Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Podsumowanie

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Streszczenie

Główną przeszkodą w aktualnych badaniach nad ranami cukrzycowymi jest brak modelu rany niedokrwiennej, który mógłby być bezpiecznie stosowany u zwierząt z cukrzycą. Leki, które wykazują skuteczność w ranach niedokrwiennych, mogą nie działać w przypadku ludzkich ran cukrzycowych, ponieważ waskulopatia jest jednym z kluczowych czynników hamujących gojenie tych zmian. W 2007 roku opublikowaliśmy artykuł opisujący model rany niedokrwiennej ucha królika, stworzony za pomocą małoinwazyjnej techniki chirurgicznej. Od tego czasu dodatkowo uprościliśmy tę procedurę, aby ułatwić jej wykonanie. Na jednym uchu, w odległości 1-2 cm od podstawy, wykonano trzy niewielkie nacięcia skóry na stopkach naczyniowych. Tętnicę centralną podwiązano i przecięto wraz z nerwem. Cały pęczek kranialny został przecięty i podwiązany, pozostawiając nienaruszoną jedynie gałąź caudalną. Przez nacięcia wykonano okrężny tunel podskórny w celu przecięcia tkanek podskórnych, mięśni, nerwów i małych naczyń. Drugie ucho służyło jako kontrola niedokrwienna. Na stronie brzusznej każdego ucha wykonano cztery rany. Technika ta pozwala na uzyskanie 4 ran niedokrwiennych i 4 ran niedokrwiennych u jednego zwierzęcia w celu przeprowadzenia porównań sparowanych. Po zabiegu ucho niedokrwienne było chłodne i sinicze, wykazując ograniczoną ruchomość oraz brak tętna w tętnicy usznej. Temperatura skóry ucha niedokrwiennego była o 1-10 °C niższa niż w uchu prawidłowym, a różnica ta utrzymywała się przez ponad miesiąc. Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkance ucha była niższa w uchu niedokrwiennym niż w uchu kontrolnym. Czas gojenia ran był dłuższy w uchu niedokrwiennym niż w uchu niedokrwiennym przy zastosowaniu tej samej terapii. Technikę tę zastosowano już u ponad 80 królików, z czego 23 było chorych na cukrzycę (czas trwania choroby od 2 tygodni do 2 lat). U żadnego królika nie wystąpiły powikłania chirurgiczne, takie jak krwawienie, infekcja czy rozejście się nacięć skóry. Model ten posiada wiele zalet w porównaniu z innymi modelami, m.in. niewielki stopień naruszenia skóry, dłuższy czas niedokrwienia oraz wyższą skuteczność. Może być on bezpiecznie stosowany u zwierząt o obniżonej odporności i może być modyfikowany w celu spełnienia różnych wymagań badawczych.

Protokół

1. Podstawy anatomiczne

Ucho królika jest preferowanym materiałem badawczym w dziedzinie pielęgnacji ran od początku 20^th wieku. Ucho jest zaopatrywane przez trzy pęczki naczyniowe (centralny, czaszkowy i ogonowy); pęczek centralny jest największy, natomiast naczynia w pęczkach czaszkowym i ogonowym różnią się wielkością. Sporadycznie tętnica ogonowa może być nieobecna.¹ Wszystkie te naczynia są łatwo identyfikowalne po stronie grzbietowej po ogoleniu ucha (Ryc. 1). Po stronie brzusznej dystalna część skóry nie otrzymuje dopływu krwi z naczyń proksymalnych. Trzy pęczki naczyń na grzbietowej stronie ucha posiadają liczne odgałęzienia, które przenikają przez chrząstkę, aby zapewnić ukrwienie dystalnej skóry brzusznej (Ryc. 2). U niektórych królików po stronie brzusznej występuje również bardzo małe naczynie podskórne, które zaopatruje krwią nie więcej niż 1/3 skóry brzusznej. W przypadku otwartego okrężnego nacięcia skóry, z nacięcia po stronie brzusznej w zasadzie nie występuje krwawienie.

