Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Podsumowanie

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Streszczenie

Problem pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości z głębokich warstw próbek biologicznych jest powszechnie znany¹. W tkankach wypełnionych powietrzem, takich jak gąbczysty mezofil liści roślin czy płuca kręgowców, dodatkowe trudności wynikają z licznych przejść współczynnika załamania światła między komponentami komórkowymi, między komórkami a przestrzeniami powietrznymi oraz między tkanką biologiczną a resztą układu optycznego. Co więcej, niedopasowanie współczynników załamania prowadzi do tłumienia wzbudzenia fluoroforu i emisji sygnału w mikroskopii fluorescencyjnej. Opisujemy tutaj zastosowanie perfluorowęglowodoru, perfluorodekaliny (PFD), jako infiltracyjnego ośrodka obrazowania, który optycznie poprawia obrazowanie próbek w głębi za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (LSCM), bez konieczności stosowania szkodliwego zwiększania mocy lasera i przy minimalnym wpływie fizjologicznym². Przedstawiamy protokół stosowania PFD w tkance liścia Arabidopsis thaliana, która jest optycznie złożona ze względu na swoją strukturę (Rycina 1). PFD posiada szereg właściwości, które czynią go odpowiednim do tego zastosowania³. Współczynnik załamania światła PFD (1,313) jest porównywalny z współczynnikiem wody (1,333) i jest bliższy współczynnikowi cytozolu (ok. 1,4) niż powietrza (1,000). Dodatkowo PFD jest łatwo dostępny, niefluorescencyjny i nietoksyczny. Niskie napięcie powierzchniowe PFD (19 dynes cm^-1) jest niższe niż w przypadku wody (72 dynes cm^-1) i znajduje się poniżej granicy (25 - 30 dyne cm^-1) dla penetracji przez aparaty szparkowe⁴, co pozwala na wypełnienie przestrzeni powietrznych gąbczystego mezofilu bez stosowania potencjalnie destrukcyjnej próżni lub surfaktantu. Wreszcie, co kluczowe, PFD wykazuje dużą zdolność do rozpuszczania CO₂ i O₂, co pozwala na utrzymanie wymiany gazowej w wypełnionej tkance, minimalizując tym samym wpływ fizjologiczny na próbkę. Właściwości te były wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w częściowym oddychaniu w cieczy i wentylacji płuc^5,6, chirurgii⁷, sztucznej krwi⁸, natlenianiu pożywek hodowlanych⁹ oraz badaniach nad tworzeniem się kryształów lodu w roślinach¹⁰. Obecnie powszechną praktyką przy obrazowaniu konfokalnym tkanek żywych jest ich montowanie w wodzie lub buforze wodnym. Uważamy, że zastosowanie PFD jako medium montażowego stanowi usprawnienie istniejącej praktyki i umożliwia prostą preparację żywych próbek całych liści do obrazowania.

Protokół

Poniższy protokół opisuje prostą metodę wykorzystania PFD jako infiltracyjnego medium montażowego w liściach Arabidopsis thaliana, jednak przewidujemy, że metoda ta może znaleźć zastosowanie w wielu przypadkach, w których pożądane jest obrazowanie tkanek bogatych w powietrze.

1. Montowanie próbek liści w PFD

1. Przygotować szkiełko przedmiotowe z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu utworzenia komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.
2. Wyrównać ciśnienie PFD z powietrzem. Można to osiągnąć poprzez napowietrzanie lub wstrząsanie niewielką objętością PFD w butelce wypełnionej powietrzem.
3. Przełożyć PFD do otwartej szalki Petriego i umieścić całą siewkę lub wycięty liść na powierzchni PFD na 5 minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, przypominając tkankę zwitryfikowaną (Rycina 2 (a)). Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki.
4. Wypełnić komorę z PDMS wyrównanym z powietrzem PFD i ostrożnie przenieść próbki tkanek z inkubacyjnej szalki Petriego do komory z PDMS. Zamknąć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i wykonać obrazowanie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
5. Uwaga: PFD sprawdza się również w otwartej komorze zbudowanej na szkiełku nakrywkowym lub w komorze perfuzyjnej i jest kompatybilny ze smarem silikonowym. PFD nie jest kompatybilny z elementami wykonanymi z teflonu, ponieważ je rozpuszcza.

2. Reprezentatywne wyniki:

Inspekcja mikroskopowa próbek liści inkubowanych w PFD wykazuje, że większość przestrzeni międzykomórkowych jest wypełniona cieczą. Rysunek 2 (b) przedstawia przestrzenie międzykomórkowe wypełnione rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. Jest widoczne, że liść zostaje wypełniony cieczą podczas inkubacji z PFD, choć mogą pozostać sporadyczne pęcherzyki powietrza. Woda nie wypełnia liścia w tych warunkach. LSCM próbek inkubowanych i montowanych w powietrzu, wodzie lub PFD wykazuje, że PFD zapewnia przewagę nad wodą i powietrzem w zakresie możliwej głębokości obrazowania (Rysunek 3). Przykład podany na Rysunku 3 przedstawia liście Arabidopsis montowane w powietrzu, wodzie i PFD, wykazujące ekspresję cytozolowo zlokalizowanego białka Venus, wariantu YFP¹¹, który jest wyrażany konstytutywnie pod promotorem 35S. Możemy zauważyć około 2-krotny wzrost głębokości obrazowania przy porównaniu PFD i wody. Należy jednak zaznaczyć, że dokładna poprawa obserwowana przy użyciu PFD różni się w zależności od apertury numerycznej obiektywu i rodzaju użytej tkanki. Zaobserwowaliśmy cyklozę oraz wydłużanie się włośników korzeniowych u siewek traktowanych PFD, co w obu przypadkach świadczy o zdrowiu roślin. Dodatkowo wykazaliśmy², że Fv/Fm, miernik funkcjonowania fotosyntetycznego roślin¹², pozostaje w dopuszczalnych granicach w ramach ram czasowych stosowanych podczas obrazowania.

