Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy

Podsumowanie

Opisano kluczowe techniki stosowane w ocenie zapalenia pochwy spowodowanego przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwalają na szybkie pobranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą posłużyć do stworzenia modeli mysich innych chorób dolnych dróg rodnych u samic.

Streszczenie

Kandydoza wulwopodpochwowa (VVC), wywoływana przez gatunki Candida, jest grzybiczą infekcją dolnych dróg rodnych kobiety, która dotyczy około 75% zdrowych kobiet w wieku rozrodczym^18,32-34. Czynniki predysponujące obejmują stosowanie antybiotyków, niekontrolowaną cukrzycę oraz zaburzenia poziomu hormonów rozrodczych wynikające z ciąży, stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych lub hormonalnej terapii zastępczej^33,34. Nawracająca kandydoza wulwopodpochwowa (RVVC), definiowana jako trzy lub więcej epizodów w roku, dotyczy dodatkowo od 5 do 8% kobiet bez czynników predysponujących³³.

Ustanowiono eksperymentalny mysi model VVC, który wykorzystano do badania patogenezy oraz odpowiedzi błony śluzowej gospodarza na Candida^{3,4,11,16,17,19,21,25,37}. Model ten został również zastosowany do testowania potencjalnych terapii przeciwgrzybiczych in vivo^13,24. Model ten wymaga utrzymywania zwierząt w stanie pseudoestrusu w celu optymalizacji kolonizacji/infekcji Candida^6,14,23. W takich warunkach u zaszczepionych zwierząt wykrywalna liczba grzybów w pochwie utrzymuje się od kilku tygodni do kilku miesięcy. Dotychczasowe badania wykazują niezwykle wysoką zbieżność między modelem zwierzęcym a infekcją u ludzi w odniesieniu do właściwości immunologicznych i fizjologicznych^3,16,21. Różnice obejmują jednak brak Candida jako normalnej flory pochwy oraz neutralne pH pochwy u myszy.

W niniejszej pracy prezentujemy serię kluczowych metod w mysim modelu zapalenia pochwy, obejmujących inokulację pochwy, szybkie pobieranie próbek z pochwy, ocenę obciążenia grzybiczego pochwy oraz przygotowanie tkanek do ekstrakcji/izolacji komórek. Następnie przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące składników płynu z płukania pochwy, obciążenia grzybiczego oraz wydajności uzyskiwania leukocytów z drenujących węzłów chłonnych. Dzięki zastosowaniu środków znieczulających próbki z płukania można pobierać w wielu punktach czasowych od tych samych myszy w celu podłużnej oceny infekcji/kolonizacji. Ponadto model ten nie wymaga stosowania środków immunosupresyjnych do zainicjowania infekcji, co umożliwia prowadzenie badań immunologicznych w określonych warunkach gospodarza. Wreszcie, zaprezentowany tutaj model i każda z opisanych technik mogą potencjalnie znaleźć zastosowanie w badaniu innych chorób zakaźnych dolnych dróg rodnych kobiet (bakteryjnych, pasożytniczych, wirusowych) oraz odpowiadających im miejscowych lub systemowych mechanizmów obronnych gospodarza.

