Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Podsumowanie

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Streszczenie

Peptoidy to nowa klasa biomimetycznych, nienaturalnych, sekwencyjnie specyficznych heteropolimerów, które wykazują odporność na proteolizę, posiadają silną aktywność biologiczną i zwijają się w nanostruktury wyższego rzędu. Peptoidy, strukturalnie podobne do peptydów, są poliglicynami N-podstawionymi, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Łatwość ich syntezy oraz różnorodność strukturalna umożliwiają testowanie podstawowych zasad projektowania w celu opracowania de novo i inżynierii nowych materiałów nanostrukturalnych i biologicznie aktywnych.

W niniejszym materiale przedstawiono prosty protokół ręcznej syntezy peptoidów, który umożliwia otrzymywanie długołańcuchowych polypeptoidów (do 50merów) z doskonałą wydajnością. Wymagane jest jedynie podstawowe wyposażenie, proste techniki (np. przenoszenie cieczy, filtracja) oraz komercyjnie dostępne odczynniki, co czyni peptoidy przystępnym uzupełnieniem instrumentarium wielu badaczy. Szkielet peptoidu jest budowany po jednym monomerze przy użyciu metody submonomerowej, która składa się z dwuetapowego cyklu dodawania monomeru: acylacji i substytucji. Najpierw kwas bromooctowy, aktywowany in situ za pomocą N,N'-diizopropylokarbodiimidu, acyluje aminę drugorzędową związaną z żywicą. Następnie następuje nukleofilowe wyparcie bromku przez aminę pierwszorzędową w celu wprowadzenia łańcucha bocznego. Dwuetapowy cykl jest powtarzany do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha. Wydajność sprzęgania w tym dwuetapowym cyklu rutynowo przekracza 98% i umożliwia syntezę peptoidów o długości do 50 reszt. Metoda submonomerowa pozwala na uzyskanie wysoce dostrajalnych, precyzyjnych i chemicznie zróżnicowanych sekwencji, ponieważ bezpośrednio można w nich włączyć setki łatwo dostępnych amin pierwszorzędowych.

Peptoidy stają się wszechstronnym materiałem biomimetycznym w badaniach z zakresu nanobionauki ze względu na ich elastyczność syntetyczną, trwałość oraz uporządkowanie na poziomie atomowym. Niedawno wykazano możliwość fałdowania jednowątkowego, amfifilowego i bogatego w informacje polypeptoidu w wysoce uporządkowaną nanowarstwę. Peptoid ten jest 36-merem składającym się z zaledwie trzech różnych, dostępnych komercyjnie monomerów: hydrofobowego, kationowego i anionowego. Hydrofobowe łańcuchy boczne fenyloetylowe są ukryte w rdzeniu nanowarstwy, natomiast jonowe łańcuchy boczne aminowe i karboksylowe ustawiają się na powierzchniach hydrofilowych. Nanowarstwy peptoidowe służą jako potencjalna platforma dla mimetyków błon, mimetyków białek, produkcji urządzeń oraz sensorów. Opisane metody syntezy peptoidów, tworzenia warstw oraz obrazowania mikroskopowego stanowią prostą metodę umożliwiającą przyszłe projektowanie nanowarstw peptoidowych.

Protokół

1. Synteza polipeptoidów na fazie stałej z submonomerów

Synteza na fazie stałej (SPS) to powszechnie stosowana technika służąca do etapowej syntezy biopolimerów o określonej sekwencji, bezpośrednio na obojętnym wsporniku stałym, takim jak polimerowe koraliki żywiczne. Głównymi zaletami SPS są wysokie wydajności sprzęgania oraz łatwość usuwania nadmiaru reagentów. Po reakcji sprzęgania z żywicą nadmiar reagentów jest po prostu odcedzany, a koraliki są płukane w celu przygotowania ich do kolejnego etapu reakcji. Po końcowej reakcji syntezy pełnowymiarowe oligomery są odłączane od żywicy, a materiał w fazie ciekłej może zostać poddany dalszym badaniom. W niniejszej pracy adaptujemy procedurę SPS do wytwarzania polimerów peptydowych o określonej sekwencji.

