Artykuł metodologiczny

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

29.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3396

⸱

6 stycznia 2012

 ,  , 
1Obstetrics, Gynecology and Women’s Health and Division of Biological Sciences, University of Missouri, 2Obstetrics, Gynecology and Women’s Health and Animal Sciences, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Streszczenie

Endometrioza jest przewlekłą, bolesną chorobą, której etiologia pozostaje nieznana. Ponadto leczenie endometriozy może wymagać laparoskopowego usunięcia zmian i/lub przewlekłej farmakologicznej kontroli bólu oraz objawów niepłodności. Koszty związane z endometriozą w Stanach Zjednoczonych szacuje się na 22 miliardy dolarów rocznie1. W celu pogłębienia zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tej zagadkowej choroby wykorzystano modele zwierzęce. U naczelnych endometrioza rozwija się spontanicznie, dlatego modele naczelnych najbliżej odzwierciedlają przebieg choroby u kobiet. Modele gryzoni są jednak bardziej efektywne kosztowo i łatwiej dostępne2. Model opisany w niniejszej pracy polega na autologicznym transferze tkanki macicy do krezki jelitowej (Rysunek 1); został on opracowany po raz pierwszy u szczura3, a następnie przeniesiony na mysz4. Celem autologicznego modelu gryzoni w chirurgicznie indukowanej endometriozie jest naśladowanie choroby występującej u kobiet. My oraz inni badacze wykazaliśmy wcześniej, że zmieniony wzorzec ekspresji genów obserwowany w zmianach endometrioidalnych u myszy lub szczurów odzwierciedla wzorzec obserwowany u kobiet z tą chorobą5,6. Jedną z zalet przeprowadzania operacji u myszy jest fakt, że dostępność licznych szczepów myszy transgenicznych może pomóc badaczom w określeniu roli konkretnych komponentów istotnych dla powstawania i wzrostu endometriozy. Powszechnie stosowany jest również alternatywny model, w którym wycięte fragmenty ludzkiego endometrium wprowadza się do otrzewnej myszy z niedoborem odporności, jednak jest on ograniczony przez brak prawidłowego układu odpornościowego, który uważa się za istotny w endometriozie2,7. Co ważne, mysi model chirurgicznie indukowanej endometriozy jest wszechstronnym modelem, który wykorzystywano do badania wpływu układu odpornościowego8, hormonów9,10 oraz czynników środowiskowych11,12 na endometriozę, a także wpływu endometriozy na płodność13 i ból14.

