rostralnym i ogonowym przez zatokę żylną i oddzielone szwem strzałkowym. Umieść kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej nasączonej wodą destylowaną na kości powyżej OB. Ważne jest, aby ten obszar kości był wilgotny przez cały czas trwania eksperymentu.

2. Przygotowanie okna czaszkowego

1. Wyjmij gąbkę żelatynową i zacznij od delikatnego zeskrobania kości ostrzem skalpela nr 10. Utrzymuj stały kąt 45° między ostrzem a kością i przesuwaj ostrze od powiek do strzałkowej strony obszaru bańki. Nie wywieraj pionowego nacisku na kość ani nie drap kości powyżej zatoki żylnej.
2. Podczas procesu rozrzedzania należy przerywać co 5 minut i położyć uwodnioną gąbkę żelatynową na kości, aby schłodzić preparat. Przetrzyj czaszkę gąbką, aby usunąć pył kostny.
3. Kontynuuj zamiatanie i schładzanie na przemian, aż uwidocznisz beleczki, gąbczastą warstwę kości. Na tym etapie musi być widoczne drobne unaczynienie OB. Przestań drapać kość i zacznij używać końcówki skalpela prostopadle, aby "narysować" prostokątny obszar otaczający OB. Na tym etapie można użyć ostrza skalpela nr 11. Utrzymuj operację w granicach zatok żylnych, które powinny być bezpieczne przed każdym uderzeniem skalpelem.
4. Uformowany prostokątny rów należy kopać stopniowo, wykonując kolejne ruchy skalpela. Od czasu do czasu wycieraj końcówkę skalpela, aby ją wyczyścić i utrzymać w ostrości. Zachowaj szczególną ostrożność co do głębokości końcówki, aby uniknąć dotykania powierzchni opony twardej.
5. Aby uzyskać poczucie grubości pozostałej kości, delikatnie popchnij ją końcówką kleszczy. Jeśli płat kostny fałduje się pod naciskiem, przejdź do następnego kroku.
6. Pod kroplą soli fizjologicznej użyj końcówki skalpela skierowanej poziomo, aby podnieść płat kostny. Usunięcie płata należy wykonać ostrożnie, aby uniknąć oderwania pozostałej kości.
7. Po odsłonięciu powierzchni OB sprawdź, czy nie ma krwawienia lub zespolenia naczyń krwionośnych. Uszkodzenie opony twardej lub powierzchni tkanki zmniejszy szanse na uzyskanie sygnałów optycznych. Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną, aby cebulka była wilgotna.
8. Nałóż poliakrylowy cement dentystyczny, aby utworzyć zagłębienie na kości wokół okna.
9. Umieść kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1,2%) na oponie twardej i umieść sterylną szklankę nakrywkową na wymiarach okna. Podczas sesji obrazowania można dodać niewielką ilość agarozy w celu skompensowania wysuszenia. Agaroza zapobiegnie przesuwaniu się OB podczas oddychania i zapewni płaską powierzchnię do obrazowania optycznego.