1. Przygotowanie: Wszystkie etapy manualnej syntezy peptoidów można przeprowadzić w jednorazowym kartridżu z porowatym polipropylenem (PP) lub w szklanym naczyniu reakcyjnym z filtrem spiekanym, wyposażonym w kran trójdrożny. Wszystkie operacje należy wykonywać w dygestorium. W przypadku inkubacji w naczyniu szklanym lub plastikowym kartridżu, należy podłączyć jedno ramię do źródła azotu, aby delikatnie napowietrzać roztwór w celu zapewnienia odpowiedniego mieszania. Alternatywnie, w przypadku inkubacji reakcji w jednorazowym kartridżu, należy zamknąć oba końce kartridża zaślepkami i umieścić go na wytrząsarce rotacyjnej. Aby odprowadzić mieszaniny reakcyjne lub płuczyny, należy podłączyć naczynie do próżni laboratoryjnej za pomocą pułapki na odpady. Naczynie powinno posiadać filtr o grubych porach. Szklane naczynie reakcyjne należy zsilikonizować, aby zapobiec przywieraniu kuleczek żywicy do ścianek. Przygotować roztwór 5% dichlorodimetylosilanu w dichloroetanie (v/v). Czyste i suche naczynie reakcyjne napełnić do pełna roztworem silikonizującym, pozostawić na 30 minut, a następnie opróżnić. Naczynie wypłukać raz DCE, a następnie raz metanolem. Roztwór silikonizujący można wykorzystać ponownie, dlatego należy go zachować. Po zdjęciu kranu, szklane elementy należy wysuszyć na powietrzu lub strząsnąć nadmiar roztworu i wypalić w piecu do całkowitego wyschnięcia. Naczynie reakcyjne należy ochłodzić przed dodaniem żywicy.
2. Do naczynia reakcyjnego z filtrem dodać 100 mg (0,06 mmol) żywicy Rink amide. Napompować żywicę, dodając 2 mL dimetyloformamidu (DMF). Mieszać poprzez wytrząsanie lub napowietrzanie przez 10 minut. Roztwór odprowadzić za pomocą próżni, aby wyizolować napompowaną żywicę.
3. Dodać 1 mL 20% 4-metyłopiperydyny w DMF (v/v), aby usunąć grupę ochronną Fmoc. Mieszać przez 2 minuty, a następnie odprowadzić ciecz. Powtórzyć procedurę z inkubacją przez 12 minut.
4. Wypłukać żywicę, dodając 2 mL DMF, mieszając przez 15 sekund i odprowadzając ciecz. Powtórzyć 3x.
5. Bromoacetylacja: Dodać 1 mL 0,6 M kwasu bromooctowego (0,6 mmol) w DMF oraz 86 μL N,N'-diizopropylowokarbodimidu (0,93 ekwiwalentu, 0,56 mmol). Inkubować przy delikatnym napowietrzaniu przez 30 minut, a następnie odprowadzić ciecz i wypłukać 2 mL DMF (powtórzyć 4x).
6. Wypieranie: Dodać 1 mL 1-2 M aminy w N-metylopyrrolidonie. Inkubować z napowietrzaniem przez 30-120 minut, a następnie odprowadzić ciecz i wypłukać DMF (4x 2 mL).
7. Kontynuować wydłużanie łańcucha peptoidu poprzez powtarzanie cyklu submonomerowego, kroków 1.5 (bromoacetylacja) i 1.6 (wypieranie).