Protokół

1. Planowanie operacji na żywym zwierzęciu

  1. Upewnij się, że uzyskano odpowiednie zgody na pracę ze zwierzętami laboratoryjnymi.
  2. Zamów myszy i zapewnij im co najmniej jeden tydzień aklimatyzacji w nowym środowisku.
  3. Samice myszy utrzymywane bez ekspozycji na feromony samców mogą przestać przejawiać cykliczność, co jest zjawiskiem nazywanym efektem Whittena15,16. Aby utrzymać cykliczność u myszy, co pięć dni przenoś do klatki z samicami ściółkę nasączoną moczem samców. Alternatywnie, w przypadku stosowania klatek z otwartą górą, umieść klatkę z samicami pomiędzy dwiema klatkami z samcami, aby zapewnić regularną cykliczność u samic.
  4. Potwierdź cykliczność u myszy, analizując codziennie cytologię pochwy przez co najmniej jeden tydzień przed operacją (Tabela 1)17.
    1. Za pomocą woskowego ołówka stwórz na szkiełku przedmiotowym osiem pól, aby móc zebrać wymazy z pochwy wielu myszy.
    2. Przepłucz pochwę 0.2-0.25 mL soli fizjologicznej lub wody destylowanej za pomocą zakraplacza. Należy umieścić zakraplacz dokładnie przy ujściu pochwy, ponieważ stymulacja szyjki macicy zakraplaczem mogłaby wywołać pseudociążę. Umieść płukaninę z pochwy na szkiełku w celu analizy typów komórek. Preparaty można odczytywać na świeżo (na mokro) lub alternatywnie utrwalić różnymi metodami i zbadać przy użyciu standardowego mikroskopu świetlnego17.
  5. Zgromadź, wyczyść i wysterylizuj cały niezbędny sprzęt chirurgiczny, aby zapewnić prawidłowy przebieg aseptycznej operacji (patrz sekcja Materiały)18.
  6. Przygotuj roztwór buprenorfiny do analgezji w PBS, stosując technikę sterylną, aby podać dawkę końcową 0.2 mg/kg. Stężenie roztworu buprenorfiny powinno wynosić 0.0333 mg/ml, przyjmując, że średnia waga dorosłej myszy C57BL/6 wynosi około 0.025 kg, a objętość iniekcji podskórnej to 0.15 ml na mysz. Buprenorfinę można przygotować wcześniej i przechowywać w formie aalikwotów. Należy pamiętać, że buprenorfina jest substancją kontrolowaną z grupy Schedule III, wymagającą licencji DEA i szczegółowego rejestru inwentarzowego.
  7. Przygotuj sterylny PBS z penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 μg/ml).
  8. Zsynchronizuj cykle rujowe, przenosząc ściółkę nasączoną moczem samców do klatek z samicami na 72 godziny przed indukcją15.

2. Przygotowanie pola operacyjnego do zabiegu chirurgicznego na żywym zwierzęciu

  1. Przygotować obszar zabiegowy zgodnie z wcześniejszym opisem18.
  2. Przygotować stanowisko przygotowawcze, rozkładając maszynkę do strzyżenia, maść oftalmiczną oraz środki do mycia chirurgicznego.
  3. Przygotować pole operacyjne, umieszczając na nim cyrkulacyjną podkładkę grzewczą z gorącą wodą w celu utrzymania temperatury ciała podczas całego zabiegu. Na podkładce grzewczej położyć sterylną wodoodporną podkładkę. Na sterylnym polu operacyjnym rozłożyć instrumenty chirurgiczne, nici do szycia, sterylną szklaną szalkę Petriego, wycinak do biopsji, sterylną gazę, klipsy do ran oraz aplikator do klipsów.
  4. Przygotować obszar rekonwalescencji, umieszczając cyrkulacyjne podkładki grzewcze z gorącą wodą pod połową pustej klatki, aby myszy mogły oddalić się od źródła ciepła, jeśli zajdzie taka potrzeba.

3. Znieczulenie i przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego

  1. Zważ mysz i określ fazę cyklu rujowego poprzez ocenę cytologii pochwy.
  2. W celu indukcji znieczulenia umieść mysz w pustej komorze anestezjologicznej (pusta klatka z pełnym wieczkiem zawierającym port do izofluranu). Włącz nierespiracyjny system anestezjologiczny z izofluranem i ustaw parownik na 4% izofluranu (przy przepływie tlenu od 0.5 do 1 L/min).
  3. Gdy mysz zostanie znieczulona, przekieruj przepływ izofluranu do stożka (osłona strzykawki 30-60 ml) i umieść nos oraz pysk myszy w stożku na stole preparacyjnym. Przez resztę zabiegu odpowiednie znieczulenie można utrzymywać przy niższym stężeniu izofluranu (~2.5-3.5% izofluranu). Odpowiednią głębokość znieczulenia należy określić na podstawie braku reakcji na bodziec uciskowy palca u nogi.
  4. Nałóż maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu podczas operacji.
  5. Za pomocą małej elektrycznej maszynki do strzyżenia ogoli miejsce operacyjne.
  6. Zdezynfekuj i przygotuj miejsce operacyjne, wykonując trzy naprzemienne przetarcia preparatem do mycia z chlorheksydyną oraz 70% etanolem.
  7. Zabezpiecz zwierzę sterylnym polem operacyjnym.

