Artykuł metodologiczny

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

31.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3373

⸱

2 listopada 2011

 ,  ,  , 
1Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Streszczenie

Peptoidy to nowa klasa biomimetycznych, nienaturalnych, sekwencyjnie specyficznych heteropolimerów, które wykazują odporność na proteolizę, posiadają silną aktywność biologiczną i zwijają się w nanostruktury wyższego rzędu. Peptoidy, strukturalnie podobne do peptydów, są poliglicynami N-podstawionymi, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Łatwość ich syntezy oraz różnorodność strukturalna umożliwiają testowanie podstawowych zasad projektowania w celu opracowania de novo i inżynierii nowych materiałów nanostrukturalnych i biologicznie aktywnych.

W niniejszym materiale przedstawiono prosty protokół ręcznej syntezy peptoidów, który umożliwia otrzymywanie długołańcuchowych polypeptoidów (do 50merów) z doskonałą wydajnością. Wymagane jest jedynie podstawowe wyposażenie, proste techniki (np. przenoszenie cieczy, filtracja) oraz komercyjnie dostępne odczynniki, co czyni peptoidy przystępnym uzupełnieniem instrumentarium wielu badaczy. Szkielet peptoidu jest budowany po jednym monomerze przy użyciu metody submonomerowej, która składa się z dwuetapowego cyklu dodawania monomeru: acylacji i substytucji. Najpierw kwas bromooctowy, aktywowany in situ za pomocą N,N'-diizopropylokarbodiimidu, acyluje aminę drugorzędową związaną z żywicą. Następnie następuje nukleofilowe wyparcie bromku przez aminę pierwszorzędową w celu wprowadzenia łańcucha bocznego. Dwuetapowy cykl jest powtarzany do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha. Wydajność sprzęgania w tym dwuetapowym cyklu rutynowo przekracza 98% i umożliwia syntezę peptoidów o długości do 50 reszt. Metoda submonomerowa pozwala na uzyskanie wysoce dostrajalnych, precyzyjnych i chemicznie zróżnicowanych sekwencji, ponieważ bezpośrednio można w nich włączyć setki łatwo dostępnych amin pierwszorzędowych.

Peptoidy stają się wszechstronnym materiałem biomimetycznym w badaniach z zakresu nanobionauki ze względu na ich elastyczność syntetyczną, trwałość oraz uporządkowanie na poziomie atomowym. Niedawno wykazano możliwość fałdowania jednowątkowego, amfifilowego i bogatego w informacje polypeptoidu w wysoce uporządkowaną nanowarstwę. Peptoid ten jest 36-merem składającym się z zaledwie trzech różnych, dostępnych komercyjnie monomerów: hydrofobowego, kationowego i anionowego. Hydrofobowe łańcuchy boczne fenyloetylowe są ukryte w rdzeniu nanowarstwy, natomiast jonowe łańcuchy boczne aminowe i karboksylowe ustawiają się na powierzchniach hydrofilowych. Nanowarstwy peptoidowe służą jako potencjalna platforma dla mimetyków błon, mimetyków białek, produkcji urządzeń oraz sensorów. Opisane metody syntezy peptoidów, tworzenia warstw oraz obrazowania mikroskopowego stanowią prostą metodę umożliwiającą przyszłe projektowanie nanowarstw peptoidowych.

Protokół

1. Synteza polypeptoidów na fazie stałej z submonomerów

Synteza na fazie stałej (SPS) jest powszechną techniką stosowaną do etapowego otrzymywania biopolimerów o określonej sekwencji, bezpośrednio na obojętnym nośniku stałym, takim jak polimerowe koraliki żywicy. Głównymi zaletami SPS są wysokie wydajności sprzęgania oraz łatwość usuwania nadmiaru reagentów. Po reakcji sprzęgania z żywicą nadmiar odczynników jest po prostu odprowadzany, a koraliki są płukane w celu przygotowania ich do kolejnego etapu reakcji. Po końcowej reakcji syntezy pełnowymiarowe oligomery są odcinane od żywicy, a materiał w fazie roztworu może być dalej badany. W niniejszej pracy adaptujemy procedurę SPS w celu wytworzenia polimerów peptoidowych o określonej sekwencji.