3. Konfiguracja obrazowania optycznego do mapowania aktywności węchowej

1. Stymulacja węchowa musi być precyzyjnie określona pod względem czasu i intensywności za pomocą olfaktometru. Używamy niestandardowej, zmodyfikowanej wersji wielowifilowego systemu perfuzyjnego Valvebank 8II firmy Automate Scientific w połączeniu z podstawową sprężarką powietrza (odpowiednie byłoby również sprężone powietrze do oddychania). System ten pozwala na dokładne i szybkie sterowanie zaworami zewnętrznymi. Roztwory czystego środka zapachowego rozcieńcza się w oleju mineralnym w wybranym stężeniu. Aby aktywować grzbietowy OB, powszechnie stosuje się aldehydy, takie jak heksanal. Dokładna objętość rozcieńczonego środka zapachowego (od 20 do 50 μl) jest ładowana na bibułę filtracyjną i umieszczana w zbiorniku strzykawki. Przez system perfuzyjny powietrze o kontrolowanym ciśnieniu jest dostarczane do systemu, zapewniając stałą szybkość dostarczania nawanianego strumienia powietrza do nosa zwierzęcia podczas otwierania zaworu. Środek zapachowy jest dostarczany przez rurkę próżniową Tygon R-3603 (Saint-Gobain Corporation) przenoszącą powietrze o natężeniu przepływu 1000 ml/min. Unikaj zanieczyszczenia między nazapachami i resztkowymi ilościami nawaniacza w przewodach. Jeśli jest to możliwe, powtarzalność bodźca zapachowego można kontrolować za pomocą detektora płomieniowo-jonizacyjnego (microFID 2020 Photovac).
2. Konfiguracja optyczna jest włączona. Składa się z chłodzonej 12-bitowej kamery CCD z przeplotem (ORCA AG Hamamatsu) połączonej z stereomikroskopem fluorescencyjnym (Leica MZ16), komputerowo sterowanego olfaktometru oraz stabilizowanych lamp wzbudzenia z odpowiednimi filtrami interferencyjnymi pasmowoprzepustowymi. Schemat opisujący naszą konfigurację znajduje się na rysunku 2. Do obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych (IOSI) stosuje się wolframową lampę halogenową o mocy 200 W (Oriel QTH) w połączeniu z światłowodową lampą pierścieniową (Schott) podłączoną wokół obiektywu mikroskopu, aby zapewnić stabilne i równomierne oświetlenie. W przypadku obrazowania sygnałów autofluorescencyjnych flawoprotein (FASI), lampa metalohalogenkowa o mocy 150 W (Leica) z 5-milimetrowym rdzeniem cieczy światłowodu zapewnia równomierne miejscowe wzbudzenie fluorescencji przez port epi-illumination mikroskopu stereoskopowego.
   
   Pobieranie obrazów i synchronizacja sprzętowa są realizowane za pomocą niestandardowego oprogramowania. Oprogramowanie Micromanager typu open source może być również używane do kontrolowania konfiguracji optycznej i akwizycji.

4. Obrazowanie optyczne

1. Umieść ramkę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym, okno czaszki wyśrodkowane w polu view (patrz rys. 2A dla schematu układu optycznego).
2. Dostosuj mikroskop, aby ustawić ostrość na naczyniach włosowatych. Przed próbami stymulacji (patrz opis w 5) obraz żarówki jest wykonywany w świetle 560 nm (zielonym) (pierścień światłowodowy), co zapewnia dobry kontrast dla obrazowania naczyń krwionośnych. Obraz ten służy jako kontrola anatomiczna w celu sprawdzenia stanu preparatu i jest pozyskiwany kilka razy podczas eksperymentu.
3. W przypadku obrazowania IOS natężenie światła odbitego jest rejestrowane przez kamerę CCD przy oświetleniu 630 +/- 10 nm (czerwonym). Obrazy są rejestrowane na pełnej klatce (bez binningu) z prędkością 5 klatek na sekundę, co odpowiada czasowi naświetlania około 150 ms. Moc źródła światła jest dostosowana tak, aby osiągnąć poziom szarości co najmniej 3000 ̃3000 w obszarze OB, zbliżony do nasycenia zagłębień pikseli CCD. Dzięki temu możliwe jest wykorzystanie 12-bitowej dynamiki przetwornika CCD do uchwycenia słabych zmian intensywności podczas aktywacji. Maksymalne amplitudy IOS osiągają ̃1%.
4. W przypadku obrazowania FAS fluorescencja jest uzyskiwana pod wpływem wzbudzenia światła epiflurorescencji 480nm +/-20nm (niebieskiego). Filtr górnoprzepustowy o długości fali 515 nm jest ustawiony do wychwytywania światła. Obrazy są rejestrowane z szybkością 5 klatek na sekundę z binowaniem 4 na 4, aby zmaksymalizować czułość. Moc światła wzbudzenia jest regulowana podobnie jak w IOS z poziomami szarości 3000 w obszarze OB. Maksymalne amplitudy FAS osiągają ̃3%.
   