4. Podwiązanie macicy

  1. Wykonać niewielkie (~1 cm) nacięcie w linii środkowej za pomocą małych nożyczek lub ostrza skalpela, kończąc je 0,5 - 1,0 cm rostralnie od otworu pochwy.
  2. Wprowadzić zamknięte nożyczki do otworu w taki sposób, aby ostrza znajdowały się pomiędzy ścianą ciała a ścianą brzucha. Ostrożnie przeprowadzić tępą dyssekcję obszaru wokół nacięcia, powoli otwierając i zamykając nożyczki, tak aby ściana brzucha została w wystarczającym stopniu oddzielona od skóry. Pozostałe widoczne zrosty między ścianą brzucha a skórą wokół miejsca nacięcia można ostrożnie wyciąć. Niedostateczna tępą dyssekcja miejsca nacięcia utrudni późniejsze zamknięcie ściany brzucha.
  3. Za pomocą małej pęsety ostrożnie zlokalizować lewy róg macicy. Macica znajduje się grzbietowo względem jelit, które są widoczne jako pierwsze po wejściu w miejsce nacięcia. W niektórych przypadkach najłatwiej jest najpierw zlokalizować jajnik i powiązaną z nim tkankę tłuszczową jajnika. Delikatnie unieść róg macicy i wsunąć pod niego otwartą pęsetę, aby służyła jako retraktor. W razie potrzeby można w tym momencie odnotować wygląd jajników i macicy, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat fazy cyklu rujowego w momencie indukcji (Tabela 1).
  4. Ostrożnie wsunąć dwa odcinki czarnej plecionej nici jedwabnej 5-0 (bez igły) o długości 6-8 cm pod rozciągnięty róg macicy.
  5. Mocno podwiązać róg w miejscu połączenia macicy z jajowodem (tuż caudalnie od jajowodu) oraz w miejscu połączenia macicy z szyjką (tuż rostralnie od szyjki macicy), stosując w obu miejscach węzeł kwadratowy. Pozostawić końce nici na ten moment.
  6. Wyciąć odcinek rogu macicy pomiędzy dwoma podwiązaniami i umieścić tkankę w sterylnej szklanej szalce Petriego zawierającej ~100 μL PBS z penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 μg/ml). Na końcu odciąć końce nici jedwabnej. Jeśli szew się poluzuje lub pojawi się krwawienie, zlokalizować kikut i zawiązać kolejny węzeł.

5. Przygotowanie implantów endometriozowych z wyciętej macicy

  1. Podczas manipulowania wyciętą macicą, należy przykryć brzuch jałową gazą i w razie potrzeby utrzymywać nawilżenie za pomocą jałowego PBS zawierającego penicylinę i streptomycynę.
  2. Należy oczyścić wycięty róg macicy z tkanki tłuszczowej.
  3. W razie potrzeby należy zważyć wycięty róg macicy.
  4. Należy otworzyć róg macicy, wsuwając jedno ostrze małych nożyczek (długość ostrza 14 mm) do światła narządu i delikatnie przesuwając nożyczki wzdłuż rogu macicy, trzymając go jednocześnie pęsetą.
  5. W szklanej płytce Petriego należy użyć wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm, aby wyciąć trzy implanty o tej samej wielkości.