8. Po wykonaniu ostatniej substytucji przepłukać naczynie 2 mL DMF (powtórzyć 4x), a następnie 2 mL dichlorometanu (powtórzyć 3x). Zamknąć i przechowywać naczynie reakcyjne do momentu odszczepienia.
9. Przerwanie syntezy (opcjonalnie): Aby przerwać syntezę peptoidu, należy zakończyć reakcję substytucji i przejść do kroku 1.8. Aby kontynuować wydłużanie łańcucha peptoidowego, należy wznowić syntezę poprzez ponowne napęcznienie wysuszonej żywicy (krok 1.2) i powtórzenie cyklu submonomerów (kroki 1.5 i 1.6). Żywicę można wysuszyć i przechowywać po każdej substytucji z wyjątkiem drugiej, ponieważ koniugat żywica-peptoid może utworzyć cykliczny produkt uboczny w postaci diketopiperazyny.
10. W przypadku prowadzenia wielu syntez jednocześnie zaleca się stosowanie próżniowego manifoldu do ekstrakcji w fazie stałej w celu maksymalizacji wydajności. Synteza peptoidów może być również zautomatyzowana poprzez odpowiednie zaprogramowanie metod w dostępnych komercyjnie syntezatorach peptydów, takich jak Aapptec Apex 396, mikrofalowy syntezator CEM Liberty oraz syntezator Protein Technologies Inc. Prelude.

2. Odszczepianie i deprotekcja łańcuchów bocznych

1. Przenieść całą wysuszoną żywicę do 20 mL szklanej fiolki scyntylacyjnej.
2. Pracując pod wyciągiem i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, dodać 4 mL koktajlu do odszczepiania na bazie kwasu trifluorooctowego (TFA)¹ (np. 95% wodny TFA, patrz dyskusja) do szklanej fiolki scyntylacyjnej i szczelnie zamknąć. Wstrząsać od 10 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej (patrz dyskusja).
3. Zebrać roztwór po odszczepianiu TFA, filtrując żywicę przez jednorazowy wkład z frity PP do nowej, wcześniej zważonej 20 mL szklanej fiolki scyntylacyjnej. Do przenoszenia roztworów koktajlu do odszczepiania wygodne jest zastosowanie jednorazowej pipety PP.
4. Dodać 1 mL świeżego koktajlu do odszczepiania, aby wypłukać żywicę i zebrać pozostały peptoid. Powtórzyć 2x.
5. Odparować TFA, dmuchając delikatnym strumieniem azotu lub używając ewaporatora Biotage V10.
6. Rozpuścić surowy olej w 6 mL mieszaniny acetonitrylu/wody 1:1 (v/v) do analizy HPLC. Zamrozić i liofilizować. Powtórzyć.
7. Zważyć surowy produkt. Przechowywać w formie suchego proszku w temperaturze -20 °C.
8. Test odszczepiania (opcjonalnie): Można przeprowadzić test odszczepiania na 0,5% żywicy, aby szybko określić czystość i masę syntetyzowanego peptoidu oraz sprawdzić, czy wybrano odpowiednie warunki odszczepiania. Testy odszczepiania są szczególnie przydatne do monitorowania postępów syntezy.

3. Charakterystyka i oczyszczanie polipeptoidu

1. Za pomocą analitycznej HPLC, LC-MS z jonizacją elektrospray i/lub MALDI-TOF należy określić czystość produktu surowego oraz sprawdzić, czy uzyskano pożądaną masę cząsteczkową.
2. Należy przygotować roztwór suchego proszku peptoidu o stężeniu ˜5-10 mg/mL w wodzie z dodatkiem minimalnej ilości acetonitrylu, jeśli jest to konieczne dla zapewnienia rozpuszczalności. Przezroczysty roztwór surowego produktu peptoidowego należy przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm w celu usunięcia kurzu i cząstek.
3. Analityczna HPLC i LC-MS z jonizacją elektrospray: Należy przygotować roztwór surowego peptoidu o stężeniu _˜ 20 μg/mL. 200 μL roztworu należy przefiltrować filtrem 0,45 μm, a następnie wstrzyknąć 20 μL.
4. MALDI: Należy zmieszać 1 μL peptoidu o stężeniu _˜20 mg/mL z 1 μL matrycy. 1 μL mieszaniny należy nanieść na płytkę MALDI i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Dobór matrycy i trybu akwizycji zależy od próbki (Rys. 5).
5. Surową mieszaninę peptoidową należy oczyścić za pomocą preparatywnej HPLC w odwróconej fazie. Gradient i kolumnę (C4 lub C18) należy dobrać na podstawie hydrofobowości polipeptoidu. Oczyszczone frakcje należy połączyć, zamrozić i liofilizować, aż do uzyskania puszystego białego proszku. Należy odnotować masę produktu końcowego.
6. Tworzenie soli HCl (opcjonalnie): Zliofilizowany proszek należy ponownie rozpuścić w 100 mM HCl (aq.) z minimalną ilością acetonitrylu. Przenieść do wcześniej zważonej szklanej fiolki. Zamrozić i ponownie liofilizować. Procedurę należy powtórzyć 2x. Ponownie zważyć, aby określić masę proszku peptoidowego.

