Protokoły inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym mysim modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida

Summary

Opisano kluczowe techniki do oceny zapalenia pochwy wywołane przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwolą na szybkie pobranie wycinków z pochwy i limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą dać początek mysim modelom innych chorób w dolnych drogach rodnych kobiet.

Abstract

Kandydoza sromu i pochwy (VVC), wywoływana przez gatunki Candida, to infekcja grzybicza dolnych żeńskich dróg rodnych, która dotyka około 75% zdrowych kobiet w okresie rozrodczym^18,32-34. Do czynników predysponujących należą: stosowanie antybiotyków, niekontrolowana cukrzyca i zaburzenia poziomu hormonów rozrodczych spowodowane ciążą, doustnymi środkami antykoncepcyjnymi lub hormonalnymi terapiami zastępczymi^33,34. Nawracające VVC (RVVC), definiowane jako trzy lub więcej epizodów rocznie, dotyka od 5 do 8% kobiet bez czynników predysponujących³³.

Eksperymentalny mysi model VVC został stworzony i wykorzystany do badania patogenezy i odpowiedzi śluzówkowej gospodarza na Candida^{3,4,11,16,17,19,21,25,37}. Model ten został również wykorzystany do testowania potencjalnych terapii przeciwgrzybiczych in vivo^13,24. Model wymaga, aby zwierzęta były utrzymywane w stanie rui rzekomej w celu optymalnej kolonizacji/zakażenia Candida ^6,14,23. W takich warunkach zaszczepione zwierzęta będą miały wykrywalne obciążenie grzybicze pochwy przez tygodnie lub miesiące. Wcześniejsze badania wskazują na niezwykle dużą paralelę między modelem zwierzęcym a ludzką infekcją w odniesieniu do właściwości immunologicznych i fizjologicznych^3,16,21. Różnice obejmują jednak brak Candidy jako normalnej flory pochwy i neutralne pH pochwy u myszy.

Tutaj demonstrujemy szereg kluczowych metod w modelu zapalenia pochwy myszy, które obejmują szczepienie pochwy, szybkie pobieranie próbek z pochwy, ocenę obciążenia grzybicą pochwy oraz przygotowanie tkanek do ekstrakcji/izolacji komórek. Następnie przedstawiono reprezentatywne wyniki dla składników płynu z płukania pochwy, obciążenia grzybami i wydajności leukocytów w węzłach chłonnych. Za pomocą środków znieczulających, próbki płukania mogą być pobierane w wielu punktach czasowych na tych samych myszach w celu długotrwałej oceny infekcji/kolonizacji. Co więcej, model ten nie wymaga żadnych leków immunosupresyjnych do zainicjowania infekcji, co pozwala na badania immunologiczne w określonych warunkach gospodarza. Wreszcie, model i każda z przedstawionych tu technik mogą potencjalnie dać początek zastosowaniu metodologii do badania innych chorób zakaźnych dolnych dróg rodnych kobiet (bakteryjnych, pasożytniczych, wirusowych) oraz odpowiednich lokalnych lub ogólnoustrojowych mechanizmów obronnych gospodarza.