   Dla obu metod obrazowania głębia ostrości w płaszczyźnie obiektu jest taka sama i została zmierzona na poziomie 0,5 mm dla powiększenia około 4 razy.
5. Pomiędzy próbami obrazowania należy wyłączyć światło, aby uniknąć podgrzewania i fotowybielania preparatu.

5. Badania obrazowe

1. Standardowa sesja obrazowania obejmowała linię bazową od 5 do 10 sekund, w której dostarczane jest tylko powietrze, a następnie stymulację zapachu przez 3 do 10 sekund w zależności od wybranego stężenia zapachu, a następnie od 70 do 82 sekund jest dalej rejestrowane przy stałym przepływie powietrza w celu odzyskania wartości wyjściowej (ryc. 2A). Pod koniec badania światło jest wyłączane i dostarczane jest czyste powietrze przez okres między próbami (1 do 3 minut), aby wypłukać resztki cząsteczek zapachu i uniknąć przyzwyczajenia sensorycznego. Próby zapachowe przeplatano próbami ślepej próby (dostarczanie powietrzem).
2. Strefy aktywowane wywołane zapachem są wizualizowane na mapach jako mniej więcej sferyczne obszary i odpowiadają rozmiarowi poszczególnych kłębuszków nerkowych (o średnicy od 80 do 200 μm⁹). Przetwarzanie obrazu wyjaśniono na rysunku 2B. Mapy węchowe przedstawiono na rysunku 3. W przeciwieństwie do innych systemów sensorycznych, stosunek sygnału do szumu w OB był wystarczający do rozwiązania reakcji wywołanych zapachem w pojedynczych próbach (ryc. 3B dla IOS i Fig. 3D dla FAS).
3. Myszy są poddawane eutanazji natychmiast po zakończeniu sesji obrazowania przy użyciu metod zgodnych z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

6. Reprezentatywne wyniki (zobacz mapy węchowe na rysunku 3):

Wykres 1 Organizacja strukturalna głównej opuszki węchowej u gryzoni. Węchowe neurony czuciowe, pierwotne komórki czuciowe znajdujące się w głównym nabłonku węchowym, wyrażają ten sam receptor zapachowy i zbiegają się w tych samych kłębuszkach w OB. Kłębuszki węchowe, okrągłe neuropils (przerywane koła), znajdują się na powierzchni OB. Należy zauważyć, że na poziomie kłębuszków nerkowych występuje bardzo gęsta i złożona sieć naczyniowa. Skróty (góra/dół): ONL: warstwa nerwu węchowego; GL: warstwa kłębuszkowa, EPL: zewnętrzna warstwa pleksi; MCL: warstwa komórek mitralnych; GCL: warstwa komórek ziarnistych.

Wykres 2 Rejestracja sygnałów odbicia i fluorescencji in vivo. A. Konfiguracja obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia. Mózg znieczulonej myszy jest wystawiony na działanie światła czerwonego (IOS) lub niebieskiego (FAS) przez pierścieniowy pierścień światłowodowy przymocowany do soczewki optycznej lub port epi-illuminacyjny mikroskopu. Zapachy są ładowane do szczelnie zamkniętych fiolek, a nawonione powietrze jest dostarczane do nosa zwierzęcia (zielone światło: otwarty zawór). B. Protokół nagrywania i przetwarzanie danych. IOS i FAS są rejestrowane jako serie pojedynczych prób (czas trwania 90 sekund). Diagram przedstawia oś czasu pojedynczego badania: linia wyjściowa waha się od 5 do 10 sekund, stymulacja od 3 do 10 sekund, a powrót do wartości wyjściowej od 70 do 82 sekund. Przetwarzanie obrazu wymaga odejmowania piksel po pikselu wartości intensywności podczas linii bazowej do wartości intensywności w okresach stymulacji (dla FAS) lub stymulacji plus powrót do linii bazowej (dla IOS). Różnica ta jest następnie dzielona przez wartości bazowe, aby uzyskać odchylenie w % (patrz wynikowe obrazy na rys. 3).