4. Tworzenie peptoidowych nanolipułek

W tej sekcji opisano protokół tworzenia arkuszy z jednowątkowego, sekwencyjnie specyficznego, amfifilowego 36-meru peptoidu (Ryc. 1). Po syntezie, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptoidu zgodnie z powyższym opisem, otrzymany biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasowego.

1. W probówce szklanej o pojemności 1 dram przygotować 500 μL roztworu peptoidu o stężeniu 20 μM w buforze do tworzenia arkuszy (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8.0 w wodzie). Najpierw dodać 445 μL wody Milli-Q, 50 μL 10x buforu do tworzenia arkuszy i wymieszać za pomocą wortexa. Następnie dodać 5 μL roztworu stokowego peptoidu o stężeniu 2 mM i delikatnie zamieszać roztwór ruchem wirowym. Zamknąć probówkę szklaną zakrętką.
2. Arkusze powstają w wyniku delikatnego mieszania rozcieńczonego wodnego roztworu peptoidu. Powolne przechylanie probówki szklanej z pozycji poziomej do pionowej prowadzi do powstania arkuszy. Delikatne wstrząsanie również pozwala uzyskać arkusze, jednak mają one tendencję do bycia mniejszymi i posiadania mniejszej liczby prostych krawędzi. Bardziej szczegółowa analiza mechanizmu tworzenia arkuszy została opisana w oddzielnej publikacji.²
3. W celu uzyskania wielu wysokiej jakości arkuszy, obracać probówki szklane wokół osi poziomej powoli (<1 RPM) przez jeden do trzech dni. Do ciągłego wykonywania tej operacji można użyć rotatora probówek Appropriate Technical Resources RKVSD Rotamix lub dostosowanego urządzenia kołyszącego.
4. Dializa nanoarkuszy (opcjonalnie): W niektórych zastosowaniach może zajść potrzeba usunięcia wolnych łańcuchów peptoidu lub buforów/soli. Namoczyć membranę Float-a-Lyzer 100 kD w wybranym buforze przez 15 minut. Wprowadzić 500 μL roztworu arkuszy peptoidowych do komory z próbką. Zanurzyć w 500 mL wybranego buforu, mieszając za pomocą magnetycznego mieszadła z prędkością 60 rpm. Pozostawić arkusze do dializy przez 4 godziny. Co godzinę wymieniać na świeżą porcję roztworu buforowego.

