Synteza submonomerów w fazie stałej polimerów peptydowych i ich samoorganizacja w wysoce uporządkowane nanoarkusze

Summary

Przedstawiono prostą i ogólną metodę ręcznej syntezy peptoidów, obejmującą podstawowy sprzęt i dostępne na rynku odczynniki, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36mer, a także jego samoorganizację w wysoce uporządkowane nanoarkusze.

Abstract

Peptoidy to nowa klasa biomimetycznych, nienaturalnych, specyficznych dla sekwencji heteropolimerów, które są odporne na proteolizę, wykazują silną aktywność biologiczną i składają się w nanostruktury wyższego rzędu. Strukturalnie podobne do peptydów, peptoidy są glicynami z podstawionymi poli-N, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do alfa-węgla. Ich łatwość syntezy i różnorodność strukturalna pozwalają na testowanie podstawowych zasad projektowania w celu napędzania projektowania i inżynierii de novo nowych materiałów biologicznie aktywnych i nanostrukturalnych.

Tutaj prezentowany jest prosty protokół ręcznej syntezy peptoidów, który pozwala na syntezę polipeptoidów o długich łańcuchach (do 50merów) z doskonałymi plonami. Wymagany jest jedynie podstawowy sprzęt, proste techniki (np. przenoszenie cieczy, filtracja) i dostępne na rynku odczynniki, co sprawia, że peptoidy są dostępnym dodatkiem do zestawów narzędzi wielu badaczy. Szkielet peptoidalny jest hodowany po jednym monomerze na raz za pomocą metody submonomeru, która składa się z dwuetapowego cyklu dodawania monomeru: acylacji i wypierania. Po pierwsze, kwas bromooctowy aktywowany in situ za pomocą N,N'-diizopropylokarbidiimidu acyluje drugorzędową aminę związaną z żywicą. Po drugie, nukleofilowe przemieszczenie bromku przez aminę pierwszorzędową następuje w celu wprowadzenia łańcucha bocznego. Dwuetapowy cykl jest powtarzany, aż do osiągnięcia żądanej długości łańcucha. Skuteczność sprzężenia w tym dwuetapowym cyklu rutynowo przekracza 98% i umożliwia syntezę peptoidów o długości do 50 reszt. Wysoce przestrajalne, precyzyjne i chemicznie zróżnicowane sekwencje są możliwe do osiągnięcia za pomocą metody submonomerów, ponieważ setki łatwo dostępnych amin pierwszorzędowych mogą być bezpośrednio włączone.

Peptoidy stają się wszechstronnym materiałem biomimetycznym do badań nanobiologicznych ze względu na ich syntetyczną elastyczność, solidność i uporządkowanie na poziomie atomowym. Niedawno zademonstrowano składanie jednołańcuchowego, amfifilowego, bogatego w informacje polipeptoidu w wysoce uporządkowany nanoarkusz. Ten peptoid jest 36-merem, który składa się tylko z trzech różnych dostępnych na rynku monomerów: hydrofobowego, kationowego i anionowego. Hydrofobowe łańcuchy boczne fenyloetylu są zakopane w rdzeniu nanoarkusza, podczas gdy łańcuchy boczne jonowej aminy i karboksylu układają się na powierzchniach hydrofilowych. Nanoarkusze peptydowe służą jako potencjalna platforma dla mimetyki błonowej, mimetyki białek, produkcji urządzeń i czujników. Opisano metody syntezy peptoidów, tworzenia arkuszy i obrazowania mikroskopowego, które zapewniają prostą metodę umożliwiającą przyszłe projekty nanoarkuszy peptydowych.