Protocol

1. Inokulacja dopochwowa Candida albicans

1. Trzy dni przed szczepieniem, powstrzymując zwierzę przed odsłonięciem brzucha, wstrzyknąć podskórnie w dolną część brzucha 100 μl oleju sezamowego zawierającego 0,1-0,5 mg β-estradiolu. Przesunąć igłę o około 5 do 10 mm w bok od skóry, aby zminimalizować wyciek z miejsca wstrzyknięcia.
   Podskórne podawanie estrogenu w dolnej części brzucha jest w tym modelu optymalne ze względu na bliskie sąsiedztwo dróg rodnych. Skuteczne dawki mogą się różnić w zależności od szczepów myszy, wieku lub pochodnych estrogenów. W poprzednich badaniach z udziałem myszy CBA-J (H-2^κ), C3H/HeN (H-2^κ), C57BL/6 (H-2^b), Balb/c (H-2^d), DBA/2 (H-2^d), SJL (H-2^s) w wieku 6-8 tygodni stwierdzono skuteczność 0,1 mg/100 μl, o czym świadczy pogrubienie ściany pochwy, zmniejszenie śluzu pochwowego i zwiększone złuszczanie się komórek nabłonka. Myszy powyżej leczone estrogenem w tym stężeniu wykazują konsekwentną kolonizację pochwy Candida. W przypadku inokulacji u myszy z innych szczepów i w innym wieku zaleca się badanie pilotażowe w celu zapewnienia skuteczności estrogenu w zmodyfikowanych warunkach i zwiększenia dawki estrogenu, jeśli to konieczne.
   Roztwór estrogenu powinien być przygotowywany świeży za każdym razem w dniu wstrzyknięcia. Aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność estrogenu w oleju sezamowym, należy dokładnie wymieszać roztwór za pomocą mieszalnika wirowego i podgrzewać z przerwami w temperaturze 37°C. Powtarzaj wstrzyknięcie co tydzień przez cały okres badania.
2. Aby przygotować inokulum, dodaj pętlę blastokonidiów C. albicans z niedawnego preparatu subkultury na agarze z dekstrozą Sabouraud (SDA) do 10 ml bulionu Phytone-peptone uzupełnionego 0,1% glukozy. Inkubować kulturę bulionową do fazy stacjonarnej przez 18 godzin w temperaturze 25°C w wytrząsającej łaźni wodnej.
3. Po inkubacji zebrać kulturę bulionową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut. Przemyć osad dwukrotnie sterylnym PBS.
4. Wylicz żywotne blastokonidia na hemocytometrze przez wykluczenie niebieskiego barwnika trypanowego. Dostosuj stężenie komórek do 2,5 x 10⁶/ml (lub do pożądanego stężenia inokulum) w sterylnym PBS.
5. Aby ustabilizować mysz, przytrzymaj podstawę ogona dwoma palcami i unieś biodro do góry, tak aby otwór pochwy był skierowany w Twoją stronę (Rysunek 1A). Idealnie jest, jeśli mysz jest umieszczona na płaskiej, rusztowanej powierzchni (np. klatce), aby mysz mogła zapewnić opór przed ograniczeniem ogona.
6. Odpipetować 20 μl (lub żądaną objętość nie może przekraczać 20 μl) zawiesiny inokulum, wkładając końcówkę pipety na głębokość około 5 mm do światła pochwy (ryc. 1B). Wykonaj ten krok tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby zminimalizować niepokój myszy.

2. Płukanie pochwy

1. Po eutanazji (lub znieczuleniu) przytrzymaj mysz w dół za podstawę ogona dwoma palcami, aby otwór pochwy został odsłonięty.
2. Przepłukać światło pochwy, wprowadzając 100 μl sterylnego PBS z wielokrotnym zasysaniem i mieszaniem końcówką pipety. Końcówka pipety może zostać zatkana komórkami. Jeśli tak się stanie, dozuj blokujące komórki i kontynuuj płukanie pozostałym PBS w pochwie. Zebrać płyn z płukania do probówki mikrowirówkowej.
3. Alternatywnie, płukanie pochwy można wykonać na znieczulonych myszach za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem. W tym celu należy wystawić myszy na działanie odparowanego izofluranu, aż zostaną w pełni uspokojone (~30 sek.). Przytrzymaj myszy w dół za podstawę ogona i delikatnie przepłucz światło pochwy za pomocą 50 μl sterylnego PBS. Upewnij się, że unikasz ostrego potrząsania końcówką pipety, aby zminimalizować uraz pochwy podczas tej procedury. Myszy poddane uspokojeniu powinny wyzdrowieć ze znieczulenia w ciągu 30 sekund od wystawienia na działanie otaczającego powietrza.
   
   Izofluran może być waporyzowany za pomocą parownika izofluranu i O₂ (preferowane) lub standardowego systemu kroplowego, zamkniętej komory anestezjologicznej bez systemu parownika (wymaga ścisłego monitorowania zwierzęcia w stanie uspokojenia, aby uniknąć niewydolności oddechowej).
   