5. Mikroskopia fluorescencyjna nanorurek

1. Obrazy fluorescencyjne nanoręczników wykonano z użyciem Nile Red, barwnika wrażliwego na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta w środowiskach hydrofobowych (Ryc. 2).
2. Należy dodać 1 μL Nile Red o stężeniu 100 μM do 100 μL roztworu nanoręczników, aby uzyskać końcowe stężenie Nile Red wynoszące 1 μM.
3. Należy przygotować 1% roztwór agarozy w gorącej wodzie i wlać go do plastikowej szalki Petriego. Należy upewnić się, że warstwa agarozy ma grubość około 1/8 cala i pozwolić roztworowi ostygnąć niezakłóconie na płaskiej powierzchni. Po zestaleniu agarozy należy za pomocą szpatułki wyciąć kwadraty o wymiarach 1 cm x 1 cm i przenieść je na szkiełko przedmiotowe.
4. Aby zebrać arkusze w jednej płaszczyźnie, należy nanieść 1 μL roztworu arkuszy na fragment agarozy. Należy odczekać 2 minuty, aż agaroza wchłonie bufor, pozostawiając arkusze na powierzchni. Obrazowanie należy przeprowadzić w ciągu 15 minut, w przeciwnym razie agaroza zacznie się deformować wskutek odwodnienia.
5. Aby obrazować arkusze w roztworze, należy nanieść 15 μL próbki do uszczelki o średnicy 20 mm i grubości 0,12 mm na szkiełku przedmiotowym. Próbkę należy przykryć szkiełkiem nakrywką. Jeśli arkusze zostaną po prostu uciśnięte między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką bez użycia uszczelki, wiele arkuszy ulegnie ścinaniu, a pozornie niewielkie parowanie spowoduje ich ciągły ruch.
6. Arkusze należy obrazować przy oświetleniu epifluorescencyjnym (np. za pomocą odwróconego mikroskopu Olympus IX81 wyposażonego w kamerę EMCCD Andor iXonEM+ z filtrem Texas red).

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nanorurolużków

1. Trawienie plazmowe podłoża krzemowego (opcjonalnie): Chipy krzemowe są trawione plazmowo w celu wspomagania adsorpcji arkuszy. Umieść chipy krzemowe w komorze próżniowej urządzenia do czyszczenia plazmowego (np. Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G). Osiągnij ciśnienie 200 mTorr i ustaw cewkę RF na 18 W (ustawienie wysokie dla PDC-32G). Traw przez 2 minuty.
2. Nanieś 20 μL roztworu arkuszy peptoidowych na podłoże krzemowe poddane działaniu plazmy. Odstaw na 3 minuty. Usuń nadmiar roztworu za pomocą końcówki chusteczki Kim-wipe. Pipetuj 20 μL wody na powierzchnię i ponownie usuń nadmiar roztworu, aby usunąć bufor i sole. Powtórz 4x.
3. Alternatywnie przeprowadź dializę roztworów arkuszy peptoidowych przeciwko wodzie, aby usunąć bufor i sól. Nanieś 20 μL zdializowanego roztworu arkuszy na podłoża krzemowe poddane działaniu plazmy. Próbkę wysusz na powietrzu.
4. Obrazuj arkusze za pomocą SEM (np. Zeiss Gemini Ultra-55 Analytical Scanning Electron Microscope) z detektorem in-lens i przy energiach wiązki od 1 kV do 5 kV (Ryc. 3).

7. Uwagi dotyczące bezpieczeństwa:

1. Dimetyloformamid oraz dichlorometan są podejrzewane o działanie rakotwórcze.
2. N,N'-diizopropylowy karbodiimid, 4-metylopiperydyna i kwas bromooctowy są niebezpieczne dla skóry, oczu i dróg oddechowych. Należy ich używać ostrożnie w dygestorium. Mogą być toksyczne w przypadku wdychania lub wchłaniania przez skórę, a ekspozycja na nie może prowadzić do uczulenia. Puste pojemniki zawierają pozostałości produktu (ciecz/opary) i powinny zostać dokładnie wypłukane przed wyjęciem z dygestorium.
3. TFA jest silnym kwasem i działa niezwykle niszcząco na górne drogi oddechowe, oczy i skórę. TFA jest również lotne – skoncentrowane roztwory TFA należy przez cały czas przechowywać w dygestorium, aby uniknąć uszkodzeń układu oddechowego. Podczas pracy z roztworami TFA należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej i zachować ostrożność. W przypadku kontaktu z TFA należy niezwłocznie zmienić rękawice i natychmiast usunąć wszelkie rozlane substancje.

8. Reprezentatywne wyniki:

W tej sekcji opisano syntezę, charakterystykę i oczyszczanie specyficznie sekwencyjnego 36-merowego łańcucha peptoidowego, który zwija się w wysoce uporządkowany nanoarkusz³ (Rys. 1).