2. Procedura chirurgiczna

1. Królika waży się i ogala uszy oraz kark.
2. Na godzinę przed operacją podaje się premedykację z Buprenorfiną (0.01 mg/kg) domięśniowo (IM).
3. Znieczulenie wywołuje się mieszanką ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) podaną IM.
4. Podczas operacji królik jest chroniony podkładką grzewczą, oczy są zabezpieczone maścią, a parametry życiowe są monitorowane.
5. Pole operacyjne przygotowuje się aseptycznie za pomocą szorowania chirurgicznego i obkłada sterylnymi prześcieradłami tak, aby odsłonić oba uszy.
6. Jedno ucho zostaje poddane niedokrwieniu, natomiast drugie służy jako sparowana kontrola niedokrwienna.
7. Trzy szypuły naczyniowe identyfikuje się na podstawie tętnic i żył.
8. Za pomocą ostrza nr 15 wykonuje się trzy małe nacięcia pionowe (1-1.5 cm) na szypułach naczyniowych, około 1-2 cm od nasady ucha.
9. Żyłę środkową izoluje się od otaczających tkanek i za pomocą szwu okala się ją w celu retrakcji. Tętnicę środkową podwiązuje się szwami 4-0 i przecina.
10. Przecina się również towarzyszący nerw środkowy.
11. Całą szypułę czaszkową podwiązuje się i przecina.
12. Szypuła ogonowa zostaje zachowana.
13. Przez 3 nacięcia tworzy się tunel podskórny. Osiąga się to poprzez rozdzielanie tępym kleszczykiem oraz rozdzielanie ostrym nożem i nożyczkami. Wszystkie tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe odgałęzienia naczyniowe zostają przerwane. Małe naczynia pod skórą właściwą są całkowicie przecinane. Wszystkie tkanki podskórne wycina się ostrzem do poziomu chrząstki.
14. Dalsze rozdzielanie ostre i tępe jest stosowane w celu oczyszczenia nasady, pozostawiając odsłoniętą chrząstkę o szerokości około 5-10 mm.
15. Procedura ta przerywa wszystkie podskórne odgałęzienia naczyniowe, aby zapobiec szybkiemu tworzeniu się krążenia obocznego.
16. Krwawienie jest minimalne. Jeśli wystąpi, jest ono łatwo opanowywane poprzez ucisk gazą, bez konieczności stosowania elektrokoagulacji.
17. Skóra wewnątrz ucha nie jest silnie unaczyniona, dlatego nie wykonuje się w niej nacięć.
18. Trzy nacięcia skóry zamyka się szwami 4-0 lub 5-0 i przykrywa sterylną gazą.
19. Procedura kończy się powstaniem 3 małych nacięć skóry i wiąże się z znacznie mniejszym uszkodzeniem tkanki niż w przypadku otwartej operacji.
20. Na stronie brzusznej każdego ucha tworzy się cztery okrągłe rany skóry o pełnej grubości za pomocą 6-mm wycinaka ze stali nierdzewnej. Odległość między ranami wynosi co najmniej 20-30 mm. Skórę w obrębie rany po wycinaku usuwa się z chrząstki. Usuwa się również okostnową, wraz ze skórą lub oddzielnie. Podłożem, na którym zachodzi ziarninowanie i epitelializacja, jest chrząstka, jednak chrząstka nie zostaje przebita (Fig. 3).
21. Po zakończeniu tworzenia ran na obu uszach, lek badany nanosi się na jedną stronę dwóch ran, podczas gdy lek kontrolny nanosi się na rany po drugiej stronie. Do przykrycia miejsca rany stosuje się opatrunek okluzyjny (TegaDerm, 3M). Zapobiega to wysychaniu ran.
22. Rany w dolnej części ucha zazwyczaj goją się szybciej niż rany w górnej części ucha. W badaniach porównawczych gojenia ran zaleca się porównywanie dwóch ran po jednej stronie z dwiema ranami po drugiej stronie lub osobne porównywanie ran górnych i dolnych.

3. Opieka pooperacyjna

1. Na skórę pleców nakleja się plaster Duragesic w celu uwalniania Fentanylu (25 μg/godzinę) przez 2-3 dni, aby zredukować ewentualny ból.
2. Króliczki mają swobodny dostęp do jedzenia i picia.
3. Wymiana opatrunków odbywa się codziennie. Stare opatrunki są usuwane, a rany oczyszczane sterylnymi gazikami bawełnianymi. Wykonuje się zdjęcia cyfrowe do porównania. Nakłada się nowe opatrunki, a rany ponownie przykrywa folią TegaDerm. Podczas wymiany opatrunków znieczulenie nie jest wymagane.
4. Temperaturę skóry mierzy się codziennie na każdym uchu w celu porównania.
5. Dodatkowo ukrwienie uszu można zmierzyć za pomocą przezskórnego miernika napięcia tlenu lub laserowego florymetru Dopplera.
6. Szwy można usunąć po jednym tygodniu.
7. W przypadku zwierząt niediabetycznych większość ran ucha zazwyczaj goi się w ciągu 2-3 tygodni.