6. Szycie implantów endometriozalnych w jamie otrzewnej

  1. Umieść sterylną gazę bezpośrednio nad miejscem nacięcia i dokładnie zwilż ją sterylnym PBS zawierającym penicylinę i streptomycynę.
  2. Za pomocą małych, gładkich pęsety delikatnie odnajdź kątnicę i przesuń się w kierunku rostralnym wzdłuż jelita cienkiego. Wyciągnij mały (4-5 cm) odcinek jelita, który znajduje się co najmniej dwie tętnice od kątnicy, i rozłóż go w formie wachlarza na wcześniej zwilżonej gazie, tak aby kaskada tętnicza krezki jelitowej była wyraźnie widoczna. Należy dbać o to, aby jelito było przez cały czas wilgotne, używając do tego sterylnej soli fizjologicznej. Uwaga: podczas manipulowania jelitem nie należy używać pęset z ząbkami szczurzymi.
  3. Używając czarnej nici etilonowej 6-0 z igłą P-1, 11 mm, 3/8 okręgu, tnącą w odwróceniu, delikatnie przyszyj jeden implant do tętnicy w odległości około 0.5 cm od jelita.
  4. Uwaga: Krezka jelitowa jest pokryta cienką warstwą otrzewnej. Należy uważać, aby podczas szycia wokół tętnicy wykonać czyste przejście przez tę warstwę. Przeciągaj nić powoli i ostrożnie, aby nie przerwać otrzewnej ani nie uszkodzić tętnicy.
  5. Wykonaj dwa węzły pojedyncze, uważając, aby nie zaciągać nici zbyt mocno, ponieważ może to doprowadzić do utraty przepływu krwi i w konsekwencji do martwicy jelita oraz śmierci zwierzęcia. Przytnij nić w odległości 2 mm od implantu. Ponownie zwilż jelito, aby utrzymać nawodnienie przed przejściem do kolejnego implantu.
  6. Przesuwając się w kierunku rostralnym, wyciągnij kolejne 3-4 cm jelita i delikatnie odsuń odcinek, który zawiera już implant. Pomiń jedną lub dwie tętnice od miejsca poprzedniego implantu i przyszyj kolejny implant. Powtórz czynność dla trzeciego implantu.
  7. Umieść całe jelito z powrotem w jamie brzusznej.

7. Operacje pozorowane

  1. Operacje pozorowane (sham) wykonuje się według tych samych etapów co operacje endometriozy, z wyjątkiem tego, że żadna tkanka nie jest przyszywana do krezki jelitowej.
  2. Wycinamy lewy róg macicy, analogicznie do kroku 4.
  3. W operacji pozorowanej nie przygotowuje się implantów endometriotycznych (krok 5). Wycięty róg macicy można wyrzucić lub wykorzystać do innych celów, jeśli jest to pożądane.
  4. Szwy, ale bez tkanek, umieszcza się wokół trzech tętnic w kaskadzie tętniczej krezki jelitowej, analogicznie do kroku 6.

8. Zamknięcie rany chirurgicznej

  1. Upewnij się, że wszystkie organy wróciły w przybliżeniu do swojego położenia anatomicznego.
  2. Użyj powlekanej nici Vicryl 5-0, wykonując ciągły szew nieblokujący, aby zamknąć ścianę brzuszną.
  3. Użyj 9 mm klipsów do ran, aby zamknąć skórę.

9. Wybudzanie zwierzęcia

  1. Podaj buprenorfinę w stężeniu 0.33 mg/ml w objętości 0.15 ml/25 g myszy poprzez wstrzyknięcie podskórne, aby uzyskać dawkę 0.2 mg/kg. Buprenorfinę podaje się po operacji, aby zapobiec dalszej depresji sercowo-oddechowej, która mogłaby wydłużyć proces rekonwalescencji.
  2. Jeśli mysz zamokła podczas operacji, delikatnie osusz ją za pomocą chusteczek Kimwipes lub ręczników papierowych.
  3. Umieść zwierzę brzuchem do dołu w klatce, częściowo na recyrkulacyjnej podkładce grzewczej z wodą, aż zwierzę dojdzie do siebie i odzyska zdolność do leżenia na mostku (zazwyczaj w ciągu pięciu minut, gdy działanie anestetyku wziewnego szybko ustępuje).