Rycina 1. Złożoność liścia rośliny i implikacje optyczne
Przedstawienie schematyczne ukazujące cechy anatomiczne liścia A. thaliana w odniesieniu do układu optycznego. Stosowane skróty: obj. = obiektyw, imm. = medium imersyjne, cov. = szkiełko nakrywkowe, mnt. = medium montażowe, cut. = kutykula, ad. ep. = epidermy adaksjalna, st. = aparat szparkowy, sp. = mezofil gąbczasty, a.s. = przestrzeń powietrzna, pal. = mezofil palisadowy, v.b. = wiązka przewodząca, ad. ep. = epidermy adaksjalna. Ściany komórkowe zaznaczono czarnymi liniami.

Rycina 2. PFD łatwo penetruje liście Arabidopsis
(a) Liście inkubowane w powietrzu, wodzie lub PFD przez 5 minut i obrazowane za pomocą cyfrowej kamery Leica DCF3000FX z mikroskopem Leica MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). Logo JoVE zostało wydrukowane na folii octanowej i oświetlone od dołu za pomocą stołu świetlnego. Czas ekspozycji wynosił 89 ms, a wszystkie obrazy zostały zebrane i przetworzone w identyczny sposób. Paski skali reprezentują 2 mm.

(b) PFD przenoszące oczyszczone rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyznacza przestrzenie powietrzne in vivo. GFP zostało sztucznie pokolorowane na zielono, a kolor czerwony został użyty do pokazania autofluorescencji chlorofilu, która wyznacza komórki mezofilu. (Rycina 2(b) powtórzona za zgodą; pełne szczegóły techniczne dostępne w Littlejohn et al. 2010²). Paski skali reprezentują 25 m.

Rycina 3. PFD poprawia obrazowanie konfokalne w liściach
Obrazy LSCM pokazujące fluorescencję białka Venus zlokalizowaną w cytoplazmie (zielona) oraz autofluorescencję chlorofilu (czerwona) w nienaruszonych liściach A. thaliana obrazowanych w powietrzu, wodzie lub PFD. Długość fali wzbudzenia wynosiła 514 nm, a emisję fluorescencji rejestrowano w zakresie 518 nm 604 nm dla Venus oraz 657 nm 679 nm dla chloroplastów. Każdy panel stanowi pojedynczy przekrój konfokalny pobrany ze stosu Z składającego się z 11 obrazów konfokalnych wykonanych w odstępach 5 μm. Zostały one wyekstrahowane z pełnego stosu Z obejmującego 59 obrazów wykonanych w odstępach 1 μm, które posłużyły do stworzenia filmów uzupełniających. Pomiary głębokości podano w odniesieniu do powierzchni epidermy. Przedstawiono reprezentatywne obrazy, które zostały przetworzone w identyczny sposób. Szczegóły eksperymentalne, takie jak ustawienia mikroskopu, są identyczne z tymi opisanymi w pracy Littlejohn et al., 2010². Paski skali reprezentują 20 μm.

Dyskusja

Jest to prosta i łatwa w użyciu technika pozwalająca na poprawę mikroskopii tkanek wypełnionych powietrzem lub optycznie złożonych. Wykazaliśmy, że technika ta posiada istotne zalety i mamy nadzieję, że zostanie ona wykorzystana do wyjaśnienia kwestii biologicznych związanych z tkankami bogatymi w powietrze. Przykładowo, byłaby ona naturalnym wyborem do badań nad atakiem patogenów w mezofilu roślinnym lub w płucach. Jesteśmy również świadomi ograniczeń tej techniki. Pracujemy nad lepszym dopasowaniem współczynnika załamania światła, zastosowaniem w innych trybach mikroskopii oraz uzupełnianiem medium montażowego na bazie perfluorowęglowodorów podczas długotrwałych eksperymentów. Dostrzegamy jednak również, że jedna z głównych zalet PFC, a mianowicie ich biologiczna obojętność, ma swoją drugą stronę. PFC nie rozpuszczają łatwo cząsteczek biologicznych, co oznacza również, że nie mogą być one łatwo wykorzystane do dostarczania interesujących związków, takich jak hormony, leki i inne małe cząsteczki lub jony.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Perfluorodekalina	F2 Chemicals	N/A	Zamówienie telefoniczne.
Żel obserwacyjny Carolina	Blades Biological	13-2700