Protocol

1. Synteza submonomerów w fazie stałej polipeptoidów

Synteza w fazie stałej (SPS) jest powszechną techniką używaną do syntezy biopolimerów specyficznych dla sekwencji, krok po kroku, bezpośrednio na obojętnym podłożu stałym, takim jak kulka żywicy polimerowej. Wysoka wydajność sprzęgania i łatwość usuwania nadmiaru reagentów to główne zalety SPS. Po reakcji sprzęgania z żywicą nadmiar odczynników jest po prostu spuszczany, a kulki są myte, aby były gotowe do następnego etapu reakcji. Po końcowej reakcji syntezy oligomery o pełnej długości są oddzielane od żywicy i można dalej badać materiał w fazie roztworu. W tym przypadku dostosowujemy procedurę SPS do generowania specyficznych dla sekwencji polimerów peptyidowych.

1. Konfiguracja: Wszystkie etapy ręcznej syntezy peptoidów można przeprowadzić w jednorazowym naboju ze spiekanym polipropylenem (PP) lub naczyniu reakcyjnym ze spiekanego szkła wyposażonym w 3-drogowy zawór odcinający. Wszystkie operacje należy wykonywać pod wyciągiem. W przypadku inkubacji w szklanym naczyniu lub plastikowym kartridżu podłącz jedno ramię do źródła azotu, aby delikatnie bąbelkować roztwór w celu prawidłowego wymieszania. Alternatywnie, w przypadku inkubacji reakcji w jednorazowym kartridżu, należy uszczelnić oba końce wkładu nakrętkami i umieścić na wytrząsarce obrotowej. Aby spuścić mieszaniny reakcyjne lub mycie, podłącz do odkurzacza domowego za pomocą syfonu na odpady. Naczynie powinno być smażone gruboziarnistą frytą. Silikonow szklane naczynie reakcyjne, aby uniknąć przywierania koralików do ścianek szklanego naczynia. Przygotować 5% roztwór dichlorodimetylosilanu w dichloroetanie (v/v). Napełnij czyste i suche naczynie reakcyjne do góry roztworem silikonowym, odstaw na 30 minut, a następnie odcedź. Umyć naczynie raz DCE, a następnie raz metanolem. Roztwór silikonowy może być ponownie użyty, więc należy go zapisać. Wysuszyć na powietrzu lub strząsnąć nadmiar roztworu i po wyjęciu kurka upiec szklane naczynia do wyschnięcia. Ostudzić naczynie reakcyjne przed dodaniem żywicy.
2. Dodać 100 mg (0,06 mmol) żywicy amidowej Rink do spiekanego naczynia reakcyjnego. Spęcznić żywicę, dodając 2 ml dimetyloformamidu (DMF). Mieszać, potrząsając lub bulgocząc przez 10 minut. Odcedź roztwór za pomocą próżni, aby odizolować spęczniałą żywicę.
3. Dodaj 1 ml 20% 4-metylopipryrydyny do DMF (v/v), aby zdeprotect grupę Fmoc. Mieszać przez 2 minuty i odcedzić. Powtórzyć z 12-minutową inkubacją.
4. Opłucz żywicę, dodając 2 ml DMF, mieszając przez 15 sekund i odcedzając. Powtórz 3 razy.
5. Bromoacetylacja: Dodać 1 ml 0,6 M kwasu bromooctowego (0,6 mmol) w DMF i 86 μl N,N'-diizopropylokarbodimidu (odpowiednik 0,93, 0,56 mmol). Inkubować z delikatnym bulgotaniem przez 30 minut, następnie odcedzić i spłukać 2 ml DMF (powtórzyć 4x).
6. Przemieszczenie: Dodać 1 ml 1-2 M aminy w N-metylopirolidynonie. Inkubować z bulgotaniem przez 30-120 minut, następnie odcedzić i spłukać DMF (4x 2 mL).
7. Kontynuuj wzrost łańcucha peptyidowego, powtarzając cykl submonomeru, kroki 1,5 (bromoacetylacja) i 1,6 (przemieszczenie).