  1. Przygotowanie: Wszystkie etapy manualnej syntezy peptoidów można przeprowadzić w jednorazowym wkładzie z porowatego polipropylenu (PP) lub w szklanym naczyniu reakcyjnym z fritą, wyposażonym w kran trójdrożny. Wszystkie operacje należy wykonywać w dygestorium. W przypadku inkubacji w naczyniu szklanym lub plastikowym wkładzie, należy podłączyć jedno ramię do źródła azotu, aby delikatnie napowietrzać roztwór w celu zapewnienia właściwego mieszania. Alternatywnie, w przypadku inkubacji reakcji w jednorazowym wkładzie, należy zamknąć oba końce wkładu zaślepkami i umieścić go na wytrząsarce rotacyjnej. Aby odessać mieszaniny reakcyjne lub płuczyny, należy podłączyć naczynie do próżni laboratoryjnej poprzez pułapkę na odpady. Naczynie powinno posiadać fritę o grubych porach. Należy zylikonyzować szklane naczynie reakcyjne, aby zapobiec przywieraniu kuleczek żywicy do ścianek. Przygotować roztwór 5% dichlorodimetylosilanu w dichloroetanie (v/v). Czyste i suche naczynie reakcyjne należy wypełnić do pełna roztworem do zylikonyzowania, pozostawić na 30 minut, a następnie opróżnić. Naczynie należy przemyć raz DCE, a następnie raz metanolem. Roztwór do zylikonyzowania można wykorzystać ponownie, dlatego należy go zachować. Po wyjęciu kranu należy wysuszyć szkło na powietrzu lub strząsnąć nadmiar roztworu i wypalić w piecu do całkowitego wyschnięcia. Naczynie reakcyjne należy schłodzić przed dodaniem żywicy.
  2. Do naczynia reakcyjnego z fritą dodać 100 mg (0.06 mmol) żywicy Rink amide. Napompować żywicę, dodając 2 mL dimetyloformamidu (DMF). Mieszać poprzez wytrząsanie lub napowietrzanie przez 10 minut. Odessać roztwór za pomocą próżni, aby wyizolować napompowaną żywicę.
  3. Dodać 1 mL 20% 4-metylopiperydyny w DMF (v/v), aby zdeprotektować grupę Fmoc. Mieszać przez 2 minuty, a następnie odessać. Powtórzyć czynność, inkubując przez 12 minut.
  4. Przepłukać żywicę, dodając 2 mL DMF, mieszając przez 15 sekund i odsysając. Powtórzyć 3x.
  5. Bromoacetylacja: Dodać 1 mL 0.6 M kwasu bromooctowego (0.6 mmol) w DMF oraz 86 μL N,N'-diizopropylowokarbodiimidu (0.93 ekwiwalentu, 0.56 mmol). Inkubować przy delikatnym napowietrzaniu przez 30 minut, a następnie odessać i przepłukać 2 mL DMF (powtórzyć 4x).
  6. Podstawienie: Dodać 1 mL 1-2 M aminy w N-metylopirolidonie. Inkubować z napowietrzaniem przez 30-120 minut, a następnie odessać i przepłukać DMF (4x 2 mL).
  7. Kontynuować wydłużanie łańcucha peptoidu poprzez powtarzanie cyklu submonomerowego: kroków 1.5 (bromoacetylacja) i 1.6 (podstawienie).
  1. Po wykonaniu ostatniej substytucji przemyć 2 mL DMF (powtórzyć 4x), a następnie 2 mL dichlorometanu (powtórzyć 3x). Zamknąć naczynie reakcyjne i przechowywać do czasu odszczepienia.
  2. Przerwa w syntezie (opcjonalnie): Aby przerwać syntezę peptoidu, należy zakończyć reakcję substytucji i przejść do kroku 1.8. Aby kontynuować wydłużanie łańcucha peptoidu, należy wznowić syntezę poprzez ponowne napęcznienie wysuszonej żywicy (krok 1.2) i powtórzenie cyklu submonomeru (kroki 1.5 i 1.6). Żywicę można wysuszyć i przechowywać po każdej substytucji z wyjątkiem drugiej, ponieważ koniugat żywica-peptoid może utworzyć cykliczny produkt uboczny w postaci diketopiperazyny.
  3. W przypadku wielu równoległych syntez zaleca się stosowanie próżniowego manifoldu do ekstrakcji w fazie stałej w celu maksymalizacji wydajności. Synteza peptoidów może być również zautomatyzowana poprzez odpowiednie zaprogramowanie metod w dostępnych komercyjnie syntezatorach peptydów, takich jak Aapptec Apex 396, syntezator mikrofalowy CEM Liberty oraz syntezator Protein Technologies Inc. Prelude.

