Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.
Artykuł metodologiczny
Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Problem pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości z głębokich warstw próbek biologicznych jest powszechnie znany1. W tkankach wypełnionych powietrzem, takich jak gąbczysty mezofil liści roślin czy płuca kręgowców, dodatkowe trudności wynikają z licznych przejść współczynnika załamania światła między komponentami komórkowymi, między komórkami a przestrzeniami powietrznymi oraz między tkanką biologiczną a resztą układu optycznego. Co więcej, niedopasowanie współczynników załamania prowadzi do tłumienia wzbudzenia fluoroforu i emisji sygnału w mikroskopii fluorescencyjnej. Opisujemy tutaj zastosowanie perfluorowęglowodoru, perfluorodekaliny (PFD), jako infiltracyjnego ośrodka obrazowania, który optycznie poprawia obrazowanie próbek w głębi za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (LSCM), bez konieczności stosowania szkodliwego zwiększania mocy lasera i przy minimalnym wpływie fizjologicznym2. Przedstawiamy protokół stosowania PFD w tkance liścia Arabidopsis thaliana, która jest optycznie złożona ze względu na swoją strukturę (Rycina 1). PFD posiada szereg właściwości, które czynią go odpowiednim do tego zastosowania3. Współczynnik załamania światła PFD (1,313) jest porównywalny z współczynnikiem wody (1,333) i jest bliższy współczynnikowi cytozolu (ok. 1,4) niż powietrza (1,000). Dodatkowo PFD jest łatwo dostępny, niefluorescencyjny i nietoksyczny. Niskie napięcie powierzchniowe PFD (19 dynes cm-1) jest niższe niż w przypadku wody (72 dynes cm-1) i znajduje się poniżej granicy (25 - 30 dyne cm-1) dla penetracji przez aparaty szparkowe4, co pozwala na wypełnienie przestrzeni powietrznych gąbczystego mezofilu bez stosowania potencjalnie destrukcyjnej próżni lub surfaktantu. Wreszcie, co kluczowe, PFD wykazuje dużą zdolność do rozpuszczania CO2 i O2, co pozwala na utrzymanie wymiany gazowej w wypełnionej tkance, minimalizując tym samym wpływ fizjologiczny na próbkę. Właściwości te były wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w częściowym oddychaniu w cieczy i wentylacji płuc5,6, chirurgii7, sztucznej krwi8, natlenianiu pożywek hodowlanych9 oraz badaniach nad tworzeniem się kryształów lodu w roślinach10. Obecnie powszechną praktyką przy obrazowaniu konfokalnym tkanek żywych jest ich montowanie w wodzie lub buforze wodnym. Uważamy, że zastosowanie PFD jako medium montażowego stanowi usprawnienie istniejącej praktyki i umożliwia prostą preparację żywych próbek całych liści do obrazowania.
Protokół
Poniższy protokół opisuje prostą metodę wykorzystania PFD jako infiltracyjnego medium montażowego w liściach Arabidopsis thaliana, jednak przewidujemy, że metoda ta może być stosowana w wielu zastosowaniach, w których pożądane jest obrazowanie tkanek bogatych w powietrze.
1. Montowanie próbek liści w PFD
- Przygotuj szkiełko przedmiotowe z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu uzyskania komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.
- Wyrównaj PFD z powietrzem. Można to osiągnąć poprzez przedmuchiwanie powietrzem lub wstrząsanie niewielkiej objętości PFD w wypełnionej powietrzem butelce.
- Przelej PFD do otwartej szalki Petriego i umieść na powierzchni PFD całą siewkę lub wycięty liść na 5 minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, przypominając tkankę zwitryfikowaną (Ryc. 2 (a)). Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki.
- Wypełnij komorę z PDMS wyrównanym z powietrzem PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanek z inkubacyjnej szalki Petriego do komory z PDMS. Zamknij szkiełko nakładką i wykonaj obrazowanie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
- Uwaga: PFD sprawdza się również w otwartej komorze zbudowanej na szkiełku nakrywkowym lub w komorze perfuzyjnej i jest kompatybilny z smarem silikonowym. PFD nie jest kompatybilny z elementami teflonowymi, ponieważ je rozpuszcza.
2. Reprezentatywne wyniki:
Badanie mikroskopowe próbek liści inkubowanych w PFD pokazuje, że większość przestrzeni międzykomórkowych jest wypełniona cieczą. Rysunek 2 (b) przedstawia przestrzenie wypełnione rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. Jest oczywiste, że liść zostaje wypełniony podczas inkubacji w PFD, choć mogą pozostać pojedyncze pęcherzyki powietrza. W tych warunkach woda nie wypełnia wnętrza liścia. LSCM próbek inkubowanych i montowanych w powietrzu, wodzie lub PFD wykazuje, że PFD zapewnia przewagę nad wodą i powietrzem pod względem możliwej głębokości obrazowania (Rysunek 3). Przykład podany na Rysunku 3 przedstawia liście Arabidopsis montowane w powietrzu, wodzie i PFD, wykazujące ekspresję cytozolowo zlokalizowanego białka Venus, wariantu YFP11 wyrażanego konstytutywnie pod promotorem 35S. Można zauważyć około 2-krotny wzrost głębokości obrazowania przy porównaniu PFD i wody. Należy jednak zaznaczyć, że dokładny stopień poprawy przy użyciu PFD różni się w zależności od apertury numerycznej obiektywu oraz rodzaju użytej tkanki. Obserwowano strumieniowanie cytoplazmatyczne oraz wydłużanie się włośników korzeniowych u siewek traktowanych PFD, co w każdym przypadku wskazuje na zdrowe rośliny. Dodatkowo wykazaliśmy2, że Fv/Fm, parametr określający sprawność fotosyntetyczną roślin12, pozostaje w dopuszczalnych granicach w ramach czasowych stosowanych podczas obrazowania.