8. Po wykonaniu ostatecznego przemieszczenia przepłukać 2 ml DMF (powtórzyć 4x), a następnie 2 ml dichlorometanu (powtórzyć 3x). Zakryj naczynie reakcyjne i przechowuj je do momentu rozszczepienia.
9. Przerwa w syntezie (opcjonalnie): Aby zatrzymać się podczas syntezy peptoidów, zakończ reakcję wypierania i przejdź do kroku 1.8. Aby kontynuować wzrost łańcucha peptyidowego, należy wznowić syntezę poprzez ponowne pęcznienie wysuszonej żywicy (krok 1.2) i powtórzenie cyklu submonomeru (kroki 1.5 i 1.6). Żywica może być suszona i przechowywana po dowolnym przemieszczeniu, z wyjątkiem 2. przemieszczenia, ponieważ koniugat żywica-peptoid może tworzyć cykliczny produkt uboczny diketopiperazyny.
10. W przypadku wielu jednoczesnych syntez zalecany jest kolektor próżniowy do ekstrakcji do fazy stałej, aby zmaksymalizować wydajność. Syntezę peptydów można również zautomatyzować za pomocą odpowiednich metod programowania w dostępnych na rynku syntezatorach peptydowych, takich jak Aapptec Apex 396, syntezator mikrofalowy CEM Liberty i syntezator Prelude firmy Protein Technologies Inc.

2. Deprotekcja dekoltu i bocznego łańcucha

1. Przenieść całą wysuszoną żywicę do fiolki ze szkłem scyntylacyjnym o pojemności 20 ml.
2. Pracując pod kapturem i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, dodać 4 ml koktajlu rozszczepiającego 1 kwasu trifluorooctowego (TFA) (np. 95% aq. TFA, patrz dyskusja) do fiolki ze szkła scyntylacyjnego i szczelnie zakręcić. Wstrząsaj przez 10 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej (patrz dyskusja).
3. Zebrać roztwór do rozszczepienia TFA, filtrując żywicę przez jednorazowy wkład ze spiekanego PP do nowej, wstępnie zważonej fiolki ze szkła scyntylacyjnego o pojemności 20 ml. Jednorazowa pipeta PP jest wygodna do przenoszenia roztworów koktajlowych z dekoltem.
4. Dodaj 1 ml świeżego koktajlu z dekoltu, aby wypłukać żywicę i zebrać resztki peptoidu. Powtórz 2 razy.
5. Odparować TFA poprzez wdmuchiwanie delikatnego strumienia azotu lub za pomocą parownika Biotage V10.
6. Ponownie rozpuścić ropę naftową w 6 ml acetonitrylu/wody w stosunku 1:1 (v/v) do HPLC. Zamrażać i liofilizować. Powtórzyć.
7. Zapisać masę produktu surowego. Przechowywać w postaci suchego proszku w temperaturze -20 °C
8. Testowe rozszczepienie (opcjonalnie): Można przeprowadzić testowe rozszczepienie na 0,5% żywicy, aby szybko określić czystość i masę zsyntetyzowanego peptoidu oraz czy wybrano prawidłowe warunki rozszczepienia. Testowe dekolty są szczególnie przydatne do monitorowania postępu syntezy.

3. Charakterystyka i oczyszczanie polipeptoidu

1. Poprzez połączenie analitycznej HPLC, elektronatrysku LC-MS i/lub MALDI-TOF, określić czystość surowego produktu i czy występuje w nim pożądana masa cząsteczkowa.
2. Przygotować roztwór °5-10 mg/ml suchego proszku peptoidowego w wodzie z minimalną ilością acetonitrylu, zgodnie z potrzebami do zapewnienia rozpuszczalności. Przefiltrować przezroczysty roztwór surowego produktu peptydowego za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm w celu usunięcia kurzu i cząstek.
3. Analityczna HPLC i elektronatryskiwanie LC-MS: Przygotować _̃ 20 μg/ml surowego roztworu peptoidu. Przefiltruj 200 μl za pomocą filtra 0,45 μm i wstrzyknij 20 μl.
4. MALDI: Zmieszać 1 μl ¼l _°20 mg/ml peptoidu z 1 μl matrycy. Umieść 1 μl na płytce MALDI i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Matryca i tryb akwizycji są zależne od próbki (rys. 5).
5. Oczyść surową mieszaninę peptydów za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Wybierz gradient i kolumnę (C4 lub C18) na podstawie hydrofobowości polipeptoidu. Połącz oczyszczone frakcje, zamroź i liofilizuj, dając puszysty biały proszek. Zapisz wagę produktu końcowego.
6. Tworzenie soli HCl (opcjonalnie): Ponownie rozpuść liofilizowany proszek w 100 mM HCl (woda) z minimalną ilością acetonitrylu. Przenieść do wstępnie zważonej szklanej fiolki. Zamrażać i ponownie liofilizować. Powtórz 2 razy. Ponownie zważyć, aby określić masę proszku peptyidowego.