2. Odszczepianie i deprotekcja łańcuchów bocznych

  1. Przenieś całą wysuszoną żywicę do 20 mL szklanej fiolki scyntylacyjnej.
  2. Pracując w dygestorium i stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej, dodaj 4 mL koktajlu odszczepiającego na bazie kwasu trifluorooctowego (TFA)1 (np. 95% wodny TFA, patrz dyskusja) do szklanej fiolki scyntylacyjnej i szczelnie zakręć. Wstrząsaj od 10 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej (patrz dyskusja).
  3. Zbierz roztwór po odszczepieniu TFA, filtrując żywicę przez jednorazowy wkład z frity PP do nowej, uprzednio zważonej 20 mL szklanej fiolki scyntylacyjnej. Do przenoszenia roztworów koktajlu odszczepiającego wygodnie jest użyć jednorazowej pipety PP.
  4. Dodaj 1 mL świeżego koktajlu odszczepiającego, aby wypłukać żywicę i zebrać pozostały peptoid. Powtórz 2x.
  5. Odparuj TFA, kierując łagodny strumień azotu lub używając ewaporatora Biotage V10.
  6. Rozpuść surowy olej w 6 mL mieszaniny acetonitrylu/wody 1:1 (v/v) do analizy HPLC. Zamroź i liofilizuj. Powtórz proces.
  7. Zanotuj masę surowego produktu. Przechowuj w formie suchego proszku w temperaturze -20 °C.
  8. Odszczepienie testowe (opcjonalnie): Można przeprowadzić odszczepienie testowe na 0,5% żywicy, aby szybko określić czystość i masę zsyntetyzowanego peptoidu oraz sprawdzić, czy wybrano prawidłowe warunki odszczepiania. Odszczepienia testowe są szczególnie przydatne do monitorowania postępów syntezy.

3. Charakterystyka i oczyszczanie polipeptoidu

  1. Za pomocą analitycznej HPLC, LC-MS z jonizacją elektrorsprajową i/lub MALDI-TOF określ czystość produktu surowego oraz sprawdź, czy uzyskano pożądaną masę cząsteczkową.
  2. Przygotuj roztwór suchego proszku peptoidowego o stężeniu ˜5-10 mg/mL w wodzie z minimalną ilością acetonitrylu, jeśli jest to konieczne dla zapewnienia rozpuszczalności. Przefiltruj klarowny roztwór surowego produktu peptoidowego za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia cząsteczkowe.
  3. Analityczna HPLC i LC-MS z jonizacją elektrorsprajową: Przygotuj roztwór surowego peptoidu o stężeniu ˜ 20 μg/mL. Przefiltruj 200 μL za pomocą filtra 0,45 μm i wstrzyknij 20 μL.
  4. MALDI: Wymieszaj 1 μL peptoidu o stężeniu ˜20 mg/mL z 1 μL matrycy. Nanieś 1 μL na płytkę MALDI i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Dobór matrycy i trybu akwizycji zależy od próbki (Rys. 5).
  5. Oczyść surową mieszaninę peptoidową za pomocą preparatywnej HPLC w odwróconej fazie. Dobierz gradient i kolumnę (C4 lub C18) na podstawie hydrofobowości polipeptoidu. Połącz oczyszczone frakcje, zamroź i liofilizuj, aż do uzyskania puszystego białego proszku. Zważ końcowy produkt.
  6. Tworzenie soli HCl (opcjonalnie): Ponownie rozpuść liofilizowany proszek w 100 mM HCl (aq.) z minimalną ilością acetonitrylu. Przenieś do wcześniej zważonej szklanej fiolki. Zamroź i ponownie liofilizuj. Powtórz czynność 2x. Zważ ponownie, aby określić masę proszku peptoidowego.

4. Formowanie nanoarkuszy peptydowych

Niniejsza sekcja opisuje protokół tworzenia arkuszy z jednowątkowego, sekwencyjnie specyficznego, amfifilowego 36-meru peptoidu (Rys. 1). Po syntezie, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptoidu zgodnie z powyższym opisem, otrzymany biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu przygotowania roztworu stokowego o stężeniu 2 mM.