10. Opieka pooperacyjna

  1. Myszy należy obserwować co 15 minut, aż będą w stanie utrzymać pozycję sternalną, a następnie co godzinę, dopóki nie odzyskają normalnego zachowania po operacji.
  2. W ciągu 24 godzin po operacji stan myszy powinien wrócić do normy. Myszy należy monitorować codziennie przez siedem do dziesięciu dni pod kątem oznak powrotu do zdrowia i dobrej kondycji.
    1. Wskaźnikami złego stanu zdrowia, bólu lub stresu zwierzęcia są: zmniejszona aktywność, samookaleczenia, niezadbany wygląd lub zgarbiona postawa.
    2. Jeśli w ciągu 24 godzin po operacji stan zdrowia zwierzęcia nie ulegnie poprawie, należy podać buprenorfinę (0,2 mg/kg) lub poddać zwierzę eutanazji. Jeśli w ciągu 8 godzin od podania dodatkowej dawki buprenorfiny stan zwierzęcia nie ulegnie poprawie, należy je poddać eutanazji, gdyż prawdopodobna jest nekroza jelit.
  3. Klamry chirurgiczne z rany należy usunąć 7–10 dni po indukcji.
  4. Przez cały czas trwania eksperymentu należy kontynuować monitorowanie cykliczności rui poprzez badanie cytologii pochwy. Cykle rui należy zsynchronizować na 72 godziny przed pobraniem próbek, przenosząc ściółkę samców nasączoną moczem do klatek samic, zgodnie z opisem w kroku 1.3.

11. Nekropsja i wycięcie tkanek

  1. Termin przeprowadzenia nekropsji zależy od konkretnego pytania badawczego i jest dalej omówiony w sekcji reprezentatywnych wyników i dyskusji.
  2. Uśmierć mysz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.
  3. Pobierz krew poprzez nakłucie serca, używając igły 23G i strzykawki 1cc (opcjonalnie).
  4. Pobierz rozmaz z cytologii pochwy zgodnie z powyższym opisem, aby określić fazę cyklu rujowego w momencie pobrania17.
  5. Odetnij pozostały róg macicy na poziomie połączenia maciczno-jajowodowego oraz szyjki macicy, usuń tłuszcz, zważ i przetwórz zgodnie z potrzebami (patrz 11.14 i 11.15).
  6. Zlokalizuj czarne szwy wokół zmian endometriozowych. Opcjonalnie wykonaj zdjęcia nienaruszonych zmian endometriozowych.
  7. Ostrożnie wypreparuj zrosty otaczające zmiany endometriozowe za pomocą małych nożyczek i pęsety, uważając, aby nie nakłuć zmian. Pracuj szybko i starannie, aby zapobiec degradacji RNA.
  8. Zmierz i zapisz długość oraz szerokość zmian endometriozowych za pomocą suwmiarki.
  9. Wycięte zmiany endometriozowe umieść na ręczniku papierowym zwilżonym PBS. Usuń z zmian wszelkie tkanki niebędące endometriozą. Do pomocy w preparacji można użyć mikroskopu stereoskopowego lub lupy na statywie.
  10. Zważ trzy wypełnione płynem zmiany endometriozowe przed usunięciem szwu.
  11. Delikatnie usuń szew ze zmian endometriozowych.
  12. Do badania histologicznego jedną wypełnioną płynem zmianę endometriozową utrwal w formalinie przez dwie godziny, a następnie przemyj trzykrotnie w PBS przez 30 minut i przechowuj ostatecznie w 70% etanolu. Odwodnij i zatop w parafinie.
  13. Nakłuj dwie zmiany endometriozowe. Zważ je ponownie. Ponieważ cykliczne zmiany hormonalne mogą wpływać na ilość płynu w torbieli, pozwala to na określenie mokrej masy tkanki oprócz masy torbieli wraz z płynem, zmierzonej w punkcie 11.10.
  14. W celu izolacji RNA i badań ekspresji genów, natychmiast homogenizuj jedną z nakłutych zmian endometriozowych (lub ~20 μg tkanki macicy) w roztworze lizującym i przechowuj w temperaturze -80°C do późniejszej izolacji RNA przy użyciu zestawu RNAqueous (Ambion) lub innej preferowanej metody.
  15. W celu późniejszej izolacji RNA, DNA lub białka, drugą nakłutą zmianę endometriozową (lub ~20 μg tkanki macicy) natychmiast zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80°C.