4. Tworzenie nanoarkuszy peptoidalnych

Ta sekcja opisuje protokół tworzenia arkuszy z jednołańcuchowego, specyficznego dla sekwencji, amfifilowego 36-merowego peptoidu (Rys. 1). Po zsyntetyzowaniu, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptyidowej zgodnie z powyższym opisem, powstały biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu wytworzenia roztworu podstawowego o stężeniu 2 mM.

1. Przygotować 500 μl 20 μM roztworu peptydu w buforze do tworzenia arkuszy (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 w wodzie) w szklanej fiolce o pojemności 1 dram. Najpierw dodaj 445 μl wody Milli-Q, 50 μl 10x buforu do tworzenia arkuszy i wiruj do mieszania. Następnie dodać 5 μl 2 mM peptoidowego roztworu podstawowego i delikatnie zawirować roztwór. Zakręć szklaną fiolkę.
2. Arkusze powstają w wyniku delikatnego mieszania rozcieńczonego wodnego roztworu peptyidu. Powolne przechylanie szklanej fiolki z pozycji poziomej do pozycji pionowej powoduje powstanie arkuszy. Delikatne potrząsanie również daje arkusze; Jednak arkusze są zwykle mniejsze i mają mniej prostych krawędzi. Bardziej szczegółowa analiza mechanizmu formowania się arkuszy jest przedstawiona oddzielnie. ^{cyfra arabska}
3. W przypadku wielu wysokiej jakości arkuszy szklane fiolki należy powoli obracać wokół osi poziomej (<1 obr./min) przez jeden do trzech dni. Odpowiednie zasoby techniczne: rotator rurowy RKVSD Rotamix lub dostosowany do potrzeb klienta wahacz mogą to robić w sposób ciągły.
4. Dializa nanoarkuszy (opcjonalnie): W niektórych zastosowaniach może być konieczne usunięcie wszelkich wolnych łańcuchów peptyidowych lub/soli. Namocz membranę Float-a-Lyzer 100 kD w żądanym buforze na 15 minut. Załadować 500 μl roztworu arkusza peptydu do komory próbki. Namocz w 500 ml żądanego buforu, mieszając mieszadłem magnetycznym przy 60 obr./min. Pozwól, aby dializa prześcieradeł trwała 4 godziny. Co godzinę wymieniaj się ze świeżym zapasem roztworu buforowego.

5. Mikroskopia fluorescencyjna nanoarkuszy

1. Obrazy fluorescencyjne nanoarkuszy zostały zobrazowane za pomocą czerwieni nilowej, barwnika wrażliwego na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta, gdy jest zlokalizowany w środowisku hydrofobowym (ryc. 2).
2. Dodać 1 μl 100 μM czerwieni nilowej do 100 μl roztworu nanoarkuszy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM czerwieni nilowej.
3. Przygotuj 1% roztwór agarozy w gorącej wodzie i wlej do plastikowej szalki Petriego. Upewnij się, że roztwór agarozy ma grubość około 1/8 cala i pozwól roztworowi ostygnąć bez przeszkód na płaskiej powierzchni. Po zastygnięciu agarozy za pomocą szpatułki pokrój i przenieś kwadraty o wymiarach 1 cm x 1 cm na szklane szkiełko.
4. Aby zebrać arkusze w tej samej płaszczyźnie, umieść 1 μl roztworu arkusza na kawałku agarozy. Pozwól agarozie wchłonąć bufor przez 2 minuty, pozostawiając arkusze na powierzchni. Obraz w ciągu 15 minut, w przeciwnym razie agaroza zacznie się odkształcać z powodu odwodnienia.
5. Aby zobrazować arkusze w roztworze, załaduj 15 μl do uszczelki 0,12 mm o średnicy 20 mm na szkiełku podstawowym. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Jeśli arkusze zostaną po prostu umieszczone między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym bez uszczelki, wiele arkuszy będzie się ścinać, a pozornie niewielkie parowanie spowoduje, że arkusze będą się stale poruszać.
6. Arkusze obrazów w oświetleniu epifluorescencyjnym (np. mikroskop odwrócony Olympus IX81 wyposażony w widma Andor iXonEM+ EMCCD z filtrem Texas red).