  1. Przygotuj 500 μL 20 μM roztworu peptoidu w buforze do formowania arkuszy (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 w wodzie) w szklanej fiolce o pojemności 1 drama. Najpierw dodaj 445 μL wody Milli-Q, 50 μL 10x buforu do formowania arkuszy i wymieszaj za pomocą wortexa. Następnie dodaj 5 μL 2 mM roztworu zapasu peptoidu i delikatnie zamieszaj roztwór. Zamknij fiolkę nakrętką.
  2. Arkusze powstają poprzez delikatne wstrząsanie rozcieńczonego wodnego roztworu peptoidu. Powolne przechylanie szklanej fiolki z pozycji poziomej do pionowej prowadzi do powstania arkuszy. Delikatne potrząsanie również pozwala uzyskać arkusze, jednak mają one tendencję do bycia mniejszymi i posiadania mniejszej liczby prostych krawędzi. Bardziej szczegółowa analiza mechanizmu formowania arkuszy została opisana w oddzielnej publikacji.2
  3. Aby uzyskać wiele wysokiej jakości arkuszy, obracaj szklane fiolki wokół osi poziomej powoli (<1 RPM) przez okres od jednego do trzech dni. Do ciągłego prowadzenia tego procesu można wykorzystać rotator do probówek Appropriate Technical Resources RKVSD Rotamix lub dostosowaną kołysarkę.
  4. Dializa nanoarkuszy (opcjonalnie): W niektórych zastosowaniach może być konieczne usunięcie wolnych łańcuchów peptoidów lub buforów/soli. Namocz membranę Float-a-Lyzer 100 kD w wybranym buforze przez 15 minut. Wprowadź 500 μL roztworu arkuszy peptoidu do komory z próbką. Namocz w 500 mL wybranego buforu, mieszając za pomocą magnetycznego mieszadła z prędkością 60 rpm. Pozostaw arkusze do dializy na 4 godziny. Co godzinę wymieniaj roztwór buforu na świeży.

5. Mikroskopia fluorescencyjna nanoarkuszy

  1. Obrazy fluorescencyjne nanoarkuszy wykonano z użyciem Nile Red, barwnika wrażliwego na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta po zlokalizowaniu w środowiskach hydrofobowych (Ryc. 2).
  2. Do 100 μL roztworu nanoarkuszy dodać 1 μL Nile Red o stężeniu 100 μM, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM Nile Red.
  3. Przygotować 1% roztwór agarozy w gorącej wodzie i wlać go do plastikowej szalki Petriego. Należy upewnić się, że roztwór agarozy ma grubość około 1/8 cala, a następnie pozostawić go do ostygnięcia na płaskiej powierzchni bez zakłócania. Po zastygnięciu agarozy wyciąć szpatułką kwadraty o wymiarach 1 cm x 1 cm i przenieść je na szkiełko przedmiotowe.
  4. Aby zebrać arkusze w jednej płaszczyźnie, nanieść 1 μL roztworu arkuszy na fragment agarozy. Pozostawić agarozę na 2 minuty w celu absorpcji buforu, co spowoduje pozostanie arkuszy na powierzchni. Obrazy należy wykonać w ciągu 15 minut, w przeciwnym razie agaroza zacznie się deformować wskutek odwodnienia.
  5. W celu obrazowania arkuszy w roztworze, nanieść 15 μL wewnątrz uszczelki o średnicy 20 mm i grubości 0,12 mm na szkiełku przedmiotowym. Przykryć szkiełkiem nakrywką. Jeśli arkusze zostaną po prostu uciśnięte między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką bez użycia uszczelki, wiele arkuszy ulegnie ścinaniu, a pozornie niewielkie parowanie spowoduje ich ciągły ruch.
  6. Obrazować arkusze przy oświetleniu epifluorescencyjnym (np. za pomocą odwróconego mikroskopu Olympus IX81 wyposażonego w kamerę EMCCD Andor iXonEM+ z filtrem Texas red).