   Płukanie pochwy u znieczulonych myszy powinno być metodą z wyboru dla próbek płukania podłużnego na tych samych myszach. Następujące po sobie płukanie nie ma wpływu na ocenę obciążenia grzybami w czasie⁴¹.
4. W przypadku preparatów do montażu na mokro przenieść 10 μl płynu z płukania na szkiełko podstawowe i obserwować w powiększeniu 400-1000x za pomocą mikroskopii świetlnej. Dodatkowo frakcje komórkowe płynu popłuczynowego można barwić w celu zbadania morfologii komórek i jąder. W przypadku preparatów rozmazowych przenieść 10 μl płynu z płukania na szkiełko podstawowe i delikatnie rozprowadzić za pomocą zewnętrznej ścianki końcówki pipety. Próbki rozmazu należy zakonserwować utrwalaczem CytoPrep i wybarwić standardową techniką Papanicolaou (rozmaz cytologiczny). Obserwuj w powiększeniu 400 × za pomocą mikroskopu świetlnego.

3. Kwantyfikacja obciążenia grzybicą pochwy

1. W 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem przenieś płyn z płukania do jednego dołka w górnym rzędzie, a 180 μl sterylnego PBS do kolejnych 5 dołków tej kolumny (w dół płytki).
2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia płynu z płukania pochwy w stosunku 1:10, przenosząc 20 μl płynu do następnego dołka w kolumnie. Dokładnie wymieszać przez wielokrotne zasysanie przed każdym transferem. Seryjne rozcieńczenia do 12 próbek płukania (jeden pełny rząd poziomy) mogą być wykonywane jednocześnie za pomocą 12-kanałowej pipety.
3. Zaczynając od najniższego rozcieńczenia, przenieść 10 μl próbki na agar z dekstrozą Sabouraud (SDA). Posiew do 36 próbek można przeprowadzić na 1 płytce za pomocą SDA przygotowanego na kwadratowych szalkach Petriego z siatką i pipetą wielokanałową o regulowanych odstępach.
4. Wyliczyć jednostki tworzące kolonie (CFU) po inkubacji w temperaturze 34°C przez 48 godzin.

4. Ekstrakcja tkanki pochwy

1. Po zabiegu płukania pochwy połóż uśpioną mysz na plecach i nasyc obszar pachwiny 70% etanolem. Za pomocą kleszczy podnieś otwór moczowy do góry, tak aby otwór pochwy został odsłonięty.
2. Włóż parę zakrzywionych kleszczyków do światła pochwy i zlokalizuj szyjkę macicy. Trzymając mocno kleszcze, wyciągnij szyjkę macicy przez jamę pochwy (ryc. 2A-C).
3. Wytnij pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie usuń szyjkę macicy z pochwy nożyczkami chirurgicznymi. Należy pamiętać, że tkanka pochwy jest ewolucyjna (wewnętrzna strona nabłonka pochwy jest odsłonięta na zewnątrz). Tkanka może być albo odwrócona bocznie, aby zachować pierwotną orientację pochwy, albo otwarta w prześcieradło poprzez wykonanie bocznego nacięcia.
   
   Wycięte tkanki pochwy można wykorzystać do: 1) ekstrakcji limfocytów po trawieniu kolagenazą (~1 ×10⁴/mysz)⁴⁰, 2) izolacji komórek nabłonka po trawieniu przez rozkład (~5 ×10⁴/mysz)²⁸, 3) preparatów mrożonych lub zatopionych w parafinie do analiz histologicznych²⁵.

5. Wycięcie węzłów chłonnych lędźwiowych

1. Po zabiegu płukania pochwy połóż uśpioną mysz na plecach i nasyc jamę brzuszną 70% etanolem. Wykonaj boczne nacięcie zaczynając od dolnej części brzucha do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne. Używając kleszczy w obu rękach, przesuń jelita do góry, tak aby centralne naczynia krwionośne stały się widoczne.
2. Zlokalizuj żyłę główną dolną i aortę brzuszną. Zwykle parę węzłów chłonnych lędźwiowych można zidentyfikować w sąsiedztwie aorty brzusznej, znajdującej się mniej więcej w połowie drogi między początkiem tętnicy nerkowej a tętnicą biodrową wspólną³⁹. Te węzły chłonne można wizualnie odróżnić od tkanki tłuszczowej dzięki elastycznej teksturze i są jaśniejsze i bardziej nieprzezroczyste w porównaniu z tkanką tłuszczową (ryc. 3). Te węzły chłonne są zauważalnie większe u zakażonych zwierząt w porównaniu ze zwierzętami niezaszczepionymi.
3. Wytnij węzły chłonne, umieszczając mikrokleszcze pod węzłem, a następnie delikatnie pociągnij do góry, aby oddzielić się od otaczającej tkanki.