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nanoarkuszy

1. Wytrawianie plazmowe podłoża silikonowego (opcjonalnie): Chipy krzemowe są wytrawiane plazmowo, aby pomóc w adsorpcji arkuszy. Umieść chipy silikonowe w komorze próżniowej myjki plazmowej (np. Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G). Zmniejsz moc do 200 mTorr i ustaw cewkę RF na 18 W (wysokie ustawienie dla PDC-32G). Wytrawiaj przez 2 minuty.
2. Upuść 20 μl roztworu arkusza peptydowego na podłoże krzemowe poddane obróbce plazmowej. Pozostaw na 3 minuty. Usuń nadmiar roztworu za pomocą końcówki chusteczki Kim-wipe. Odpipetować 20 μl wody na powierzchnię i ponownie usunąć nadmiar roztworu, aby usunąć bufor i sole. Powtórz 4 razy.
3. Alternatywnie, dializa roztworów arkuszy peptyidowych przeciwko wodzie w celu usunięcia buforu i soli. Upuść 20 μl dializowanego roztworu arkuszowego na podłoża krzemowe poddane obróbce plazmowej. Wysuszyć próbkę na powietrzu.
4. Arkusze obrazów z SEM (np. analityczny skaningowy mikroskop elektronowy Zeiss Gemini Ultra-55) z detektorem w soczewce i przy energiach wiązki od 1 kV do 5 kV (rys. 3).

7. Uwagi dotyczące bezpieczeństwa:

1. Dimetyloformamid i dichlorometan są podejrzewane o działanie rakotwórcze.
2. N,N'-diizopropylokarbodiiimid, 4-metylopiperdyna i kwas bromooctowy są niebezpieczne dla skóry, oczu i dróg oddechowych. Należy ich używać w kapturze z ostrożnością. Może być toksyczny w przypadku wdychania lub wchłaniania przez skórę, a narażenie może powodować uczulenie. Puste pojemniki zatrzymują resztki produktu (płyn/opary) i należy je dokładnie wypłukać przed wyjęciem ich z okapu.
3. TFA jest silnym kwasem i jest niezwykle destrukcyjny dla górnych dróg oddechowych, oczu i skóry. TFA to również skoncentrowane roztwory TFA w kapturze przez cały czas, aby uniknąć uszkodzenia dróg oddechowych. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z roztworami TFA. W przypadku kontaktu z TFA należy natychmiast zmienić rękawice i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny.

8. Reprezentatywne wyniki:

Ta sekcja opisuje syntezę, charakterystykę i oczyszczanie specyficznego dla sekwencji 36-merowego łańcucha peptoidalnego, który składa się w wysoce uporządkowany nanoarkusz³ (Rys. 1).