Peptoid o strukturze blokowo-ładunkowej H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂ został zsyntetyzowany na 100 mg żywicy Rink amide. Do wszystkich reakcji podstawienia wykorzystano 2 M roztwór aminy; reakcje prowadzono przez 60 minut dla reszt 1-18 oraz przez 120 minut dla reszt 19-36. t-Butyl beta-alanine HCl przekształcono w wolną zasadę (patrz dyskusja), natomiast fenetyloaminy oraz boc-etyloendiaminy użyto bezpośrednio. Żywicę odszczepiono przy użyciu 95% TFA, 2,5% triizopropylsilanu i 2,5% wody przez 2 godziny. TFA odparowano, a powstały lepki olej (~180 mg) ponownie rozpuszczono w 6 mL mieszaniny acetonitryl:woda 1:1 (v/v). Czystość produktu (Ryc. 4) oraz obecność masy produktu potwierdzono za pomocą analitycznej RP-HPLC (gradient 30-80% acetonitrylu w wodzie, oba z dodatkiem 0,1% (v/v) TFA, przepływ 1 mL/min przez 30 minut w temperaturze 60 °C, kolumna C18, 5 μm, 50 X 2 mm) oraz MALDI (Ryc. 5).

Oczyszczanie metodą odwróconej fazy HPLC na kolumnie Vydac C18 (10 μm, 22 mm x 250 mm) przeprowadzono z wykorzystaniem gradientu 30-60% acetonitrylu w wodzie z 0,1% TFA w czasie 60 minut przy przepływie 10 mL/min. Na kolumnę naniesiono 60 mg produktu surowego dla każdego przebiegu chromatograficznego. Oczyszczone frakcje połączono na podstawie czystości określonej za pomocą analitycznej RP-HPLC (Rys. 4) i liofilizowano, otrzymując _˜80 mg puszystego białego proszku.

Masa cząsteczkową oczyszczonego peptoidu z blokowym ładunkiem potwierdzono za pomocą MALDI. 1 μL oczyszczonego peptoidu o stężeniu 100 μM w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 (v/v) zmieszano z 1 μL matrycy (5 mg/mL kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 v/v i 0,1% TFA), a następnie 1 μL naniesiono na płytkę MALDI. Po wysuszeniu próbki na powietrzu umieszczono ją w analizatorze Applied Biosystem/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF. W trybach akwizycji i przetwarzania zastosowano liniowy zakres niskich mas. Obliczoną masę wpisano w polu masy docelowej, aby automatycznie dostosować czas opóźnienia. Natężenie lasera ustawiono na 3400. Obserwowana masa 4981,2 ściśle odpowiada obliczonej masie 4981,74.

Liofilizowany oczyszczony proszek rozpuszczono w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasu, który można przechowywać w temperaturze 4 °C. Arkusze przygotowano zgodnie z wyżej wymienionym protokołem, a następnie obrazowano przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii optycznej oraz SEM (Ryc. 2 i 3). Zaobserwowano różnorodne kształty o rozmiarach cech sięgających 300 μm, przy czym szczególnie wyraźne są proste krawędzie.

Rysunek 1. Sekwencja blokowego peptoidu naładowanego H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂. Jednołańcuchowy, amfifilny polipeptoid 36-mer o blokowym ładunku ulega samoorganizacji w wysoko uporządkowane, dwuwymiarowe nanoarkusze³. Obliczona masa cząsteczkowa wynosi 4981,74.

Rycina 2. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej nanonarków peptoidowych. Arkusze utworzono z 20 μM roztworu peptoidu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0. Obrazowanie arkuszy przeprowadzono na agarozie z 1μM Nile Red. Paski skali oznaczają 100 μm.

Rysunek 3. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego nanosieci peptoidowych. Arkusze utworzono z 20 μM roztworu peptoidu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Paski skali wynoszą 5 μm.

Rysunek 4. Analityczny chromatogram HPLC w fazie odwróconej dla H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂. Przedstawiono analityczny chromatogram HPLC (gradient 30-80% przy 1 mL/min przez 30 minut w 60°C z użyciem kolumny C18, 5 μm, 50 x 2 mm) surowego oraz oczyszczonego peptoidu blokowo-ładunkowego H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂.