6. Izolacja komórek limfoidalnych w zawiesinach jednokomórkowych

1. Przenieś węzły chłonne na sterylną siatkę drucianą (o wymiarach około 3 x 3^cm2) umieszczoną wewnątrz sterylnej szklanej szalki Petriego zawierającej 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) (ryc. 4).
2. Przy lekko pochylonej szalce Petriego dociśnij węzły chłonne do ekranu za pomocą głowicy tłoka strzykawki. Upewnij się, że przerwałeś wszystkie węzły chłonne, aby zawartość komórkowa węzłów przeszła przez ekran, podczas gdy niekomórkowe składniki węzłów (tj. błony, zrąb, tłuszcz) pozostały na ekranie.
3. Za pomocą tego samego tłoka i strzykawki odessać komórki zawierające HBSS. Umyć sito za pomocą °5 ml HBSS i zebrać pozostały płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Wirować przy 800 x g przez 10 minut. Przed wyrzuceniem płynu odessać pipetą wszelkie złogi tłuszczu znajdujące się na wierzchu płynu. Umyj osad komórkowy trzykrotnie za pomocą HBSS. Zawiesić osad w 1 ml HBSS i zliczyć żywe komórki przez wykluczenie barwnika błękitu trypanowego.

7. Reprezentatywne wyniki:

Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy od >4-dniowych myszy zazwyczaj składają się z >Candida, komórek nabłonkowych i nacieków komórkowych (Rysunek 5). Za pomocą mikroskopii mokrej Candida można wizualnie zidentyfikować na podstawie obecności strzępek, a także drożdży (ryc. 5A). Preparaty rozmazowe płynu z płukania pochwy można barwić techniką Papanicolaou w celu zbadania komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, z których głównymi komórkami są neutrofile identyfikowane przez płaty trójjądrowe (ryc. 5B). Bardzo niewiele neutrofili, jeśli w ogóle, wykrywa się u niezaszczepionych myszy (Figura 5C)⁴¹.

Przykład obciążenia grzybicą pochwy pokazano na rysunku 6. Płyn z płukania pochwy pobrany w określonych punktach czasowych jest hodowany w celu wyliczenia CFU (ryc. 6A). Kolonizacja/zakażenie pochwy Candida utrzymuje się przez tygodnie u myszy zaszczepionych estrogenem (Figura 6B), podczas gdy Candida nie ustanawia kolonizacji pochwy u myszy zaszczepionych estrogenem (Figura 6C). Myszy niezaszczepione estrogenem pozostają ujemne dla Candida przez cały czas (dane nie pokazane). Ponadto płukanie pochwy można wykonać jednorazowo na oddzielnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych myszy w znieczuleniu.

Węzły chłonne lędźwiowe są głównymi węzłami chłonnymi drenującymi drogi rodne i najbardziej odpowiednim miejscem do oceny pod kątem ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej na prowokację pochwy. Należy pamiętać, że te węzły chłonne mogą ulec powiększeniu u zaszczepionych myszy, podczas gdy zwykle wydają się dość małe u myszy niezaszczepionych. Odzysk komórek leukocytów zwykle waha się od 8 × 10⁵ / niezaszczepiona mysz do 5 ×10⁶ / zaszczepiona mysz. Oprócz węzłów chłonnych lędźwiowych można również stosować węzły chłonne pachwinowe, podkolanowe i krezkowe.

Rysunek 1. Inokulacja dopochwowa Candida. A) Mysz skrępowana do zaszczepienia. Mysz umieszcza się na drucianej wkładce klatkowej i trzyma za podstawę ogona, lekko do góry, aby podnieść nogi i odsłonić otwór pochwy. Biodro myszy można ustabilizować tą samą ręką, która próbuje oprzeć się ograniczeniu ogona. B) Wprowadzenie inokulum do światła pochwy. Końcówkę pipety delikatnie wprowadza się na głębokość około 5 mm w światło pochwy. Następnie deponuje się inokulum zawiesinowe.