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nanoarkuszy

  1. Trawienie plazmowe podłoża krzemowego (opcjonalnie): Chip krzemowy poddawany jest trawieniu plazmowemu w celu ułatwienia adsorpcji arkuszy. Chip krzemowy umieszcza się w komorze próżniowej oczyszczacza plazmowego (np. Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G). Obniża się ciśnienie do 200 mTorr i ustawia cewkę RF na 18W (wysokie ustawienie dla modelu PDC-32G). Trawienie trwa 2 minuty.
  2. Należy nanieść 20 μL roztworu arkuszy peptoidowych na podłoże krzemowe potraktowane plazmą. Pozostawić na 3 minuty. Nadmiar roztworu należy usunąć końcówką chusteczki Kim-wipe. Następnie należy nanieść pipetą 20 μL wody na powierzchnię i ponownie usunąć nadmiar cieczy, aby wypłukać bufor i sole. Czynność tę powtarza się 4x.
  3. Alternatywnie można poddać roztwory arkuszy peptoidowych dializie przeciwko wodzie w celu usunięcia buforu i soli. Należy nanieść 20 μL zdializowanego roztworu arkuszy na podłoża krzemowe potraktowane plazmą. Próbkę należy wysuszyć na powietrzu.
  4. Obrazowanie arkuszy wykonuje się za pomocą SEM (np. Zeiss Gemini Ultra-55 Analytical Scanning Electron Microscope) z detektorem in-lens i przy energiach wiązki od 1 kV do 5 kV (Ryc. 3).

7. Uwagi dotyczące bezpieczeństwa:

  1. Dimetylformamid i dichlorometan są uznawane za prawdopodobne substancje rakotwórcze.
  2. N,N'-diizopropylokarbodiimid, 4-metylopiperydyna i kwas bromooctowy są niebezpieczne dla skóry, oczu i dróg oddechowych. Należy ich używać z zachowaniem ostrożności pod wyciągiem. Mogą być toksyczne w przypadku wdychania lub wchłonięcia przez skórę, a ekspozycja na nie może prowadzić do uczulenia. Puste pojemniki zawierają pozostałości produktu (ciecz/opary) i powinny zostać dokładnie wypłukane przed wyjęciem z wyciągu.
  3. TFA jest silnym kwasem i jest niezwykle niszczycielski dla górnych dróg oddechowych, oczu i skóry. TFA jest również lotny – skoncentrowane roztwory TFA należy przechowywać pod wyciągiem przez cały czas, aby uniknąć uszkodzenia dróg oddechowych. Podczas pracy z roztworami TFA należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i zachować ostrożność. W przypadku kontaktu rękawiczek z TFA należy je bezzwłocznie wymienić, a wszelkie wycieki natychmiast usunąć.

8. Reprezentatywne wyniki:

W tej sekcji opisano syntezę, charakterystykę i oczyszczanie specyficznego dla sekwencji 36-merowego łańcucha peptoidowego, który zwija się w wysokouporządkowaną nanopłatkę3 (Rys. 1).

Peptoid blokowy o ładunku H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2 został zsyntetyzowany na 100 mg żywicy Rink amide. Do wszystkich reakcji substytucyjnych wykorzystano 2 M roztwór aminy; reakcje przeprowadzano przez 60 minut dla reszt 1-18 oraz przez 120 minut dla reszt 19-36. t-Butylo-beta-alaninę HCl przekształcono w wolną zasadę (patrz dyskusja), natomiast fenetyloaminę i boc-etylenodiaminę zastosowano bezpośrednio. Żywicę odcięto za pomocą 95% TFA, 2,5% triizopropylosilanu i 2,5% wody przez 2 godziny. TFA odparowano, a otrzymany lepki olej (~180 mg) ponownie rozpuszczono w 6 mL mieszaniny acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v). Czystość produktu (Ryc. 4) oraz obecność masy produktu potwierdzono za pomocą analitycznej RP-HPLC (gradient 30-80% acetonitrylu w wodzie, oba roztwory zawierające 0,1% (v/v) TFA, przy przepływie 1 mL/min przez 30 minut w temperaturze 60 °C, przy użyciu kolumny C18, 5 μm, 50 X 2 mm) oraz MALDI (Ryc. 5).

