Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Podsumowanie

Opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę tworzenia modelu rany niedokrwiennej ucha królika, dzieląc tętnicę centralną i nerw oraz pęczek nerwowo-naczyniowy czaszki. Następnie tunel podskórny przecina wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Streszczenie

Jedną z głównych przeszkód w obecnych badaniach nad ranami cukrzycowymi jest brak modelu rany niedokrwiennej, który mógłby być bezpiecznie stosowany u zwierząt z cukrzycą. Leki, które działają dobrze w ranach nieniedokrwiennych, mogą nie działać w ludzkich ranach cukrzycowych, ponieważ waskulopatia jest jednym z głównych czynników utrudniających gojenie się tych ran. W 2007 roku opublikowaliśmy artykuł opisujący model rany niedokrwiennej ucha królika stworzony za pomocą minimalnie inwazyjnej techniki chirurgicznej. Od tego czasu jeszcze bardziej uprościliśmy procedurę, aby ułatwić obsługę. Na jednym uchu wykonano trzy małe nacięcia skóry na szypułkach naczyniowych, w odległości 1-2 cm od podstawy ucha. Tętnica centralna została podwiązana i przecięta wraz z nerwem. Cała wiązka czaszki została przecięta i podwiązana, pozostawiając nienaruszoną tylko gałąź ogonową. Przez nacięcia wykonano obwodowy tunel podskórny, aby przeciąć tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe naczynia. Drugie ucho było używane jako kontrola nieniedokrwienna. Wykonano cztery rany po brzusznej stronie każdego ucha. Ta technika powoduje powstanie 4 ran niedokrwiennych i 4 ran nieniedokrwiennych u jednego zwierzęcia w celu porównania parami. Po operacji ucho niedokrwienne było chłodne i sine, wykazywało zmniejszoną ruchomość i brak tętna w tętnicy ucha. Temperatura skóry w uchu niedokrwiennym była o 1-10 °C niższa niż w uchu prawidłowym i różnica ta utrzymywała się przez ponad miesiąc. Zawartość wysokoenergetycznych fosforanów w tkance ucha była niższa w uchu niedokrwiennym niż w uchu kontrolnym. Czas gojenia się ran był dłuższy w uchu niedokrwiennym niż w uchu nieniedokrwiennym, gdy stosowano to samo leczenie. Technika ta została już zastosowana na ponad 80 królikach, z których 23 miały cukrzycę (czas cukrzycy od 2 tygodni do 2 lat). U żadnego królika nie wystąpiły żadne powikłania chirurgiczne, takie jak krwawienie, infekcja lub pęknięcie nacięć skóry. Model ma wiele zalet, takich jak niewielkie uszkodzenie skóry, dłuższy czas niedokrwienia i wyższy wskaźnik sukcesu w porównaniu z wieloma innymi modelami. Może być bezpiecznie stosowany u zwierząt o zmniejszonej odporności, a także może być modyfikowany w celu spełnienia różnych wymagań testowych.

Protokół

1. Anatomiczna podstawa

Ucho królika jest ulubionym materiałem badawczym do leczenia ran od początku^{XX wieku.} Ucho jest zaopatrywane przez trzy wiązki naczyniowe (centralną, czaszkową i ogonową); Pęczek środkowy jest największy, podczas gdy naczynia w wiązkach czaszkowych i ogonowych różnią się wielkością. Czasami tętnica ogonowa może być nieobecna. ¹ Wszystkie te naczynia można łatwo zidentyfikować po stronie grzbietowej po ogoleniu ucha (ryc. 1). Po stronie brzusznej dystalna skóra nie otrzymuje dopływu krwi z naczyń proksymalnych. Trzy wiązki naczyń na uchu grzbietowym mają liczne gałęzie, które przenikają przez chrząstkę, aby zapewnić dopływ krwi do dystalnej skóry brzusznej (ryc. 2). U niektórych królików bardzo małe naczynie podskórne występuje również po stronie brzusznej, które dostarcza krew do nie więcej niż 1/3 skóry brzusznej. W otwartym obwodowym nacięciu skóry zasadniczo nie ma krwawienia z nacięcia brzusznego.