Peptoid blokujący ładunek H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]_{9-NH 2} został zsyntetyzowany na 100 mg żywicy amidowej lodowiska. Roztwór 2 M aminy zastosowano we wszystkich reakcjach wypierania, które prowadzono przez 60 minut dla pozostałości 1-18 i 120 minut dla pozostałości 19-36. HCl t-butylu beta-alaniny został przekształcony w wolną zasadę (patrz dyskusja), podczas gdy fenyloetyloamina i boc-etylenodiamina były stosowane bezpośrednio. Żywicę rozszczepiano 95% TFA, 2,5% triispropylilanu, 2,5% wody przez 2 godziny. TFA odparowano, a powstały lepki olej (~180 mg) ponownie rozpuszczono w 6 ml acetonitrylu:wody 1:1 (v/v). Czystość produktu (rys. 4) oraz obecność masy produktu potwierdzono za pomocą analitycznego RP-HPLC (30-80% acetonitrylu w gradieniu wody, oba zawierające 0,1% (v/v) TFA, przy 1 ml/min przez 30 minut w temperaturze 60 °C przy kolumnie C18, 5 μm, 50 X 2 mm) i MALDI (rys. 5).

Oczyszczanie za pomocą HPLC z odwróconą fazą na kolumnie Vydac C18 (10 μm, 22 mm x 250 mm) przebiegało przy użyciu gradientu 30-60% acetonitrylu w wodzie z 0,1% TFA przez 60 minut przy 10 ml / min. Kolumnę załadowano 60 mg surowego produktu dla każdej serii chromatograficznej. Oczyszczone frakcje połączono na podstawie czystości z analitycznego RP-HPLC (ryc. 4) i liofilizowano w celu uzyskania _̃80 mg puszystego białego proszku.

Oczyszczona masa cząsteczkowa peptoidu o ładunku blokowym została potwierdzona przez MALDI. 1 μL 100 μM oczyszczonego peptoidu w acetonitrylu:wodzie 1:1 (v/v) zmieszano z 1 μL matrycy (5 mg/ml kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego w acetonitrylu:woda 1:1 v/v i 0,1% TFA) i 1 μL zauważono na płytce MALDI. Po wysuszeniu próbki na powietrzu umieszczono ją w analizatorze Applied Biosystem/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF. Tryby akwizycji i przetwarzania były liniowe o niskiej masie. Obliczona masa została wprowadzona do masy docelowej, aby automatycznie dostosować się do czasu opóźnienia. Natężenie lasera zostało ustawione na 3400. Obserwowana masa, 4981,2, jest ściśle zgodna z obliczoną masą 4981,74.

Liofilizowany oczyszczony proszek został rozpuszczony w DMSO w celu wytworzenia 2 mM roztworu podstawowego, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C. Arkusze zostały przygotowane zgodnie z wyżej wymienionym protokołem i zobrazowane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej i SEM (Rys. 2 i 3). Obserwuje się różnorodne kształty o rozmiarach elementów do 300 μm, a w szczególności widoczne są proste krawędzie.

Rysunek 1. Sekwencja peptoidu ładunku blokowego H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]_{9-NH 2}. Jednołańcuchowy, naładowany blokowo, amfifilowy polipeptoid 36-merowy samoorganizuje się w wysoce uporządkowane, dwuwymiarowe nanoarkusze³. Obliczona masa cząsteczkowa wynosi 4981.74.

Rysunek 2. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej nanoarkuszy peptydowych. Arkusze uformowano z 20 μM roztworu peptydu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Arkusze zostały zobrazowane na agarozie z 1μM czerwienią nilową. Podziałka wynosi 100 μm.

Rysunek 3. Obrazy nanoarkuszy peptydowych ze skaningowej mikroskopii elektronowej. Arkusze uformowano z 20 μM roztworu peptydu w 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Podziałka wynosi 5 μm.

Rysunek 4. Analityczny ślad HPLC w odwróconej fazie H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]_{9-NH 2}. Przedstawiono surowy i oczyszczony analityczny ślad HPLC (gradient 30–80% przy 1 ml/min przez 30 minut w temperaturze 60 °C z kolumną C18, 5 μm, 50 x 2 mm) surowego i oczyszczonego peptoidu z ładunkiem blokowym H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]_{9-NH 2}.

Rysunek 5. Ślad spektroskopii mas MALDI-TOF H-[Nae-Npe]₉-[Nce-Npe]_{9-NH 2}. Obserwowana masa 4981,2 jest ściśle zgodna z masą obliczoną 4981,74.