4. Potencjalne powikłania i sposoby ich unikania

Ta małoinwazyjna operacja jest bezpieczna, a powikłania występują rzadko. Poza przejściowym, łagodnym obrzękiem ucha w okresie pooperacyjnym, u żadnego z naszych królików nie wystąpiły poważne powikłania chirurgiczne. Niemniej jednak, w przypadku tej procedury istnieje kilka potencjalnych powikłań:

1. Krwawienie. Krwawienie może wystąpić w miejscach nacięć, jeśli hemostaza jest niepełna lub jeśli uszkodzone zostanie większe naczynie krwionośne (np. jedno z głównych naczyń szypuły). Można tego łatwo uniknąć dzięki uważnej dyssekcji. Oprócz trzech głównych wiązek naczyniowych istnieje wiele mniejszych podskórnych odgałęzień naczyniowych. Podczas tworzenia tunelu podskórnego naczynia te zostają przecięte, jednak podwiązywanie nie jest konieczne. Hemostazę można uzyskać poprzez proste uciskowe tamowanie gazą. Wykonuje się to, wprowadzając róg gazy do tunelu na kilka minut. Przed zamknięciem nacięcia należy upewnić się, że nie występuje aktywne krwawienie.
2. Zakażenie nacięcia i rozstąpienie się rany: Powikłania te mogą wystąpić, jeśli nacięcia zostaną zanieczyszczone. Można ich uniknąć poprzez stosowanie rygorystycznej techniki aseptyki; antybiotyki nie są wymagane. Jednak w przypadku wystąpienia zakażenia konieczny jest odpowiedni drenaż oraz wymiana opatrunków.
3. Obrzęk ucha: Ze względu na podwiązania naczyniowe i zaburzenie krążenia limfy może przez kilka dni występować łagodny obrzęk ucha. Ustępuje on jednak samoistnie i nie wymaga leczenia.

5. Reprezentatywne wyniki

Od 2007 roku zastosowaliśmy tę procedurę u ponad 70 królików, w tym u 23 zwierząt z cukrzycą. W grupie z cukrzycą zabieg przeprowadzono w różnym czasie trwania choroby: siedem królików chorowało od dwóch tygodni, cztery od dwóch miesięcy, dziesięć od 12 miesięcy, a dwa od 24 miesięcy.

Bezpośrednio po operacji niedokrwione ucho było chłodne i sinicze, z lekkim obrzękiem. Najważniejsza tętnica ucha — tętnica środkowa — wykazywała silne tętno w uchu zdrowym, natomiast tętno to nie występowało w uchu niedokrwionym. Ruchomość ucha była ograniczona, ale nie zanikła całkowicie. Na skórze widoczne były wyraźne wgłębienia nad tunelem, jednak u żadnego z zwierząt nie stwierdzono niedokrwienia ani martwicy (Rys. 4).

Temperaturę skóry uszu prawidłowych i niedokrwionych mierzono termometrem cyfrowym (Omron firmy Omron Healthcare, Bannockburn, IL, lub podczerwiennym termometrem punktowym typu K firmy Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Różnice temperatur między uchem niedokrwionym a nie-niedokrwionym wynosiły od 1 do 10 °C, przy czym u większości królików mieściły się one w przedziale 2-6 °C. Ryc. 5 przedstawia średnie różnice temperatur u 30 królików. Różnica temperatur była wyższa w pierwszych dniach po operacji, stopniowo malała po 15. dniu, ale wciąż utrzymywała się pod koniec miesiąca.

Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkankach została zmierzona u wybranych zwierząt po ich uśmierceniu. Z każdego ucha pobrano sześć próbek tkanki, a zawartość fosforanów wysokoenergetycznych zmierzono metodą HPLC. Zarówno stężenia ATP, jak i całkowita energia były wyższe w uszach prawidłowych niż w uszach niedokrwionych. Rys. 6 przedstawia przykład królika uśmierconego 23 dni po zabiegu. Średnia zawartość ATP w tkankach wynosiła 0.349±0.047 μMol/g (średnia±SD) w uchu prawidłowym w porównaniu do 0.237±0.059 μMol/g w uchu niedokrwionym (p<0.005). Średnia całkowita energia (ATP+ADP+AMP) wynosiła 0.882±0.137 μMol/g w uchu prawidłowym w porównaniu do 0.556±0.115 μMol/g w uchu niedokrwionym (p<0.001).

