Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Streszczenie

W mózgu stymulacja sensoryczna aktywuje rozproszone populacje neuronów w obrębie modułów funkcjonalnych, które biorą udział w kodowaniu bodźca. Techniki funkcjonalnego obrazowania optycznego są korzystne do wizualizacji aktywacji tych modułów w korach sensorycznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną. W tym kontekście endogenne sygnały optyczne, wynikające z mechanizmów molekularnych powiązanych z neuroenergetyką, stanowią cenne źródła kontrastu do rejestracji map przestrzennych bodźców sensorycznych w szerokich polach widzenia w mózgu gryzoni.

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki oparte na zmianach endogennych właściwości optycznych tkanki mózgowej podczas aktywacji. Po pierwsze, wewnętrzne sygnały optyczne (IOS) są generowane przez lokalną zmianę odbicia światła czerwonego wynikającą z: (i) absorpcji spowodowanej zmianami poziomu utlenowania krwi i objętości krwi (ii) rozpraszania fotonów. Wykorzystanie IOS in vivo do rejestracji map przestrzennych rozpoczęło się w połowie lat 80. od obserwacji map optycznych beczek wibrysowych u szczura oraz kolumn orientacyjnych w korze wzrokowej kota¹. Obrazowanie IOS powierzchni głównej opuszki węchowej (OB) gryzoni w odpowiedzi na substancje zapachowe zostało później zademonstrowane przez grupę Larry'ego Katza². Drugie podejście opiera się na sygnałach autofluorescencji flawoprotein (FAS), wynikających ze zmian stanu redoks tych mitochondrialnych produktów pośrednich metabolizmu. Dokładniej rzecz ujmując, technika ta opiera się na zielonej fluorescencji wynikającej ze stanu utlenionego flawoprotein, gdy tkanka jest pobudzana niebieskim światłem. Choć sygnały te były prawdopodobnie jednymi z pierwszych zarejestrowanych cząsteczek fluorescencyjnych w badaniach nad aktywnością mózgu przeprowadzonych w pionierskich pracach Brittona Chance'a i współpracowników³, dopiero niedawno zaczęto je wykorzystywać do mapowania aktywacji mózgu in vivo. Obrazowanie FAS zostało po raz pierwszy zastosowane w korze somatosensorycznej gryzoni w odpowiedzi na stymulację tylnej łapy przez grupę Katsueiego Shibukiego⁴.

Układ węchowy ma kluczowe znaczenie dla przetrwania ogromnej większości żyjących gatunków, ponieważ umożliwia efektywne wykrywanie i identyfikację substancji chemicznych w środowisku (pokarmu, drapieżników). OB jest pierwszym przekaźnikiem przetwarzania informacji węchowych w mózgu. Otrzymuje on projekcje doprowadzające z pierwotnych neuronów sensorycznych węchowych, które wykrywają lotne cząsteczki substancji zapachowych. Każdy neuron sensoryczny wykazuje ekspresję tylko jednego typu receptora zapachowego, a neurony posiadające ten sam typ receptora przesyłają swoje wypustki nerwowe do tych samych, ściśle określonych mikroregionów o objętości ˜100μm³, składających się z dyskretnego neuropila, czyli kłębków węchowych (Rys. 1). W ostatniej dekadzie obrazowanie IOS sprzyjało funkcjonalnej eksploracji OB^{5, 6, 7}, która stała się jedną z najdokładniej badanych struktur sensorycznych. Mapowanie aktywności OB przy użyciu obrazowania FAS nie zostało jeszcze przeprowadzone.

W niniejszej pracy przedstawiamy kolejne kroki wydajnego protokołu obrazowania IOS i FAS w celu zmapowania aktywności wywołanej zapachami w opuszce węchowej (OB) myszy.

Protokół

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania (zgodnie z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, dyrektywa 86/609/EWG)