2. Zabieg chirurgiczny

1. Królik jest ważony, a uszy są golone wraz z tyłem szyi.
2. Premedykację w postaci buprenorfiny (0,01 mg/kg) podaje się domięśniowo na godzinę przed zabiegiem chirurgicznym.
3. Znieczulenie wywołuje mieszanina ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) domięśniowo.
4. Podczas operacji królik jest chroniony poduszką grzewczą, oczy są chronione maścią, a jego parametry życiowe są monitorowane podczas operacji.
5. Pole operacyjne jest przygotowywane aseptycznie za pomocą chirurgicznego peelingu i udrapowane tak, aby dwoje uszu było odsłoniętych.
6. Jedno ucho jest niedokrwione, podczas gdy drugie ucho służy jako sparowana kontrola nieniedokrwienna.
7. Trzy szypułki naczyniowe są identyfikowane przez tętnice i żyły.
8. Za pomocą ostrza #15 wykonuje się trzy małe pionowe nacięcia (1-1,5 cm) na szypułkach naczyniowych, około 1-2 cm od podstawy ucha.
9. Żyła centralna jest izolowana od otaczających tkanek, a szew służy do jej otoczenia w celu wycofania. Tętnica centralna jest podwiązana szwami 4-0 i podzielona.
10. Towarzyszący nerw centralny jest również przecięty.
11. Cała szypułka czaszki jest podwiązana i podzielona.
12. Szypułka ogonowa jest zachowana.
13. Przez 3 nacięcia wykonuje się tunel podskórny. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie za pomocą zacisku i ostre sekcje nożem i nożyczkami. Wszystkie tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe gałęzie naczyniowe zostają odstawione. Małe naczynia krwionośne pod skórą właściwą są całkowicie podzielone. Wszystkie tkanki podskórne są przycinane do poziomu chrząstki za pomocą ostrza.
14. Dalsze ostre i sekcje stosuje się do oczyszczenia podstawy, pozostawiając gołą chrząstkę o szerokości około 5-10 mm.
15. Ta procedura przerywa wszystkie podskórne gałęzie naczyniowe, aby zapobiec ich szybkiemu tworzeniu się pobocznych.
16. Krwawienie jest minimalne. Jeśli takowe występują, można je łatwo kontrolować za pomocą kompresji gazy, bez konieczności elektrokoagulacji.
17. Skóra wewnątrz ucha nie jest ukrwiona, a zatem nie jest nacięta.
18. 3 nacięcia skóry są zamykane za pomocą szwów 4-0 lub 5-0 i przykrywane sterylną gazą.
19. Zabieg skutkuje 3 małymi nacięciami skóry i powoduje znacznie mniejsze uszkodzenia skóry niż operacja otwarta.
20. Cztery okrągłe rany skóry o pełnej grubości są tworzone po brzusznej stronie każdego ucha za pomocą 6-milimetrowego stempla ze stali nierdzewnej. Odległość między ranami wynosi co najmniej 20-30 mm. Skóra wewnątrz rany po przebiciu jest usuwana z chrząstki. Perichondrium jest również usuwane, wraz ze skórą lub osobno. Podłożem, na którym zachodzi ziarninacja i nabłonkowanie, jest chrząstka, ale chrząstka nie jest perforowana (ryc. 3).
21. Po zakończeniu leczenia ran na obu uszach, badany lek nakłada się na jedną stronę dwóch ran, podczas gdy lek kontrolny nakłada się na rany po drugiej stronie. Do pokrycia miejsca rany stosuje się opatrunek okluzyjny (TegaDerm, 3M). Zapobiega to wysuszaniu się ran
.
22. Rany w dolnej części ucha zwykle goją się szybciej niż rany w górnej części ucha. W przypadku badania porównawczego gojenia się ran zaleca się porównanie dwóch ran po jednej stronie z dwiema ranami po drugiej stronie lub porównanie ran górnych i dolnych osobno.

3. Opieka pooperacyjna

1. Plaster Duragesic jest przymocowany do skóry pleców, aby uwolnić fentanyl (25 μg / godzinę) przez 2-3 dni w celu zmniejszenia ewentualnego bólu.
2. Króliki mają swobodny dostęp do jedzenia i picia.
3. Zmiany opatrunków odbywają się codziennie. Stare opatrunki są usuwane, a rany oczyszczane są sterylnymi wacikami. Zdjęcia cyfrowe są robione w celu porównania. Zakładane są nowe opatrunki, a rany są ponownie pokrywane za pomocą TegaDerm. Podczas zmiany opatrunku nie jest potrzebne znieczulenie.
4. Temperatura skóry jest mierzona codziennie na każdym uchu dla porównania.
5. Dodatkowe krążenie krwi w uchu można zmierzyć za pomocą przezskórnego miernika napięcia tlenu lub laserowego przepływomierza dopplerowskiego.
6. Szwy można usunąć po tygodniu.
7. W przypadku zwierząt bez cukrzycy większość ran ucha goi się zwykle w ciągu 2-3 tygodni.