Przeprowadzono oczyszczanie metodą odwróconej fazy HPLC na kolumnie Vydac C18 (10 μm, 22 mm x 250 mm), stosując gradient 30-60% acetonitrylu w wodzie z 0,1% TFA w czasie 60 minut przy przepływie 10 mL/min. Na kolumnę nanoszono 60 mg produktu surowego dla każdego przebiegu chromatograficznego. Oczyszczone frakcje połączono na podstawie czystości określonej za pomocą analitycznej RP-HPLC (Rys. 4) i liofilizowano, otrzymując ˜80 mg puszystego białego proszku.

Masa cząsteczkowa oczyszczonego peptoidu o blokowym ładunku została potwierdzona metodą MALDI. 1 μL oczyszczonego peptoidu o stężeniu 100 μM w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 (v/v) zmieszano z 1 μL matrycy (5 mg/mL kwasu α-cyjanowo-4-hydroksycynamowego w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 v/v oraz 0,1% TFA), a następnie 1 μL naniesiono na płytkę MALDI. Po wyschnięciu próbki na powietrzu umieszczono ją w analizatorze Applied Biosystem/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF. Tryby akwizycji i przetwarzania danych ustawiono na liniowy dla niskich mas. Obliczoną masę wpisano w polu masy docelowej, aby automatycznie dostosować czas opóźnienia. Intensywność lasera ustawiono na 3400. Obserwowana masa, 4981,2, jest bliska obliczonej masie 4981,74.

Liofilizowany oczyszczony proszek rozpuszczono w DMSO w celu przygotowania roztworu zapasu o stężeniu 2 mM, który można przechowywać w temperaturze 4 °C. Arkusze przygotowano zgodnie z wyżej wspomnianym protokołem, a następnie obrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej oraz SEM (Rys. 2 i 3). Zaobserwowano różnorodne kształty o rozmiarach cech dochodzących do 300 μm, przy czym szczególnie wyróżniają się proste krawędzie.

Struktura chemiczna polimerów peptydowych; schemat formuły syntezy poliamidu.
Rysunek 1. Sekwencja blokowo-naładowanego peptoidu H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2. Jednołańcuchowy, blokowo-naładowany, amfifilowy 36-mer polypeptoid ulega samozbiorce w wysoce uporządkowane, dwuwymiarowe nanoarkusze3. Obliczona masa cząsteczkowa wynosi 4981,74.

Mikroskopia fluorescencyjna krystalograficzna czerwonych kryształów; analiza strukturalna i badanie morfologii.
Rysunek 2. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej nanoarkuszy peptoidowych. Arkusze utworzono z 20 μM roztworu peptoidu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0. Arkusze obrazowano na agarozie z 1μM Nile Red. Paski skali oznaczają 100 μm.

Wariacje fałd grafenu inspirowane origami; obrazy z mikroskopii; analiza strukturalna.
Rycina 3. Obrazy z mikroskopii elektronowej skaningowej nanoarkuszy peptoidowych. Arkusze utworzono z 20 μM roztworu peptoidu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0. Paski skali wynoszą 5 μm.

Chromatogram HPLC, czas retencji vs absorbancja, przedstawiający analizę produktu oczyszczonego w porównaniu z surowym.
Rycina 4. Analityczny zapis HPLC w fazie odwróconej dla H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2. Przedstawiono analityczny zapis HPLC produktu surowego i oczyszczonego (gradient 30-80% przy 1 mL/min przez 30 minut w 60°C z użyciem kolumny C18, 5 μm, 50 x 2 mm) dla peptoidu o blokowym ładunku H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2.

Wynik spektrometrii mas, wykres przedstawia stosunek masy do ładunku w funkcji procentowej intensywności, szczyt przy m/z 4981,2.
Rysunek 5. Widmo spektrometrii mas MALDI-TOF dla H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2. Obserwowana masa, 4981,2, jest zgodna z masą obliczoną, wynoszącą 4981,74.