Czas gojenia ran był zawsze dłuższy w przypadku ucha niedokrwionego niż ucha niedokrwionego we wszystkich grupach (u królików niediabetycznych lub cukrzycowych). Rys. 7 przedstawia porównanie gojenia 26 par ran na uszach niedokrwionych i niedokrwionych. Czas gojenia wynosił od 13 do 18 dni (średnio 14,9±1,6 dni) w uszach prawidłowych w porównaniu do 17–27 dni (średnio 20,5±3,4 dni) w uszach niedokrwionych (p=0,001). Czas gojenia ran u królików starszych i cukrzycowych był znacznie dłuższy, szczególnie gdy czas trwania cukrzycy przekraczał 12 miesięcy.

U wszystkich tych królików wszystkie nacięcia zagoiły się prawidłowo i bez powikłań, w tym u królików z 24-miesięcznym okresem trwania cukrzycy. Rycina 8 przedstawia próbkę histologiczną ukazującą zagojony tunel podskórny, w którym brakuje mięśni, a ich miejsce zastąpiła tkanka włóknista. Skóra pozostaje jednak nienaruszona.

Rysunek 1. Ucho królika jest ukrwione przez trzy pęczki naczyniowe. Pęczek centralny jest największy, przedni (cranial) jest mniejszy, a pęczek tylny (caudal) jest najmniejszy. Naczynia te są łatwo widoczne na powierzchni po ogoleniu ucha.

Rysunek 2. Trzy pęczki naczyniowe na grzbiecie małżowiny usznej doprowadzają krew nie tylko do skóry grzbietowej, ale również do skóry brzusznej poprzez naczynia penetrujące. Strzałka wskazuje naczynia penetrujące przechodzące przez chrząstkę. Wstawka przedstawia przekrój poprzeczny tych naczyń.

Rysunek 3. Na brzusznej stronie ucha wykonano cztery rany o wielkości 6 mm, a następnie usunięto okrzonkę. Podłożem, na którym zachodzi granulacja i epitelializacja, jest chrząstka, która nie została jednak przebita. Trzy niewielkie nacięcia skóry zamknięto przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Rysunek 4. Po zamknięciu nacięć skóry wyraźnie widoczne jest wgłębienie nad tunelem podskórnym.

Rysunek 5. Średnia różnica temperatury skóry między uchem zdrowym a niedokrwionym u 30 królików. Wczesna różnica po operacji wynosi od 7 °C do 10 °C. Różnica ta stopniowo maleje, lecz utrzymuje się do końca pierwszego miesiąca.

Rycina 6. Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkance ucha jest obniżona w uchu z niedokrwieniem w porównaniu z uchem bez niedokrwienia 23 dni po operacji (p<0,001).

Rycina 7. Czas gojenia ran jest dłuższy w uszach izchemicznych niż w uszach nieizchemicznych (po 26 ran w każdej grupie). Gojenie definiuje się jako przywrócenie ciągłości uszkodzonej tkanki, t.j. całkowitą reepitelializację miejsc zranienia.

Rycina 8. Próbka histologiczna przedstawiająca część ucha zawierającą tunel podskórny. Wygojona tkanka jest cieńsza niż w normalnym uchu, pierwotny mięsień szkieletowy jest nieobecny i został zastąpiony przez tkanki włókniste. Jednakże skóra pozostaje nienaruszona.

Dyskusja

Cukrzyca dotyka 23,6 miliona osób w USA,^2,3 a u 15-20% tych pacjentów w ciągu życia rozwijają się owrzodzenia stóp,^4,5 co generuje roczne koszty leczenia przekraczające 25 miliardów dolarów.^3,6 Jednakże nawet najlepsze dostępne metody leczenia osiągają jedynie 50-procentowy wskaźnik gojenia, a efekt ten jest często tymczasowy,⁷ przy współczynniku nawrotów sięgającym 66% u osób z cukrzycą.^3,6 W przypadku wystąpienia owrzodzeń u pacjentów z cukrzycą gwałtownie rośnie r...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Do monitorowania podczas operacji
Mata grzewcza do utrzymania prawidłowej temperatury. Monitor przezskórnego stężenia tlenu. Monitor temperatury.
Do operacji
Skalpel nr 3 z ostrzem nr 15. Dwie pary pincet (jedna do skóry i druga do pozostałych tkanek miękkich). 2-3 pary małych kleszczyków. Jedna lub dwie pary mikro-nożyczek (do cięcia tkanek). Jedna para małych nożyczek (do przecinania szwów). Igłotrzymacz. Kilka wykonanych ze stali nierdzewnej wycinaków (do tworzenia ran).