4. Potencjalne komplikacje i jak ich uniknąć

Ta minimalnie inwazyjna operacja jest bezpieczna, a powikłania są rzadkie. Z wyjątkiem przejściowego pooperacyjnego łagodnego obrzęku ucha, żaden z naszych królików nie miał żadnych poważnych powikłań chirurgicznych. Niemniej jednak istnieje kilka potencjalnych powikłań związanych z tą procedurą:

1. krwawienie. Krwawienie może wystąpić w nacięciach, jeśli hemostaza jest niepełna lub jeśli większe naczynie krwionośne (takie jak jedno z głównych naczyń szypułkowych) jest uszkodzone. Można tego łatwo uniknąć poprzez staranną sekcję. Oprócz trzech głównych wiązek naczyniowych istnieje wiele mniejszych podskórnych gałęzi naczyniowych. Po wykonaniu tunelu podskórnego naczynia te są cięte, ale nie jest konieczne wiązanie. Hemostazę można osiągnąć po prostu przez prasowanie gazą. Można to łatwo zrobić, wkładając róg gazy do tunelu na kilka minut. Przed zamknięciem nacięcia upewnij się, że nie ma aktywnego krwawienia.
2. Zakażenie nacięciem i rozejście się: Powikłania te mogą wystąpić, jeśli nacięcia są zanieczyszczone. Można tego uniknąć, stosując rygorystyczną technikę aseptyczną i nie jest potrzebny antybiotyk. Jeśli jednak dojdzie do infekcji, konieczna jest odpowiednia zmiana drenażu i opatrunku.
3. Obrzęk ucha: Z powodu podwiązania naczyń krwionośnych i zaburzenia krążenia limfy, łagodny obrzęk ucha może utrzymywać się przez kilka dni. Jednak znika samoistnie i nie jest konieczne żadne leczenie.

5. Reprezentatywne wyniki

Od 2007 roku zastosowaliśmy tę procedurę u ponad 70 królików, w tym u 23 zwierząt z cukrzycą. W grupie chorych na cukrzycę operację przeprowadzono w różnym czasie cukrzycy: siedem królików miało dwa tygodnie cukrzycy, cztery z nich dwa miesiące, dziesięć 12 miesięcy, a 2 24 miesiące cukrzycy.

Bezpośrednio po operacji, niedokrwienne ucho wydawało się chłodne i sine, z łagodnym obrzękiem. Najważniejsza tętnica ucha - tętnica centralna - miała silny puls w uchu normalnym, ale ten puls nie był obecny w uchu niedokrwiennym. Ruch uszu został zmniejszony, ale nie zniknął całkowicie. Na skórze widoczne były wyraźne wgłębienia nad tunelem, ale u żadnego zwierzęcia nie stwierdzono niedokrwienia ani martwicy (ryc. 4).

Temperatura skóry w uszach normalnych i niedokrwiennych została zmierzona za pomocą termometru cyfrowego (Omron firmy Omron Healthcare, Bannockburn, IL, lub termometru punktowego na podczerwień typu K firmy Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Różnice temperatur między uchem niedokrwiennym a niedokrwiennym wynosiły od 1 do 10 °C, przy czym większość królików mieściła się w przedziale 2-6 °C. Ryc. 5 przedstawia średnie różnice temperatur między 30 królikami. Różnica temperatur była większa w pierwszych dniach po operacji, zmniejszała się stopniowo po 15 dniu, ale utrzymywała się nadal pod koniec jednego miesiąca.

Zawartość wysokoenergetycznych fosforanów w tkankach została zmierzona u niektórych zwierząt po ich uśmierceniu. Z każdego ucha pobrano sześć próbek tkanek i zmierzono zawartość wysokoenergetycznych fosforanów za pomocą HPLC. Zarówno ATP, jak i całkowite stężenie energii były wyższe w uszach prawidłowych niż w uszach niedokrwiennych. Ryc. 6 przedstawia przykład królika uśmierconego 23 dni po operacji. Średnia zawartość ATP w tkance wynosiła 0,349±0,047 μMol/g (średnia±SD) w uchu prawidłowym w porównaniu z 0,237±0,059 μMol/g w uchu niedokrwiennym (p<0,005). Średnia energia całkowita (ATP+ADP+AMP) wynosiła 0,882±0,137 μMol/g w uchu prawidłowym vs. 0,556±0,115 μMol/g w uchu niedokrwiennym (p<0,001).