Protokół

1. Inokulacja pochwowa Candida albicans

1. Na trzy dni przed inokulacją, unieruchamiając zwierzę w celu odsłonięcia brzucha, wstrzyknąć podskórnie w dolną część brzucha 100 μl oleju sezamowego zawierającego 0,1-0,5 mg β-estradiolu. Igłę należy wprowadzić na głębokość około 5 do 10 mm bocznie względem skóry, aby zminimalizować wyciek z miejsca wstrzyknięcia.
   Podanie estrogenu podskórnie w dolnej części brzucha jest optymalne w tym modelu ze względu na bliskie sąsiedztwo z drogami rodnymi. Dawki skuteczne mogą się różnić w zależności od szczepów myszy, ich wieku lub pochodnych estrogenu. W poprzednich badaniach z wykorzystaniem myszy CBA-J (H-2^κ), C3H/HeN (H-2^κ), C57BL/6 (H-2^b), Balb/c (H-2^d), DBA/2 (H-2^d), SJL (H-2^s) w wieku 6-8 tygodni, za skuteczną uznano dawkę 0,1 mg/100 μl, co potwierdzono pogrubieniem ścian pochwy, zmniejszeniem ilości śluzu pochwowego oraz zwiększonym złuszczaniem komórek nabłonkowych. Myszy traktowane estrogenem w tym stężeniu wykazują trwałą kolonizację pochwy przez Candida. W przypadku inokulacji myszy innych szczepów i w innym wieku zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego, aby zapewnić skuteczność estrogenu w zmodyfikowanych warunkach i w razie potrzeby zwiększyć dawkę estrogenu.
   Roztwór estrogenu należy przygotowywać na świeżo w dniu wstrzyknięcia. Aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność estrogenu w oleju sezamowym, roztwór należy dokładnie wymieszać za pomocą mieszadła wirówkowego i okresowo podgrzewać do 37°C. Iniekcję powtarzać co tydzień przez cały okres trwania badania.
2. Aby przygotować inokulum, nanieść pętlą blastokonidia C. albicans z niedawnej subkultury na agarze Sabourauda z dekstrozą (SDA) do 10 ml bulionu Phytone-peptone uzupełnionego o 0,1% glukozy. Hodowlę w bulionie inkubować do fazy stacjonarnej przez 18 h w 25°C w kołyszącej łaźni wodnej.
3. Po inkubacji przenieść hodowlę z bulionu do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 800 x g przez 5 min. Osad przemyć dwukrotnie sterylnym PBS.
4. Policzyć żywe blastokonidia za pomocą komory licznikowej (hemocytometru) z wykorzystaniem metody wykluczania barwnika trypan blue. Dostosować stężenie komórek do 2,5 x 10⁶/ml (lub do pożądanego stężenia inokulum) w sterylnym PBS.
5. Aby ustabilizować mysz, chwycić podstawę ogona dwoma palcami i unieść biodra do góry tak, aby otwór pochwy był skierowany w stronę operatora (Rysunek 1A). Idealnie jest, jeśli mysz zostanie umieszczona na płaskiej, kratowej powierzchni (np. na górze klatki), tak aby zwierzę mogło stawiać opór przeciwko unieruchomieniu ogona.
6. Nabiorem pipety pobrać 20 μl (lub inną pożądaną objętość nieprzekraczającą 20 μl) zawiesiny inokulum, wprowadzając końcówkę pipety na głębokość około 5 mm do światła pochwy (Rysunek 1B). Krok ten należy wykonać jak najszybciej i jak najdelikatniej, aby zminimalizować stres u myszy.

2. Płukania pochwy

1. Po eutanazji (lub znieczuleniu) trzymaj mysz skierowaną w dół, chwytając za nasadę ogona dwoma palcami, tak aby otwór pochwy był odsłonięty.
2. Przeprowadź płukanie światła pochwy, wprowadzając 100 μl sterylnego PBS, wykonując wielokrotne aspiracje i mieszanie końcówką pipety. Końcówka pipety może zostać zatkana komórkami. W takim przypadku usuń blokujące komórki i kontynuuj płukanie pozostałym w pochwie PBS. Zbierz płyn z płukania do probówki do mikrocentryfugi.
3. Alternatywnie płukanie pochwy można przeprowadzić u myszy znieczulonych wziewnie izofluranem. W tym celu wystaw myszy na działanie odparowanego izofluranu aż do pełnego uspokojenia (~30 sec.). Trzymaj myszy skierowane w dół za nasadę ogona i delikatnie wypłucz światło pochwy, używając 50 μl sterylnego PBS. Należy unikać gwałtownego mieszania końcówką pipety, aby zminimalizować urazy pochwy podczas tej procedury. Uśpione myszy powinny dojść do siebie po znieczuleniu w ciągu 30 sec od wystawienia na powietrze otoczenia.
   
   Izofluran można odparować przy użyciu waporyzatora do izofluranu i O₂ (preferowane) lub standardowej zamkniętej komory anestezjologicznej z systemem kroplowym bez systemu waporyzacji (wymaga ścisłego monitorowania zwierzęcia podczas sedacji, aby uniknąć niewydolności oddechowej).
   
   Płukanie pochwy u myszy znieczulonych powinno być metodą z wyboru w przypadku podłużnego pobierania próbek z płukania od tych samych zwierząt. Kolejne płukania nie wpływają na ocenę obciążenia grzybiczego w czasie⁴¹.
4. Do preparatów w metodzie mokrej przenieś 10 μl płynu z płukania na szkiełko przedmiotowe i obserwuj przy powiększeniu 400-1000x za pomocą mikroskopii świetlnej. Dodatkowo frakcje komórkowe płynu z płukania można zabarwić w celu zbadania morfologii komórek i jąder. Do preparatów rozmazowych przenieś 10 μl płynu z płukania na szkiełko przedmiotowe i delikatnie rozmaż, używając zewnętrznej ścianki końcówki pipety. Próbki rozmazów utrwal fiksatywem CytoPrep i zabarw standardową techniką Papanicolaou (cytologia Pap). Obserwuj przy powiększeniu 400 × za pomocą mikroskopii świetlnej.