Discussion

Zastosowania i znaczenie

Protokół ten opisuje prostą i wydajną metodę syntezy peptydów oraz wodnej samoorganizacji peptoidów w nanoarkusze. Większość laboratoriów jest w stanie z łatwością zsyntetyzować peptoidy, ponieważ wykorzystuje się niedrogie materiały, podstawową wiedzę specjalistyczną i proste techniki⁴. Podobnie, samoorganizacja ultracienkich, wysoce uporządkowanych nanoarkuszy wymaga jedynie wielokrotnego przechylania fiolki z rozcieńczonym wodnym roztworem peptydu². Peptoidy są obiecującymi materiałami do badań biomedycznych i nanonauki, ponieważ są wytrzymałe i syntetycznie elastyczne, a jednocześnie specyficzne dla sekwencji i wysoce przestrajalne⁵. Peptoidy wykazały aktywność biologiczną (terapie^6,7, diagnostyka⁸, dostarczanie wewnątrzkomórkowe^9-10) i składanie się w hierarchiczne nanostruktury^{3, 11-14}. Ze względu na ich modułową syntezę, kombinatoryczne biblioteki peptoidów^15-19 mogą być łatwo syntetyzowane i badane pod kątem szerokiej serii działań lub właściwości. W szczególności nanoarkusze służą jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań wyświetlających, mimetyki membranowej, czujników biologicznych, mimetyki białek i produkcji urządzeń. Dzięki praktycznie niewyczerpanym różnym sekwencjom, dziedzina badań nad peptoidami szybko się rozszerza.

Zmienne w syntezie submonomerów polipeptoidów w fazie stałej

Ze względu na możliwość wyboru spośród niewiarygodnie dużego i zróżnicowanego alfabetu monomerów²⁰, metoda submonomerów wymaga sporadycznych modyfikacji w przypadkach, w których zwiększenie wydajności sprzężenia na każdym etapie poprawi ogólną wydajność produktu. Włączenie niezabezpieczonych heterocyklicznych łańcuchów bocznych wymaga użycia kwasu chlorooctowego zamiast kwasu bromooctowego²¹. Wydłużone czasy przemieszczenia i wyższe stężenia amin są zwykle stosowane po około 20 sprzęgnięciach dla długich sekwencji peptyidowych lub mniej amin nukleofilowych. Podgrzanie naczynia reakcyjnego do temperatury 35 °C, przy użyciu naczynia reakcyjnego z płaszczem wodnym, pomaga w napędzaniu reakcji. W przypadku wysoce lotnych amin, takich jak izopropyloamina, należy zachować ostrożność, aby uniknąć parowania.

Aminy w postaci soli HCl, takie jak chlorowodorek beta-alaniny t-butylu, muszą być na wolnym bazie przed wprowadzeniem do reakcji wypierania. Można to osiągnąć poprzez rozpuszczenie lub zawieszenie aminy w DCM ( ��5g aminy/25 ml DCM) i zobojętnienie równomolowym roztworem wodnego wodorotlenku sodu w rozdzielaczu. Warstwa DCM jest zbierana, a warstwa wodna jest przemywana dodatkowym DCM. Połączone warstwy DCM są suszone na siarczanie sodu i filtrowane do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej. Usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie obrotowe, aby uzyskać olej, i zapisać masę produktu.