Rysunek 5. Widmo spektrometrii mas MALDI-TOF dla H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]₉-NH₂. Obserwowana masa, 4981,2, jest zgodna z masą obliczoną, wynoszącą 4981,74.

Dyskusja

Zastosowania i znaczenie

Niniejszy protokół opisuje prostą i wydajną metodę syntezy peptoidów oraz ich wodną samoorganizację w nanolisty. Większość laboratoriów jest w stanie bez trudności syntetyzować peptoidy, ponieważ wykorzystuje się w tym procesie niedrogie materiały, podstawową wiedzę oraz proste techniki⁴. Podobnie samoorganizacja ultracienkich, wysoko uporządkowanych nanolistów wymaga jedynie wielokrotnego przechylania fiolki z rozcieńczonym wodnym roztworem peptoidów². Peptoidy są obiecującymi materiałami w badaniach biomedycznych i nanonauce, ponieważ są trwałe i elastyczne syntetycznie, a jednocześnie specyficzne dla sekwencji i wysoce konfigurowalne⁵. Wykazano, że peptoidy posiadają aktywność biologiczną (terapeutyczną^6,7, diagnostyczną⁸, w dostarczaniu wewnątrzkomórkowym^9-10) oraz zdolność do zwijania się w hierarchiczne nanostruktury^{3, 11-14}. Dzięki modularnej syntezie kombinatoryczne biblioteki peptoidów^15-19 mogą być łatwo syntetyzowane i przesiewane pod kątem szerokiego spektrum aktywności lub właściwości. W szczególności nanolisty służą jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań ekspozycyjnych, mimetyków błon, biosensorów, mimetyków białek oraz do wytwarzania urządzeń. Ze względu na praktycznie niewyczerpaną liczbę możliwych sekwencji, obszar badań nad peptoidami szybko się rozwija.

Zmienne w syntezie submonomerów polypeptoidów w fazie stałej

Ze względu na możliwość wyboru z niezwykle dużego i różnorodnego alfabetu monomerów²⁰, metoda submonomerowa wymaga okazjonalnych modyfikacji w przypadkach, gdy zwiększenie wydajności sprzęgania w każdym kroku poprawi całkowitą wydajność produktu. Wprowadzenie niechronionych heterocyklicznych łańcuchów bocznych wymaga zastosowania kwasu chlorooctowego zamiast kwasu bromooctowego²¹. Wydłużony czas podstawienia oraz wyższe stężenia amin są zazwyczaj stosowane po około 20 sprzęganiach w przypadku długich sekwencji peptoidowych lub amin o mniejszej nukleofilowości. Podgrzanie naczynia reakcyjnego do 35 °C, przy użyciu naczynia z płaszczem wodnym, pomaga przyspieszyć reakcję. W przypadku amin o wysokiej lotności, takich jak izopropylamina, należy zachować ostrożność, aby uniknąć ich odparowania.

Aminy w formie soli HCl, takie jak t-butylo beta-alanina HCl, muszą zostać przekształcone w wolną zasadę przed wprowadzeniem do reakcji substytucji. Można to osiągnąć poprzez rozpuszczenie lub zawieszenie aminy w DCM (˜5g aminy/25 mL DCM) i neutralizację ekvimolarnym roztworem wodnego wodorotlenku sodu w rozdzielaczu. Warstwę DCM oddziela się, a warstwę wodną przemywa dodatkowym DCM. Połączone warstwy DCM suszy się nad siarczanem sodu i filtruje do wcześniej zważonej kolby okrągłodennej. Rozpuszczalnik usuwa się za pomocą ewaporatora obrotowego, aż do uzyskania produktu w postaci oleju, a następnie zapisuje się masę produktu.