Dyskusja

Zastosowania i znaczenie

Niniejszy protokół opisuje prostą i wydajną metodę syntezy peptoidów oraz ich wodną samoorganizację w nanolisty. Większość laboratoriów jest w stanie bez trudności syntetyzować peptoidy, ponieważ wykorzystuje się w tym procesie niedrogie materiały, podstawową wiedzę oraz proste techniki4. Podobnie samoorganizacja ultracienkich, wysoko uporządkowanych nanolistów wymaga jedynie wielokrotnego przechylania fiolki z rozcieńczonym wodnym roztworem peptoidów2. Peptoidy są obiecującymi materiałami w badaniach biomedycznych i nanonauce, ponieważ są trwałe i elastyczne syntetycznie, a jednocześnie specyficzne dla sekwencji i wysoce konfigurowalne5. Wykazano, że peptoidy posiadają aktywność biologiczną (terapeutyczną6,7, diagnostyczną8, w dostarczaniu wewnątrzkomórkowym9-10) oraz zdolność do zwijania się w hierarchiczne nanostruktury3, 11-14. Dzięki modularnej syntezie kombinatoryczne biblioteki peptoidów15-19 mogą być łatwo syntetyzowane i przesiewane pod kątem szerokiego spektrum aktywności lub właściwości. W szczególności nanolisty służą jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań ekspozycyjnych, mimetyków błon, biosensorów, mimetyków białek oraz do wytwarzania urządzeń. Ze względu na praktycznie niewyczerpaną liczbę możliwych sekwencji, obszar badań nad peptoidami szybko się rozwija.

Zmienne w syntezie submonomerów polypeptoidów w fazie stałej

Ze względu na możliwość wyboru z niezwykle dużego i różnorodnego alfabetu monomerów20, metoda submonomerowa wymaga okazjonalnych modyfikacji w przypadkach, gdy zwiększenie wydajności sprzęgania w każdym kroku poprawi całkowitą wydajność produktu. Wprowadzenie niechronionych heterocyklicznych łańcuchów bocznych wymaga zastosowania kwasu chlorooctowego zamiast kwasu bromooctowego21. Wydłużony czas podstawienia oraz wyższe stężenia amin są zazwyczaj stosowane po około 20 sprzęganiach w przypadku długich sekwencji peptoidowych lub amin o mniejszej nukleofilowości. Podgrzanie naczynia reakcyjnego do 35 °C, przy użyciu naczynia z płaszczem wodnym, pomaga przyspieszyć reakcję. W przypadku amin o wysokiej lotności, takich jak izopropylamina, należy zachować ostrożność, aby uniknąć ich odparowania.

Aminy w formie soli HCl, takie jak t-butylo beta-alanina HCl, muszą zostać przekształcone w wolną zasadę przed wprowadzeniem do reakcji substytucji. Można to osiągnąć poprzez rozpuszczenie lub zawieszenie aminy w DCM (˜5g aminy/25 mL DCM) i neutralizację ekvimolarnym roztworem wodnego wodorotlenku sodu w rozdzielaczu. Warstwę DCM oddziela się, a warstwę wodną przemywa dodatkowym DCM. Połączone warstwy DCM suszy się nad siarczanem sodu i filtruje do wcześniej zważonej kolby okrągłodennej. Rozpuszczalnik usuwa się za pomocą ewaporatora obrotowego, aż do uzyskania produktu w postaci oleju, a następnie zapisuje się masę produktu.