1. Samce myszy szczepu C57BL6 w wieku od 6 do 8 tygodni są znieczulane poprzez doprzewotnikowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (10 mg/kg) i ksylazyny (100 mg/kg). Zabieg operacyjny rozpoczyna się, gdy mysz przestaje reagować na uciśnięcie tylnej łapy. Przez cały czas trwania eksperymentu zwierzę znajduje się na podgrzewaczu. Temperaturę ciała monitoruje się w sposób ciągły i utrzymuje na poziomie 37°CGłębokość znieczulenia jest utrzymywana przez cały czas trwania operacji i sesji obrazowania poprzez sprawdzanie braku odruchu cofania kończyny. W przeciwnym razie podaje się podskórnie 20% początkowego koktajlu anestetycznego.
2. Za pomocą strzyżarki usuń włosy ze skóry głowy. Oczyszczaj odsłoniętą skórę z pozostałości włosów, używając sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną.
3. Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym. Nos musi znajdować się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy, aby ustawić powierzchnię opuszki węchowej poziomo. Mocno przymocuj pręty uszne i nosowy, aby zapobiec ruchom podczas obrazowania.
4. Nanieść maść oftalmiczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysychaniu i bólowi.
5. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą 70° etanol oraz obszar skóry głowy za pomocą kolejnych pociągnięć betadyną.
6. Aby usunąć skórę pokrywającą czaszkę, należy rozpocząć od wykonania nożyczkami nacięcia skóry z tyłu głowy, pomiędzy uszami. Następnie należy ciąć w obie strony w kierunku nasady uszu oraz w kierunku przednio-tylnym w stronę czoła, wzdłuż powiek. Usuwanie skóry głowy należy zakończyć poprzez przecięcie skóry na górnej części pyska, blisko kości nosowej.
7. Pod obserwacją w stereomikroskopie, przy użyciu patyczka watnego nasączonego solą fizjologiczną, delikatnie oddziel okostną z górnej części czaszki. Za pomocą pęsety usuń pozostałą tkankę, a następnie zeskrob powierzchnię czaszki skalpelem, aby uzyskać czysty preparat.
8. Opuszka węchowa (OB) jest strukturą symetryczną, składającą się z dwóch półopuszek zlokalizowanych pomiędzy powiekami. W kierunku rostralnym i kaudalnym są one ograniczone zatoką żylną, a od siebie oddzielone szwem strzałkowym. Na kości nad opuszkami węchowymi należy umieścić kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej nasączonej wodą destylowaną. Ważne jest, aby ten obszar kości pozostawał wilgotny przez cały czas trwania eksperymentu.

2. Przygotowanie okna czaszkowego

1. Usuń gąbkę żelatynową i rozpocznij od delikatnego skrobania kości ostrzem skalpela n°10. Zachowaj stały kąt 45° między ostrzem a kością i przesuwaj ostrze od powiek w stronę strzałkową obszaru opuszki. Nie wywieraj nacisku pionowego na kość ani nie drażnij kości powyżej zatoki żylnej.
2. W procesie ścieńczania przerywaj pracę co 5min i przykładaj do kości nawilżoną gąbkę żelatynową, aby schłodzić preparat. Przecieraj czaszkę gąbką w celu usunięcia pyłu kostnego.
3. Kontynuuj naprzemienne skrobanie i chłodzenie, aż do uwidocznienia beleczek, czyli warstwy kości gąbczastej. Na tym etapie powinna być widoczna drobna sieć naczyniowa OB. Przestań skrobać kość i zacznij używać końcówki skalpela prostopadle, aby „wyrysować” prostokątny obszar obejmujący OB. Na tym etapie można użyć ostrza skalpela n°11. Prowadź zabieg w granicach zatok żylnych, które powinny pozostać bezpieczne przed jakimkolwiek pociągnięciem skalpela.
4. Stopniowo pogłębiaj utworzony prostokątny rów, wykonując kolejne ruchy skalpelem. Okresowo wycieraj końcówkę skalpela, aby ją oczyścić i utrzymać jej ostrość. Zachowaj szczególną ostrożność co do głębokości wprowadzania końcówki, aby uniknąć dotknięcia powierzchni opony twardej.
5. Aby ocenić grubość pozostałej kości, naciśnij ją delikatnie końcówką pęsety. Jeśli płat kostny ugina się pod naciskiem, przejdź do następnego kroku.
6. Pod kroplą soli fizjologicznej użyj końcówki skalpela skierowanej poziomo, aby podważyć płat kostny. Usunięcie płata musi być wykonane ostrożnie, aby uniknąć wyrwania pozostałej części kości.
7. Po odsłonięciu powierzchni OB sprawdź, czy nie występuje krwawienie lub anastomoza naczyń krwionośnych. Uszkodzenie opony twardej lub powierzchni tkanki zmniejszy szansę na uzyskanie sygnałów optycznych. Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wilgotność opuszki.
8. Nanieś dentystyczny cement poliakrylanowy, aby utworzyć pierścień na kości wokół okna.
9. Nanieś kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1.2%) na oponę twardą i połóż sterylną lamkę o wymiarach okna. Podczas sesji obrazowania można dodać niewielką ilość agarozy, aby zrekompensować wysychanie. Agaroza zapobiegnie przemieszczaniu się OB podczas oddychania i zapewni płaską powierzchnię do obrazowania optycznego.