Czas gojenia się ran był zawsze dłuższy dla ucha niedokrwiennego niż dla ucha niedokrwiennego we wszystkich grupach (bez cukrzycy lub cukrzycy). Ryc. 7 przedstawia porównanie gojenia się 26 par ran na uszach niedokrwiennych i nieniedokrwiennych. Czas gojenia wahał się od 13 do 18 dni (średnio 14,9±1,6 dnia) w przypadku zdrowych uszu w porównaniu z 17 do 27 dni (średnio 20,5±3,4 dnia) w uszach niedokrwionych (p = 0,001). Czas gojenia się ran u królików w podeszłym wieku i z cukrzycą był znacznie dłuższy, zwłaszcza gdy czas leczenia cukrzycy wynosił ponad 12 miesięcy.

U tych królików wszystkie rany zagoiły się normalnie bez żadnych komplikacji, w tym u królików z 24-miesięcznym okresem cukrzycy. Rycina 8 to próbka histologiczna przedstawiająca zagojony tunel podskórny, w którym mięśnie są nieobecne i są zastąpione tkankami włóknistymi. Jednak skóra jest nienaruszona.

Rysunek 1. Ucho królika jest zaopatrywane przez trzy wiązki naczyniowe. Środkowa jest największa, czaszka jest mniejsza, a wiązka ogonowa jest najmniejsza. Naczynia te są łatwo widoczne na powierzchni po ogoleniu ucha.

Rysunek 2. Trzy wiązki naczyń na uchu grzbietowym dostarczają krew nie tylko do skóry grzbietowej, ale także do skóry brzusznej przez naczynia penetrujące. Strzałka pokazuje naczynia penetrujące przez chrząstkę. Wstawka przedstawia przekrój tych naczyń.

Rysunek 3. Po brzusznej stronie ucha powstają cztery rany o średnicy 6 mm, usuwa się również okołochrzęstne. Podstawą, na której zachodzi ziarninowanie i nabłonkowanie, jest chrząstka, ale chrząstka nie jest perforowana. 3 małe nacięcia skóry są zamknięte przy bardzo niewielkim naruszeniu skóry.

Rysunek 4. Po zamknięciu nacięć skórnych wyraźnie widoczne jest wgłębienie nad tunelem podskórnym.

Rysunek 5. Średnia różnica temperatur skóry między uchem normalnym a niedokrwiennym u 30 królików. Wczesna różnica waha się od 7 °C do 10 °C po zabiegu. Różnica zmniejsza się stopniowo, ale nadal utrzymuje się pod koniec miesiąca.

Rysunek 6. Zawartość wysokoenergetycznych fosforanów w tkance ucha jest zmniejszona w uchu niedokrwiennym w porównaniu z uchem nieniedokrwiennym po 23 dniach od operacji (p<0,001).

Rysunek 7. Czas gojenia się ran w uszach niedokrwiennych jest dłuższy niż w uszach nieniedokrwiennych (po 26 ran każda). Gojenie definiuje się jako przywrócenie integralności uszkodzonej tkanki, tj. całkowitą reepitelializację miejsc rany.

Rysunek 8. Próbka histologiczna przedstawiająca część ucha zawierającą tunel podskórny. Zagojona tkanka jest cieńsza niż normalne ucho, pierwotny mięsień szkieletowy jest nieobecny i zostaje zastąpiony tkankami włóknistymi. Jednak skóra jest nienaruszona.

Dyskusja

Cukrzyca dotyka 23,6 miliona ludzi w ^USA,2,3 a 15-20% tych pacjentów rozwija owrzodzenia stóp w ciągu swojego ^życia,4,5 przy rocznym koszcie leczenia wynoszącym ponad 25 miliardów dolarów. ^Jednak nawet najlepsze dostępne metody leczenia osiągają tylko 50% wskaźnik wyleczenia i jest to często tymczasowe,7 a odsetek nawrotów sięga nawet 66% u diabetyków. ^3,6 Gdy u pacjentów z cukrzycą występują wrzody, poważne powikłania, takie jak zakażenie i amputacja, gwałtownie wzr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Do monitorowania podczas operacji
Poduszka grzewcza do utrzymania normalnej temperatury. A przezskórny monitor tlenu. Monitor temperatury.
Do operacji
Nóż #3 z ostrzem #15. Dwie pary kleszczy (jedna do skóry, a druga do innych tkanek miękkich). 2-3 pary małych zacisków. Jedna lub dwie pary mikronożyczek (do cięcia tkanek). Jedna para małych nożyczek (do cięcia szwów). Uchwyt na igłę. Kilka stempli ze stali nierdzewnej (do robienia ran).