3. Ilościowe oznaczenie obciążenia grzybiczego pochwy

1. W płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem przenieś płyn z płukania do jednego dołka w górnym rzędzie oraz 180 μl sterylnego PBS do kolejnych 5 dołków w tej samej kolumnie (w dół płytki).
2. Przygotuj seryjne rozcieńczenia płynu z płukania pochwy w stosunku 1:10, przenosząc 20 μl płynu do następnego dołka w kolumnie. Przed każdym przeniesieniem wymieszaj dokładnie zawartość poprzez wielokrotne pipetowanie. Seryjne rozcieńczenia do 12 próbek z płukania (pełny rząd poziomy) można wykonać jednocześnie, używając pipety 12-kanałowej.
3. Zaczynając od najniższego rozcieńczenia, przenieś 10 μl próbki na agar Sabourauda z dekstrozą (SDA). Posiew do 36 próbek można wykonać na jednej płytce, używając SDA przygotowanego w kwadratowych szalkach Petriego z siatką oraz wielokanałowej pipety z regulowanym odstępem.
4. Wylicz jednostki tworzące kolonie (CFU) po inkubacji w temperaturze 34°C przez 48 h.

4. Ekstrakcja tkanki pochwy

1. Po przeprowadzeniu procedury przemywania pochwy, ułożyć uśpioną mysz na grzbiecie i nasączyć okolicę pachwin 70% etanolem. Za pomocą pęsety unieść ujście cewki moczowej do góry, aby odsłonić otwór pochwy.
2. Wprowadzić zakrzywioną pęsetę do światła pochwy i zlokalizować szyjkę macicy. Utrzymując mocny chwyt pęsetą, wyciągnąć szyjkę macicy przez jamę pochwy (Rysunek 2A-C).
3. Wyciąć pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie oddzielić szyjkę macicy od pochwy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Należy pamiętać, że tkanka pochwy jest wywinięta (wewnętrzna strona nabłonkowa pochwy jest wystawiona na zewnątrz). Tkankę można odwrócić bocznie, aby zachować pierwotną orientację pochwy, lub rozciąć wzdłuż boku, aby uzyskać płaski arkusz.
   
   Wycięte tkanki pochwy mogą być wykorzystane do: 1) ekstrakcji limfocytów po trawieniu kolagenazą (~1 ×10⁴/mysz)⁴⁰, 2) izolacji komórek nabłonkowych po trawieniu dyspazą (~5 ×10⁴/mysz)²⁸, 3) preparatów mrożonych lub zatopionych w parafinie do analiz histologicznych²⁵.

5. Wycięcie węzłów chłonnych lędźwiowych

1. Po przeprowadzeniu procedury płukania pochwy, połóż eutanazowaną mysz na grzbiecie i nasącz brzuch 70% etanolem. Wykonaj nacięcie boczne od dolnej części brzucha aż do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne. Używając pęset w obu dłoniach, przesuń jelita ku górze, tak aby centralne naczynia krwionośne stały się widoczne.
2. Zlokalizuj żyłę główną dolną oraz aortę brzuszną. Zazwyczaj para węzłów chłonnych lędźwiowych znajduje się w sąsiedztwie aorty brzusznej, mniej więcej w połowie drogi między odejściem tętnic nerkowych a tętnicami biodrowymi wewnętrznymi³⁹. Węzły chłonne te można odróżnić od tkanki tłuszczowej po elastycznej teksturze oraz jaśniejszym, bardziej nieprzezroczystym kolorze (Rycina 3). Węzły chłonne te są wyraźnie powiększone u zwierząt zainfekowanych w porównaniu do zwierząt nieinokulowanych.
3. Wyciśnij węzły chłonne, umieszczając mikropęsetę pod węzłem, a następnie delikatnie pociągnij w górę, aby oddzielić go od otaczającej tkanki.