Rysunek 2. Ekstrakcja tkanki pochwy. A-B) Ekstrakcja szyjki macicy. Szyjka macicy jest zlokalizowana za pomocą zakrzywionych kleszczy i odsłonięta na zewnątrz przez jamę pochwy. Po wyjęciu z jamy pochwy szyjka macicy jest dalej wyciągana na zewnątrz, aby całkowicie odsłonić pochwę. C) Ekstrakcja pochwy. Pochwę wycina się ze sromu nożyczkami. Po odłączeniu usuń szyjkę macicy z pochwy.

Rysunek 3. Identyfikacja węzłów chłonnych lędźwiowych. Wskazuje się położenie węzłów chłonnych lędźwiowych wśród otaczających narządów/naczyń krwionośnych w pobliżu miednicy. A, aorta brzuszna. B, pęcherz moczowy. C, tętnica biodrowa wspólna. I, jelita. L, wątroba. R, odbytnica. S, śledziona. U, Uteri.

Rysunek 4. Węzły chłonne lędźwiowe umieszczone na siatce drucianej. Węzły chłonne są gromadzone na ekranie umieszczonym na szalce Petriego z HBSS. Węzły chłonne są dociskane do ekranu za pomocą tłoka strzykawki w celu uzyskania komórek limfatycznych w zawiesinach jednokomórkowych.

Rysunek 5. Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy od zaszczepionych myszy. A) Montaż na mokro i B) preparaty cytologiczne z próbek płukania pochwy pobranych 4 dni po inokulacji oraz C) od nieszczepionych myszy. Obrazy są wyświetlane w powiększeniu 1000× (A) lub 400× (B, C). Wkładka w B pokazuje morfologię jądrową neutrofili pochwy przy 1000× . Wskazywane są drożdżaki Candida (Y) i strzępki (H), komórki nabłonkowe (EC) i neutrohile (N).

Rysunek 6. Wykrywanie obciążenia grzybicą pochwy. A) Reprezentatywne kolonie C. albicans wyhodowane na płytce SDA. Czyste (N) próbki płukania od sześciu różnych inokulowanych myszy (górny rząd) były seryjnie rozcieńczane i hodowane w celu wyliczenia CFU. B) Kwantyfikacja obciążenia grzybicą pochwy u myszy leczonych estrogenem i C) myszy nieleczonych estrogenem. CFU/100 μl płynu z płukania od inokulowanych myszy oceniano we wskazanych punktach czasowych.

Discussion

Eksperymentalny mysi model zapalenia pochwy Candida został opracowany i historycznie używany przez ostatnie kilka dekad do badania odpowiedzi błony śluzowej gospodarza na Candida , a także do testowania terapii przeciwgrzybiczych^{3,4,11,13,16,17,19,21,24,25,37}. Przedstawione tutaj protokoły zawierają skuteczne i mniej pracochłonne metody i wydają się być jednym z najbardziej zoptymalizowanych systemów modelowych zapalenia pochwy Candida opisanych do tej pory. Techniki te umożliwiają s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Samice myszy CBA/J	Charles River Laboratories	01C38	wieku 5-6 tygodni<
em>Candida albicans (3153A)	Krajowa kolekcja grzybów chorobotwórczych, Wielka Brytania	NCPF3153
Olej sezamowy	Sigma-Aldrich	S3547	D– s nie musi być wstępnie sterylizowany przed użyciem
Β-17-walerianian estradiolu	Sigma-Aldrich	E1631	0,1-0,5 mg w oleju sezamowym
Pepton fitonowy	BD Biosciences	211906	Suplement z 0,1% glukozy
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154
Agar z dekstrozą Sabouraud	BD Biosciences	211584
Kolagenaza typ IV	Sigma-Aldrich	C5138	0,25%
Barwnik	Invitrogen	17105-041	1,7 U/ml
Sita siatkowe	TWP	060X060S0065W36T	Nie. 60 oczek, nierdzewny
Hanks' zrównoważony roztwór soli	Invitrogen	24020-117
Utrwalacz CytoPrep	Fisher Scientific	12-570-10	Konserwuje szkiełka rozmazowe
Barwnik Papanicolaou EA-65	EMD Millipore	7054X-85
Bejca do papanicolaou OG-6	EMD Milipore	7052X-85
Harris' Ałun hematoksylina	EMD Millipore	638A-85
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60	Używany z parownikiem izofluranowym lub w zamkniętej komorze anestezjologicznej z systemem kroplowym