Na etapie rozszczepienia, koktajlu rozszczepienia TFA i czasu dekoltu zależy od liczby i różnorodności zastosowanych grup ochronnych. Wytyczne dotyczące koktajli dekoltujących są podobne do tradycyjnych peptydowych deprotekcyjnych dekoltów¹. Ogólnie rzecz biorąc, 10-minutowe inkubacje są wymagane w przypadku sekwencji bez grup ochronnych lub sekwencji z kilkoma wysoce kwasowymi labilnymi grupami ochronnymi (np. BOC, trytyl). Dwugodzinne inkubacje są zalecane dla sekwencji z trudniejszymi grupami ochronnymi (np. ester t-butylu, Mtr, Pbf) lub sekwencji z wieloma grupami ochronnymi, aby zapewnić pełną deprotekcję każdego łańcucha. Surowe produkty peptydowe na ogół rozpuszczają się w acetonitrylu:wodzie w stosunku 1:1 (v/v), ale wyższe proporcje acetonitrylu są powszechne w przypadku łańcuchów bocznych o wysokiej ogólnej hydrofobowości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimetyloformamid	EMD Millipore	EM-DX1726P-1	99 + %
N-metylopirolidynon	VWR	BDH1141-4LP	99%
Kwas bromooctowy	Acros Organics	200000-106	99%
4-metylopipryrydyna	Sigma-Aldrich	M73206	96%
N,N'-diizopropylokarbodimid	Chem-Impex International	001100	99,5%
Dichlorometan	EMD Milipor	EMD-DX0835	Klasa ACS
Acetonitryl	EMD Milipor	EM-AX0145P-1	99,8%
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508	99%
Triizopropylosilan	Sigma-Aldrich	233781-10G	Do rozszczepienia TFA
1,2-Dichlor– thane	JT Baker	JTH076-33	Do silikonowania szklanych naczyń reakcyjnych
Fenyloetyloamina	Sigma-Aldrich	407267-100ML	99,5% Hydrofobowa amina łańcucha bocznego
Boc-etylenodiamina	CNH Technologies	C-1112	Kationowa amina o łańcuchu bocznym
t-butyl beta-alanina HCl	Chem-Impex International	04407	Anionowa amina o łańcuchu bocznym
i kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy	Sigma-Aldrich	C8982-10X10MG	Do matrycy MALDI
Nil Red	Sigma-Aldrich	19123-10MG	Do obrazowania fluorescencyjnego
Dichlorodimetylosilan	Sigma-Aldrich	80430-500G-F Do	silikonowania szklanych naczyń reakcyjnych
Jednorazowy wkład spiekany PP	Zastosowane separacje	2416	Wkład polipropylenowy 6 ml z frytą PE 20 mm
Jednorazowy 3-drożny adapter luer	Cole-Parmer	31200-80	Kranek do jednorazowego ręcznego naczynia reakcyjnego syntezy
Pierścień Luer Lock	Cole-Parmer	45503-19	1/4" złączka do jednorazowego ręcznego naczynia reakcyjnego do syntezy
Złączki Luer	Cole-Parmer	45500-20	1/4" złączka do jednorazowego naczynia reakcyjnego do syntezy ręcznej
Jednorazowe pipety PP	VWR international	16001-194	Do transferów TFA
Plastikowa strzykawka Luer lock	National Scientific	S7515-5	Strzykawki 6 ml
1 szklana fiolka dram	VWR international	66011-041	Z fenolową formowaną nakrętką z wkładką z masy celulozowej z poliwinylu
Fiolka scyntylacyjna 20 ml	VWR international	66022-060	Z dołączoną nakrętką PP i wkładką z folii celulozowej
Dystans samoprzylepny Secure-Seal	Invitrogen	S-24736	Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełka	podstawoweMikroskopia elektronowa Sciences	63411	Do obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełko nakrywkowe	VWR international	48366-067	Do obrazowania fluorescencyjnego
4” Wafel krzemowy	Ted Pella, Inc.	16007	Kostki do gry w wióry 5x7 mm
Filtr 0,45	VWR international	28143-924	Do HPLC. Membrana PTFE
Agaroza	BD Biosciences	212272	Do obrazowania fluorescencyjnego
Kolektor próżniowy SPE	Sigma-Aldrich	57044	Przykład kolektora próżniowego SPE
Naczynie ze szkła spiekanego	Szkło asowe	6402-12	Porowatość C fryta
Środek do czyszczenia / sterylizatora plazmowego	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G	Przykład urządzenia do czyszczenia plazmowego do przygotowania chipów krzemowych do SEM