3. Układ obrazowania optycznego do mapowania aktywności węchowej

1. Stymulacja węchowa musi być precyzyjnie zdefiniowana w czasie i intensywności przy użyciu olfaktometru. Stosujemy zmodyfikowaną wersję systemu perfuzji wieloflakonowej Valvebank 8II firmy Automate Scientific połączoną z podstawową sprężarką powietrza (odpowiednie byłoby również sprężone powietrze do oddychania). System ten umożliwia dokładną i szybką zewnętrzną kontrolę zaworów. Roztwory czystego odorantu są rozcieńczane w oleju mineralnym do wybranego stężenia. Do aktywacji grzbietowej części OB powszechnie stosuje się aldehydy, takie jak heksanal. Precyzyjna objętość rozcieńczonego odorantu (20 do 50μl) jest nanoszona na papier filtracyjny i umieszczana w zbiorniku strzykawkowym. Poprzez system perfuzji do układu dostarczane jest powietrze o kontrolowanym ciśnieniu, co zapewnia stały przepływ powietrza zapachowego do nosa zwierzęcia podczas otwarcia zaworu. Odorant jest dostarczany przez rurkę próżniową Tygon R-3603 (Saint-Gobain Corporation), transportującą powietrze z przepływem ok. 1000ml/min. Należy unikać zanieczyszczeń między odorantami oraz pozostawania resztkowych ilości odorantu w rurkach. Jeśli jest dostępny, powtarzalność bodźca zapachowego może być kontrolowana za pomocą detektora jonizacji płomieniowej (microFID 2020 Photovac).
2. Włącza się układ optyczny. Składa się on z chłodzonej kamery CCD 12-bitowej z przeplotem (ORCA AG Hamamatsu) połączonej ze stereomikroskopem fluorescencyjnym (Leica MZ16), olfaktometrem sterowanym komputerowo oraz stabilizowanymi lampami wzbudzenia z odpowiednimi interferencyjnymi filtrami pasmowymi. Schemat opisujący nasz układ przedstawiono na rysunku 2. Do obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych (IOSI) stosuje się lampę wolframowo-halogenową 200W (Oriel QTH) sprzężoną z pierścieniowym światłowodem (Schott) zamontowanym wokół obiektywu mikroskopu, aby zapewnić stabilne i równomierne oświetlenie. Do obrazowania sygnałów autofluorescencji flawoprotein (FASI) stosuje się lampę halogenową 150W (Leica) z ciekłym światłowodem o rdzeniu 5mm, co zapewnia równomierne, zlokalizowane wzbudzenie fluorescencji poprzez port epi-oświetlenia stereomikroskopu.
   
   Akwizycja obrazu i synchronizacja sprzętowa są realizowane przez specjalistyczne oprogramowanie. Do sterowania układem optycznym i akwizycją można również wykorzystać oprogramowanie open source Micromanager.

4. Obrazowanie optyczne

1. Umieść ramę stereotaktyczną pod stereomikroskopem, centrując okno czaszkowe w polu widzenia (schemat układu optycznego przedstawiono na Rys. 2A).
2. Ustaw ostrość mikroskopu na naczynia włosowate. Przed próbami stymulacji (patrz opis w punkcie 5) wykonuje się obraz cebulki przy świetle 560nm (zielonym) (pierścień światłowodowy), co zapewnia dobry kontrast dla obrazowania naczyń krwionośnych. Obraz ten służy jako kontrola anatomiczna do sprawdzenia stanu preparatu i jest pozyskiwany kilkakrotnie w trakcie eksperymentu.
3. W przypadku obrazowania IOS intensywność światła odbitego jest rejestrowana przez kamerę CCD przy oświetleniu 630+/-10 nm (czerwonym). Obrazy są pozyskiwane w pełnej klatce (bez binningu) z częstotliwością 5 klatek na sekundę, co odpowiada czasowi ekspozycji około 150ms. Moc źródła światła jest dostosowana tak, aby osiągnąć poziomy szarości co najmniej ˜3000 w obszarze OB, blisko nasycenia studni pikseli CCD. Pozwala to na wykorzystanie 12-bitowej dynamiki CCD do rejestracji słabych zmian intensywności podczas aktywacji. Maksymalne amplitudy IOS osiągają ˜1%.
4. W przypadku obrazowania FAS fluorescencja jest pozyskiwana przy pobudzeniu światłem epifluorescencyjnym 480nm+/-20nm (niebieskim). Do przechwytywania światła zastosowano filtr górnoprzepustowy 515nm. Obrazy są pozyskiwane z częstotliwością 5 klatek na sekundę z binningiem 4 na 4 w celu maksymalizacji czułości. Moc światła pobudzenia jest dostosowana analogicznie do IOS, z poziomami szarości 3000 w obszarze OB. Maksymalne amplitudy FAS osiągają ˜3%.
   