Rysunek 1. Złożoność liścia rośliny i skutki optyczne
Przedstawienie schematyczne cech anatomicznych liścia A. thaliana w odniesieniu do układu optycznego. Stosowane skróty: obj. = obiektyw, imm. = medium imersyjne, cov. = szkiełko nakrywki, mnt. = medium montażowe, cut. = kutykula, ad. ep. = epidermy adaksjalna, st. = aparat szparkowy, sp. = mezofyl gąbczasty, a.s. = przestrzeń międzykomórkowa, pal. = mezofyl palisadowy, v.b. = wiązka przewodząca, ad. ep. = epidermy adaksjalna. Ściany komórkowe zaznaczono czarnymi liniami.
Rysunek 2. PFD łatwo przenika przez liście Arabidopsis
(a) Liście inkubowane w powietrzu, wodzie lub PFD przez 5 minut, obrazowane za pomocą cyfrowej kamery Leica DCF3000FX z mikroskopem Leica MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). Logo JoVE wydrukowano na folii octanowej i oświetlono od dołu za pomocą stołu świetlnego. Czas ekspozycji wynosił 89 ms, a wszystkie obrazy zostały zebrane i przetworzone w identyczny sposób. Paski skali reprezentują 2 mm.
(b) PFD zawierający oczyszczone rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyznacza przestrzenie międzykomórkowe in vivo. GFP został zaznaczony kolorem zielonym (kolor sztuczny), natomiast kolor czerwony wskazuje autofluorescencję chlorofilu, która wyznacza komórki mezofylu. (Rysunek 2(b) powielony za zgodą; pełne szczegóły techniczne dostępne w pracy Littlejohn et al. 20102). Paski skali reprezentują 25 m.
Rycina 3. PFD poprawia obrazowanie konfokalne w liściach
Obrazy LSCM pokazujące fluorescencję białka Venus zlokalizowaną w cytoplazmie (zielona) oraz autofluorescencję chlorofilu (czerwona) w nienaruszonych liściach A. thaliana obrazowanych w powietrzu, wodzie lub PFD. Długość fali wzbudzenia wynosiła 514 nm, a emisję fluorescencji rejestrowano przy 518 nm 604 nm dla Venus oraz przy 657 nm 679 nm dla chloroplastów. Każdy panel stanowi pojedynczy przekrój konfokalny pobrany ze stosu Z składającego się z 11 obrazów konfokalnych uzyskanych w odstępach 5 μm. Zostały one wyodrębnione z pełnego stosu Z obejmującego 59 obrazów uzyskanych w odstępach 1 μm, które posłużyły do przygotowania filmów uzupełniających. Pomiary głębokości podano w stosunku do powierzchni epidermy. Przedstawiono reprezentatywne obrazy, które zostały przetworzone w identyczny sposób. Szczegóły eksperymentalne, takie jak ustawienia mikroskopu, są identyczne z tymi opisanymi w pracy Littlejohn et al., 20102. Paski skali odpowiadają 20 μm.
Dyskusja
Jest to prosta i łatwa w użyciu technika pozwalająca na poprawę mikroskopii tkanek wypełnionych powietrzem lub optycznie złożonych. Wykazaliśmy, że technika ta posiada istotne zalety i mamy nadzieję, że zostanie ona wykorzystana do wyjaśnienia kwestii biologicznych związanych z tkankami bogatymi w powietrze. Przykładowo, byłaby ona naturalnym wyborem do badań nad atakiem patogenów w mezofilu roślinnym lub w płucach. Jesteśmy również świadomi ograniczeń tej techniki. Pracujemy nad lepszym dopasowaniem współczynnika załamania światła, zastosowaniem w innych trybach mikroskopii oraz uzupełnianiem medium montażowego na bazie perfluorowęglowodorów podczas długotrwałych eksperymentów. Dostrzegamy jednak również, że jedna z głównych zalet PFC, a mianowicie ich biologiczna obojętność, ma swoją drugą stronę. PFC nie rozpuszczają łatwo cząsteczek biologicznych, co oznacza również, że nie mogą być one łatwo wykorzystane do dostarczania interesujących związków, takich jak hormony, leki i inne małe cząsteczki lub jony.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować prof. Nicholasowi Smirnoffowi z University of Exeter za udzielone porady oraz University of Exeter Bioimaging Facility. Finansowanie zostało zapewnione przez brytyjską Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (numer grantu BB/E002682/1).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Perfluorodekalina | F2 Chemicals | N/A | Zamówienie telefoniczne. |
| Żel obserwacyjny Carolina | Blades Biological | 13-2700 |
Bibliografia
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J. Properties of perfluorinated liquids. Fed. Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).
- Schönherr, J., Bukovac, M. J. Penetration of stomata by liquids. Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).
- Davies, M. W. Liquid ventilation. Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
Przedruki i uprawnienia