6. Izolacja komórek limfoidalnych w zawiesinach jednokomórkowych

1. Przenieś węzły chłonne na sterylne sito z drucianej siatki (o rozmiarze około 3 x 3 cm²) umieszczone w sterylnej szklanej płytce Petri zawierającej ˜10 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) (Rysunek 4).
2. Przy lekko nachylonej płytce Petri dociśnij węzły chłonne do siatki za pomocą tłoka strzykawki. Upewnij się, że wszystkie węzły chłonne zostały rozdrobnione, tak aby zawartość komórkowa węzłów przeszła przez siatkę, podczas gdy komponenty niekomórkowe (tj. błony, zrąb, tłuszcz) pozostały na niej.
3. Za pomocą tego samego tłoka i strzykawki odessij HBSS zawierający komórki. Przepłucz siatkę ˜5 ml HBSS i zbierz pozostałą ciecz do stożkowej probówki 15 ml.
4. Wiruj przy 800 x g przez 10 min. Przed usunięciem cieczy odessaj pipetą wszelkie złogi tłuszczu znajdujące się na powierzchni płynu. Przemyj osad komórkowy trzykrotnie roztworem HBSS. Resuspenduj osad w 1 ml HBSS i policz żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanu.

7. Reprezentatywne wyniki:

Frakcje komórkowe płynu z przemywania pochwy u myszy inokulowanych >4 dni temu zazwyczaj składają się z Candida, komórek nabłonkowych i nacieków komórkowych (Rysunek 5). W badaniu mikroskopowym preparatu świeżego Candida można zidentyfikować wizualnie na podstawie obecności strzępek oraz drożdżaków (Rysunek 5A). Preparaty rozmazowe płynu z przemywania pochwy można barwić metodą Papanicolaou w celu oceny komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, wśród których głównymi komórkami są neutrofile, rozpoznawane po trójpłatowych jądrach (Rysunek 5B). U myszy nieinokulowanych wykrywa się bardzo mało neutrofili lub nie stwierdza się ich wcale (Rysunek 5C)⁴¹.

Przykład obciążenia grzybiczego pochwy przedstawiono na rysunku 6. Płyn z płukania pochwy pobrany w określonych punktach czasowych jest poddawany hodowli w celu wyliczenia CFU (rysunek 6A). Kolonizacja/infekcja pochwy drożdżakami z rodzaju Candida utrzymuje się przez wiele tygodni u myszy inokulowanych i traktowanych estrogenem (rysunek 6B), podczas gdy u myszy inokulowanych, ale niepoddanych działaniu estrogenu, nie dochodzi do kolonizacji pochwy przez Candida (rysunek 6C). Myszy nieinokulowane, traktowane estrogenem, pozostają ujemne w kierunku Candida przez cały czas trwania badania (dane nie pokazano). Ponadto płukanie pochwy można przeprowadzić jednorazowo na osobnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych zwierząt w znieczuleniu.

Lędźwiowe węzły chłonne są głównymi węzłami drenującymi układ rozrodczy i stanowią najważniejsze miejsce oceny systemowych odpowiedzi immunologicznych na wyzwanie dopochwowe. Należy zauważyć, że węzły chłonne te mogą ulec powiększeniu u myszy inokulowanych, podczas gdy u myszy nieinokulowanych zazwyczaj pozostają bardzo małe. Odzysk komórek leukocytarnych wynosi zazwyczaj od 8 × 10⁵/mysz nieinokulowana do 5 ×10⁶/mysz inokulowana. Oprócz lędźwiowych węzłów chłonnych można wykorzystać również węzły chłonne pachwinowe, podkolanowe oraz krezkowe.

Rycina 1. Inokulacja pochwowa z użyciem Candida. A) Mysz unieruchomiona do inokulacji. Myszy umieszcza się na drucianej wkładce klatki i trzyma za nasadę ogona, lekko unosząc go do góry, aby unieść kończyny i odsłonić otwór pochwy. Biodro myszy można stabilizować tą samą ręką, jeśli zwierzę próbuje stawiać opór unieruchomieniu za ogon. B) Wprowadzanie inokulum do światła pochwy. Końcówkę pipety delikatnie wprowadza się na głębokość około 5 mm do światła pochwy. Następnie nanosi się zawiesinę inokulum.