   Dla obu trybów obrazowania głębia ostrości w płaszczyźnie badanego obiektu jest taka sama i wyniosła 0,5 mm przy powiększeniu około 4-krotnym.
5. Światło powinno być wyłączone pomiędzy próbami obrazowania, aby uniknąć nagrzewania i fotobleachingu preparatu.

5. Próby obrazowania

1. Standardowa sesja obrazowania obejmowała linię bazową trwającą od 5 do 10 s, podczas której podawano tylko powietrze, a następnie stymulację zapachową trwającą od 3 do 10 s w zależności od wybranego stężenia zapachu, po czym rejestrowano kolejne 70 do 82 s przy stałym przepływie powietrza w celu powrotu do linii bazowej (Rys. 2A). Na koniec próby światło było wyłączane, a czyste powietrze podawano przez czas przerwy między próbami (od 1 do 3 minut), aby usunąć pozostałe cząsteczki zapachu i uniknąć habituacji sensorycznej. Próby z zapachami były przeplatane próbami kontrolnymi (podawaniem powietrza).
2. Aktywowane strefy wywołane zapachami są wizualizowane na mapach jako obszary o kształcie zbliżonym do sferycznego i odpowiadają rozmiarom poszczególnych kłębuszków (średnica od 80 do 200 μm⁹). Przetwarzanie obrazów wyjaśniono na Rysunku 2B. Mapy węchowe przedstawiono na Rysunku 3. W przeciwieństwie do jakiegokolwiek innego systemu sensorycznego, stosunek sygnału do szumu w OB był wystarczający, aby rozdzielić odpowiedzi wywołane zapachami w pojedynczych próbach (Rys. 3B dla IOS i Rys. 3D dla FAS).
3. Myszy są uśmiercane natychmiast po zakończeniu sesji obrazowania metodami zgodnymi z europejskimi zaleceniami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

6. Reprezentatywne wyniki (patrz mapy węchowe na rysunku 3):

Rycina 1 Organizacja strukturalna głównej opuszki węchowej u gryzoni. Sensoryczne neurony węchowe, pierwotne komórki sensoryczne zlokalizowane w głównym nabłonku węchowym, wykazują ekspresję tego samego receptora zapachowego i zbiegają się w tych samych kłębuszkach w OB. Kłębuszki węchowe, okrągłe neuropile (przerywane okręgi), znajdują się na powierzchni OB. Należy zwrócić uwagę na obecność bardzo gęstej i złożonej sieci naczyniowej na poziomie kłębuszkowym. Skróty (od góry do dołu): ONL: warstwa nerwu węchowego; GL: warstwa kłębuszkowa, EPL: zewnętrzna warstwa splotowata; MCL: warstwa komórek mitralnych; GCL: warstwa komórek ziarnistych.

Rysunek 2 Rejestracja sygnałów odbicia i fluorescencji in vivo. A. Układ obrazowania optycznego w szerokim polu. Mózg znieczuplonej myszy jest naświetlany światłem czerwonym (IOS) lub niebieskim (FAS) za pomocą pierścienia światłowodowego przymocowanego do soczewki optycznej lub portu epi-oświetleniowego mikroskopu. Zapachy są umieszczane w szczelnych fiolkach, a napowietrzone powietrze jest dostarczane do nosa zwierzęcia (zielone światło: otwarty zawór). B. Protokół rejestracji i przetwarzanie danych. IOS i FAS są rejestrowane jako serie pojedynczych prób (o czasie trwania 90 s). Schemat przedstawia oś czasu pojedynczej próby: linia bazowa trwa od 5 do 10 s, stymulacja od 3 do 10 s, a powrót do linii bazowej od 70 do 82 s. Przetwarzanie obrazu wymaga odejmowania wartości natężenia podczas linii bazowej od wartości natężenia podczas okresów stymulacji (dla FAS) lub stymulacji wraz z powrotem do linii bazowej (dla IOS) w skali piksel po pikselu. Różnica ta jest następnie dzielona przez wartości bazowe w celu uzyskania wariancji w % (patrz obrazy wynikowe na Rys. 3).