Wykres 3 Mapy aktywności wywołane zapachem w OB przy użyciu obrazowania IOS i FAS. A. Unaczynienie grzbietowej części położniczej uwidocznione w zielonym świetle. B-C. Zobrazowano IOS (odpowiednio pojedyncze badanie w porównaniu z trzema uśrednionymi badaniami) w celu uzyskania 10-sekundowej prezentacji 20% heksanalu. Białe strzałki wskazują sferyczne obszary zainteresowania aktywowane przez ten zapach. Te mapy aktywacji uzyskano przy użyciu ramek uśrednionych w pierwszej sekundzie po zakończeniu stymulacji zapachowej (maksymalna zmiana odbicia -0,63% w A i -0,52% w B). Zwróć uwagę na czarne strefy absorbancji, w których nastąpiła aktywacja zapachu. C-D. FAS pozyskiwany sekwencyjnie u tej samej myszy dla tego samego środka zapachowego (odpowiednio pojedyncze badanie w porównaniu z trzema uśrednionymi badaniami). Te mapy aktywacji uzyskano przy użyciu ramek uśrednionych w ciągu pierwszej sekundy po rozpoczęciu stymulacji zapachowej (maksimum zmienności fluorescencji +0,72% w D i +0,66% w E). Należy pamiętać, że białe strefy emisji autofluorescencji oznaczone czarnymi strzałkami odpowiadają czarnym strefom w IOS. Ziarnisty aspekt widoczny na mapie FAS wynika z grupowania 4 na 4 wymaganego do poprawy czułości. Obrazy FAS nie były korygowane za pomocą wybielania autofluorescencyjnego. Rzeczywiste wymiary obrazów B-E: 0,7 mm szerokości x 1,2 mm długości.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy techniki obrazowania IOS i FAS do rejestracji in vivo czynności wywołanych zapachem w położnictwie myszy. Aby osiągnąć ten cel, niezbędna jest stosunkowo prosta i niedroga konfiguracja obrazowania optycznego o szerokim polu. Pozyskiwanie danych obrazowych wymaga przeszkolenia w zakresie wykonywania precyzyjnych zabiegów chirurgicznych i unikania jakichkolwiek urazów opony twardej lub tkanki mózgowej. W szczególności, poważne krwawienie pochłonie fotony zarejestrowane do obrazowania i zakończy eksperyment.

Jedną z zalet obrazowania IOS i FAS jest uniknięcie wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, które mogłyby skutkować toksycznością komórkową lub niepożądanymi skutkami ubocznymi. Pozwalają one na zmierzenie się z zagadnieniami związanymi z mapami węchowymi, a tym samym kodowaniem przestrzennym bodźców sensorycznych. W przeciwieństwie do obrazowania 2-DeoxyGlucose dają one możliwość zobrazowania kilku zapachów u jednego zwierzęcia. Ponieważ jednak penetracja fotonów w tkance jest ograniczona, IOS i FAS są ograniczone do grzbietowej części OB i nie można ich zarejestrować z obszarów brzusznych.

Endogenne obrazowanie sygnału optycznego zapewnia doskonałą rozdzielczość przestrzenną do obrazowania in vivo . Ulepszenia techniczne dotyczą obliczeń ilościowych składowych naczyniowych w sygnałach odbicia^8,9 oraz dynamiki natlenienia i objętości krwi podczas aktywacji sensorycznej¹⁰. W naszym laboratorium opracowywane są obecnie metody obrazowania IOS na wielu długościach fal, aby w pełni określić ilościowo całkowite stężenie hemoglobiny i natlenienie w OB podczas aktywacji sensorycznej. Te spektroskopowe pomiary optyczne dodane do obrazowania FAS dadzą możliwość odpowiedzi na nierozwiązany związek między dynamiką naczyniową i wewnątrzkomórkową podczas aktywacji sensorycznej^11,12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer AG
Agaroza, typ III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Sześciokątny 98%	Aldrich	115606-100ML