Rysunek 2. Ekstrakcja tkanki pochwy. A-B) Ekstrakcja szyjki macicy. Szyjkę macicy lokalizuje się za pomocą pęsety zakrzywionej i wystawia na zewnątrz poprzez jamę pochwy. Po wyprowadzeniu z jamy pochwy, szyjkę macicy odciąga się dalej, aby w pełni odsłonić pochwę. C) Ekstrakcja pochwy. Pochwę wycina się od sromu za pomocą nożyczek. Po oddzieleniu należy usunąć szyjkę macicy z pochwy.

Rysunek 3. Identyfikacja węzłów chłonnych lędźwiowych. Wskazano położenie węzłów chłonnych lędźwiowych pomiędzy otaczającymi organami/naczyniami krwionośnymi w okolicy miednicy. A, aorta brzuszna. B, pęcherz moczowy. C, wspólna tętnica biodrowa. I, jelita. L, wątroba. R, odbytnica. S, śledziona. U, macice.

Rysunek 4. Węzły chłonne lędźwiowe umieszczone na siatce drucianej. Węzły chłonne są gromadzone na siatce umieszczonej w szalce Petriego z HBSS. Węzły chłonne są dociskane do siatki tłokiem strzykawki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek limfoidalnych.

Rycina 5. Frakcje komórkowe płynu z przemywania pochwy u myszy zaszczepionych. A) Preparaty w metodzie mokrej i B) preparaty cytologiczne (rozmaz Pap) próbek z przemywania pochwy pobranych 4 dni po inokulacji oraz C) od myszy niezaszczepionych. Obrazy przedstawiono przy powiększeniu 1000× (A) lub 400× (B, C). Wstawka w B pokazuje morfologię jąder neutrofili pochwowych przy powiększeniu 1000×. Oznaczono drożdżaki (Y) i strzępki (H) Candida, komórki nabłonkowe (EC) oraz neutrofile (N).

Rysunek 6. Wykrywanie obciążenia grzybiczego pochwy. A) Reprezentatywne kolonie C. albicans wyhodowane na płytce SDA. Próbki płukania w postaci niepoddanych rozcieńczeniu (N) od sześciu różnych inokulowanych myszy (górny rząd) zostały poddane rozcieńczeniom seryjnym i wysiane w celu wyznaczenia liczby CFU. B) Ilościowe określenie obciążenia grzybiczego pochwy u myszy traktowanych estrogenem i C) u myszy nietraktowanych estrogenem. Liczbę CFU/100 μl płynu do płukania od inokulowanych myszy oceniano w wskazanych punktach czasowych.

Dyskusja

Eksperymentalny model zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy został opracowany i wykorzystywany przez ostatnie kilka dekad do badania odpowiedzi błon śluzowych gospodarza na Candida, a także do testowania terapii przeciwgrzybiczych^{3,4,11,13,16,17,19,21,24,25,37}. Przedstawione tutaj protokoły wykorzystują wydajne i mniej pracochłonne metody i wydają się być jednym z najlepiej zoptymalizowanych systemów modelowych zapalenia pochwy przez Candida opisanych do tej pory. Technik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
samice myszy CBA/J	Charles River Laboratories	01C38	wiek 5–6 tygodni
Candida albicans (3153A)	Krajowa Kolekcja Grzybów Patogennych, Wielka Brytania	NCPF3153
olej sezamowy	Sigma-Aldrich	S3547	D–nie wymagają wstępnej sterylizacji przed użyciem
Βestradiolu 17-walerianian	Sigma-Aldrich	E1631	0,1–0,5 mg w oleju sezamowym
Pepton fitonowy pepton	BD Biosciences	211906	Uzupełnić o 0,1% glukozy
roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154
agar Sabourauda z dekstrozą	BD Biosciences	211584
Kolagenaza typu IV	Sigma-Aldrich	C5138	0.25%
Dyspaza	Invitrogen	17105-041	1,7 U/ml
Sita z siatki drucianej	TWP	Tekst źródłowy nie zawiera treści do przetłumaczenia. Proszę o dostarczenie materiału w języku angielskim.	Nr 60 mesh, stal nierdzewna
Hanks’ zrównoważony roztwór soli	Invitrogen	24020-117
utrwalacz CytoPrep	Fisher Scientific	12-570-10	Konserwuje preparaty rozmazowe
barwienie Papanicolaou EA-65	EMD Millipore	7054X-85
barwienie Papanicolaou OG-6	EMD Millipore	7052X-85
Harris’ Hematoksylina alumnowa	EMD Millipore	638A-85
Izofluran	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-60	Stosowana z waporyzatorem izofluranu lub w zamkniętej komorze anestezyjnej z systemem kroplowym