Rysunek 3 Mapy aktywności wywołanej zapachem w OB przy użyciu obrazowania IOS i FAS. A. Układ naczyniowy grzbietowej części OB wizualizowany w świetle zielonym. B-C. Obrazowanie IOS (odpowiednio pojedyncza próba oraz średnia z trzech prób) dla 10s prezentacji 20% heksanalu. Białe strzałki wskazują sferyczne obszary zainteresowania aktywowane przez ten zapach. Mapy aktywacji te uzyskano, uśredniając klatki z pierwszej sekundy po zakończeniu stymulacji zapachowej (maksimum zmienności odbicia -0,63% w A i -0,52% w B). Zwróć uwagę na czarne strefy absorpcji, w których wystąpiła aktywacja zapachowa. C-D. Obrazy FAS pozyskane sekwencyjnie u tej samej myszy dla tego samego substancji zapachowej (odpowiednio pojedyncza próba oraz średnia z trzech prób). Mapy aktywacji te uzyskano, uśredniając klatki z pierwszej sekundy po rozpoczęciu stymulacji zapachowej (maksimum zmienności fluorescencji +0,72% w D i +0,66% w E). Należy zauważyć, że białe strefy emisji autofluorescencji wskazane czarnymi strzałkami odpowiadają czarnym strefom w IOS. Ziarnistość widoczna na mapie FAS wynika z konieczności zastosowania binningu 4x4 w celu poprawy czułości. Obrazy FAS nie były korygowane pod kątem blaknięcia autofluorescencji. Rzeczywiste wymiary obrazów B-E: 0,7 mm szerokości x 1,2 mm długości.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiamy techniki obrazowania IOS i FAS do rejestracji in vivo aktywności wywołanej zapachami w OB myszy. Aby osiągnąć ten cel konieczne jest zastosowanie stosunkowo prostego i przystępnego cenowo układu do szerokopolowego obrazowania optycznego. Pozyskiwanie danych obrazowych wymaga przeszkolenia w celu przeprowadzenia precyzyjnych procedur chirurgicznych i uniknięcia jakichkolwiek uszkodzeń opony twardej lub tkanki mózgowej. W szczególności silny krwawienie spowoduje absorpcję fotonów rejestrowanych podczas obrazowania i doprowadzi do zakończenia eksperymentu.

Jedną z zalet obrazowania IOS i FAS jest uniknięcie wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, które mogłyby doprowadzić do toksyczności komórkowej lub niepożądanych skutków ubocznych. Pozwalają one na badanie kwestii map węchowych, a tym samym przestrzennego kodowania bodźców sensorycznych. W przeciwieństwie do obrazowania 2-DeoxyGlucose, umożliwiają one obrazowanie kilku zapachów u jednego zwierzęcia. Jednakże, ze względu na ograniczoną penetrację fotonów w tkance, metody IOS i FAS są ograniczone do grzbietowej części OB i nie mogą być rejestrowane z obszarów brzusznych.

Obrazowanie endogennych sygnałów optycznych oferuje doskonałą rozdzielczość przestrzenną w badaniach in vivo. Udoskonalenia techniczne dotyczą obliczeń ilościowych komponentów naczyniowych w sygnałach odbiciowych^8,9, a także dynamiki utlenowania i objętości krwi podczas aktywacji sensorycznej¹⁰. W naszym laboratorium opracowywane są obecnie wielodługościowe metody obrazowania IOS w celu pełnego ilościowego określenia całkowitego stężenia hemoglobiny i poziomu utlenowania w OB podczas aktywacji sensorycznej. Te spektroskopowe pomiary optyczne, uzupełnione o obrazowanie FAS, umożliwią wyjaśnienie nierozwiązanej kwestii zależności między dynamiką naczyniową a wewnątrzkomórkową podczas aktywacji sensorycznej^11,12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer AG
Agaroza, typ III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Heksanal 98%	Aldrich	115606-100ML