W etapie odszczepiania skład koktajlu TFA oraz czas odszczepiania zależą od liczby i rodzaju zastosowanych grup ochronnych. Wytyczne dotyczące koktajli do odszczepiania są podobne do tych stosowanych przy tradycyjnym usuwaniu grup ochronnych z peptydów¹. Zazwyczaj 10-minutowa inkubacja jest wystarczająca dla sekwencji bez grup ochronnych lub sekwencji z niewielką liczbą grup ochronnych silnie labilnych w kwasach (np. BOC, trityl). W przypadku sekwencji z grupami ochronnymi trudniejszymi do usunięcia (np. ester t-butyl, Mtr, Pbf) lub sekwencji z wieloma grupami ochronnymi zaleca się dwugodzinną inkubację, aby zapewnić pełną deprotekcję każdego łańcucha. Surowe produkty peptoidowe zazwyczaj rozpuszczają się w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 (v/v), jednak w przypadku łańcuchów bocznych o wysokiej ogólnej hydrofobowości często stosuje się wyższe proporcje acetonitrylu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dimetyloformamid	EMD Millipore	EM-DX1726P-1	99+%
N-metylopirolidon	VWR	BDH1141-4LP	99%
Kwas bromooctowy	Acros Organics	200000-106	99%
4-metylopiperydyna	Sigma-Aldrich	M73206	96%
N,N’-diizopropylokarbodiimid	Chem-Impex International	001100	99,5%
Dichlorometan	EMD Millipore	EMD-DX0835	stopień ACS
Acetonitryl	EMD Millipore	EM-AX0145P-1	99,8%
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508	99%
Triizopropylsilan	Sigma-Aldrich	233781-10G	Do odszczepiania TFA
1,2-dichlor–etan	JT Baker	JTH076-33	Do sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych
Fenetylamina	Sigma-Aldrich	407267-100ML	>99,5% Amina o hydrofobowym łańcuchu bocznym
Boc-etylenodiamina	CNH Technologies	C-1112	Kationowa amina o łańcuchu bocznym
t-butyl-beta-alanina HCl	Chem-Impex International	04407	Anionowa amina o łańcuchu bocznym
α-cyjanokwas 4-hydroksycynamowy	Sigma-Aldrich	C8982-10X10MG	Do matrycy MALDI
Nile Red	Sigma-Aldrich	19123-10MG	Do obrazowania fluorescencyjnego
Dichlorodimetylosilan	Sigma-Aldrich	80430-500G-F	Do sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych
Jednorazowy wkład z frity PP	Applied Separations	2416	Wkład polipropylenowy 6 mL z frity PE 20 mm
Jednorazowy adapter Luer 3-drożny	Cole-Parmer	31200-80	Kurek do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Pierścień Luer Lock	Cole-Parmer	45503-19	Złączka 1/4" do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Złączki Luer	Cole-Parmer	45500-20	Złączka 1/4" do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy
Jednorazowe pipety PP	VWR international	16001-194	Do przenoszenia TFA
Plastikowa strzykawka Luer lock	National Scientific	S7515-5	Strzykawki 6 mL
Szklana fiolka 1 dram	VWR international	66011-041	Z fenomenową formowaną zakrętką z wkładką z pulpy polwinylowej
Fiolka scyntylacyjna 20 mL	VWR international	66022-060	Z dołączoną zakrętką PP i wkładką z folii pulpy
Przestawka adhezyjna Secure-Seal	Invitrogen	S-24736	Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełka przedmiotowe	Electron Microscopy Sciences	63411	Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełko zakrywkowe	VWR international	48366-067	Do obrazowania fluorescencyjnego
Wafel krzemowy 4”	Ted Pella, Inc.	16007	Wstępnie pocięty na chipy 5x7 mm
Filtr 0,45	VWR international	28143-924	Do HPLC. Membrana PTFE
Agaroza	BD Biosciences	212272	Do obrazowania fluorescencyjnego
Kolektor próżniowy SPE	Sigma-Aldrich	57044	Przykład kolektora próżniowego SPE
Naczynie z frity szklanej	Ace glass	6402-12	Frity o porowatości C
Oczyszczacz/Sterylizator plazmowy	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G	Przykład oczyszczacza plazmowego do przygotowania chipów krzemowych do SEM