W etapie odszczepiania skład koktajlu TFA oraz czas odszczepiania zależą od liczby i rodzaju zastosowanych grup ochronnych. Wytyczne dotyczące koktajli do odszczepiania są podobne do tych stosowanych przy tradycyjnym usuwaniu grup ochronnych z peptydów1. Zazwyczaj 10-minutowa inkubacja jest wystarczająca dla sekwencji bez grup ochronnych lub sekwencji z niewielką liczbą grup ochronnych silnie labilnych w kwasach (np. BOC, trityl). W przypadku sekwencji z grupami ochronnymi trudniejszymi do usunięcia (np. ester t-butyl, Mtr, Pbf) lub sekwencji z wieloma grupami ochronnymi zaleca się dwugodzinną inkubację, aby zapewnić pełną deprotekcję każdego łańcucha. Surowe produkty peptoidowe zazwyczaj rozpuszczają się w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 (v/v), jednak w przypadku łańcuchów bocznych o wysokiej ogólnej hydrofobowości często stosuje się wyższe proporcje acetonitrylu.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Byoung-Chul Lee, Philip Choi oraz Samuel Ho za cenny wkład i pomoc. Praca ta została zrealizowana w Molecular Foundry w Lawrence Berkeley National Laboratory, przy wsparciu Office of Science, Office of Basic Energy Sciences Departamentu Energii USA w ramach kontraktu nr DE-AC02-05CH11231 oraz Defense Threat Reduction Agency w ramach kontraktu nr IACRO-B0845281.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DimetyloformamidEMD MilliporeEM-DX1726P-199+%
N-metylopirolidonVWRBDH1141-4LP99%
Kwas bromooctowyAcros Organics200000-10699%
4-metylopiperydynaSigma-AldrichM7320696%
N,N’-diizopropylokarbodiimidChem-Impex International00110099,5%
DichlorometanEMD MilliporeEMD-DX0835stopień ACS
AcetonitrylEMD MilliporeEM-AX0145P-199,8%
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT650899%
TriizopropylsilanSigma-Aldrich233781-10GDo odszczepiania TFA
1,2-dichlor–etanJT BakerJTH076-33Do sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych
FenetylaminaSigma-Aldrich407267-100ML>99,5% Amina o hydrofobowym łańcuchu bocznym
Boc-etylenodiaminaCNH TechnologiesC-1112Kationowa amina o łańcuchu bocznym
t-butyl-beta-alanina HClChem-Impex International04407Anionowa amina o łańcuchu bocznym
α-cyjanokwas 4-hydroksycynamowySigma-AldrichC8982-10X10MGDo matrycy MALDI
Nile RedSigma-Aldrich19123-10MGDo obrazowania fluorescencyjnego
DichlorodimetylosilanSigma-Aldrich80430-500G-FDo sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych
Jednorazowy wkład z frity PPApplied Separations2416Wkład polipropylenowy 6 mL z frity PE 20 mm
Jednorazowy adapter Luer 3-drożnyCole-Parmer31200-80Kurek do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Pierścień Luer LockCole-Parmer45503-19Złączka 1/4" do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Złączki LuerCole-Parmer45500-20Złączka 1/4" do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Jednorazowe pipety PPVWR international16001-194Do przenoszenia TFA
Plastikowa strzykawka Luer lockNational ScientificS7515-5Strzykawki 6 mL
Szklana fiolka 1 dramVWR international66011-041Z fenomenową formowaną zakrętką z wkładką z pulpy polwinylowej
Fiolka scyntylacyjna 20 mLVWR international66022-060Z dołączoną zakrętką PP i wkładką z folii pulpy
Przestawka adhezyjna Secure-SealInvitrogenS-24736Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełka przedmiotoweElectron Microscopy Sciences63411Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełko zakrywkoweVWR international48366-067Do obrazowania fluorescencyjnego
Wafel krzemowy 4”Ted Pella, Inc.16007Wstępnie pocięty na chipy 5x7 mm
Filtr 0,45VWR international28143-924Do HPLC.
Membrana PTFE
AgarozaBD Biosciences212272Do obrazowania fluorescencyjnego
Kolektor próżniowy SPESigma-Aldrich57044Przykład kolektora próżniowego SPE
Naczynie z frity szklanejAce glass6402-12Frity o porowatości C
Oczyszczacz/Sterylizator plazmowyHarrick Scientific Products, Inc.PDC-32GPrzykład oczyszczacza plazmowego do przygotowania chipów krzemowych do SEM

Bibliografia

  1. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).
  2. Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets. J. Am. Chem. Soc. , (2011).
  3. Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet. Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).
  4. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory. J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).
  5. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).
  6. Zuckermann, R. N., Kodadek, T. Peptoids as potential therapeutics. Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).
  7. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides. , 105-2794 (2008).
  8. Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins. Biochem. 50, 4322-4329 (2011).
  9. Huang, C. -Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro. Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).
  10. Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Bräse, S. Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  11. Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices. J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).
  12. Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers. Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).
  13. Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chemistry & Biology. 9, 647-654 (2002).
  14. Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).
  15. Mora, P. uig, Masip, I. sabel, Cortés, N. uria, Marquina, R. egina, Merino, R. amón, Merino, J. esús, Carbonell, T. eresa, Mingarro, I. smael, Messeguer, A. ngel, Pérez-Payá, E. nrique Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins. J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).
  16. Zuckermann, R. N. Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library. J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).
  17. Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library. Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).
  18. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  19. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (α peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  20. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza peptoid wmetoda submonomerowasynteza w fazie sta ejsamoorganizacja nanorurolekpolimery o specyficznej sekwencjipeptoidy amfifiloweodwr cona chromatografia cieczowa RP HPLCmikroskopia fluorescencyjnaskaningowa mikroskopia elektronowa
Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.