Reprezentatywne wyniki

Zmiany endometriozalne w mysim modelu endometriozy indukowanej chirurgicznie wykazują podobieństwo morfologiczne i histologiczne do zmian obserwowanych u kobiet. Analiza histologiczna endometriozy zarówno u kobiet, jak i w modelu mysim wskazuje, że zmiany endometriozalne zawierają gruczoły i zrąb błony śluzowej macicy (Ryc. 2A). Zmiany endometriozalne u myszy zawierają również makrofagi obciążone hemosyderyną, które są powszechną cechą charakterystyczną endometriozy u kobiet (Ryc. 2B)19.

Zmiany endometriozalne usunięte od myszy trzy dni po indukcji wykazują cechy stanu zapalnego i krwawienia (Rycina 3A). Po dwóch do czterech tygodniach wzrostu zmiany endometriozalne w modelu mysim mają charakter torbielowaty, są wypełnione płynem i otoczone zrostami otrzewnowymi (Ryciny 3B i 3C). W porównaniu z masą zmian w momencie indukcji, zmiany wypełnione płynem były odpowiednio o 306% i 862% większe w jednym i dwóch miesiącach po indukcji, natomiast zmiany nacięte były odpowiednio o 51% i 172% większe (Ryciny 4A i 4B). W pięciu różnych eksperymentach uzyskano spójne wartości masy zmian endometriozalnych wypełnionych płynem i naciętych w pierwszym miesiącu po indukcji (Rycina 5). W pierwszym miesiącu po indukcji masa zmian endometriozalnych wypełnionych płynem (7,44±3,75 mg) i naciętych (2,92±1,23 mg) była istotnie skorelowana (współczynnik korelacji Pearsona = 0,669, p < 0,001).

Wiek myszy nie miał wpływu na wielkość zmiany u zwierząt w wieku od trzech do dziesięciu miesięcy. Ani masa zmian endometriotycznych wypełnionych płynem, ani masa zmian po nacięciu w pierwszym miesiącu po indukcji nie wykazały istotnej korelacji z wiekiem zwierzęcia (r = -0.136, p = 0.380 oraz r = -0.063, p = 0.698, odpowiednio).

Macica myszy ulega zmianom wielkości, retencji płynów, proliferacji komórek i wyglądu pod wpływem hormonów sterydowych podczas cyklu rujowego. Porównaliśmy masę zmian endometriotycznych z masą pozostałego, nienaruszonego rogu macicy u zwierząt w różnych fazach rui. Nie stwierdzono istotnej korelacji między masą macicy a masą wypełnionych płynem lub nakłutych zmian endometriotycznych miesiąc po indukcji (r = -0,046, p = 0,765 oraz r = 0,232, p = 0,155, odpowiednio).

Wzorzec ekspresji genów obserwowany w zmianach endometrioidalnych u myszy ściśle odzwierciedla wyniki raportowane u kobiet cierpiących na tę chorobę5. W trzecim dniu po indukcji geny regulujące przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, adhezję komórek i angiogenezę wykazują wysoką nadekspresję, a wiele z tych genów pozostaje nadeksprymowanych przez miesiąc wzrostu.

Ryciny i tabele

Schemat równowagi statycznej podczas indukcji endometriozy; implanty rogu macicy, proces pobierania zmian.
Rycina 1. Chirurgiczna indukcja endometriozy poprzez autologiczny transfer tkanki macicy u myszy. Lewy róg macicy zostaje podwiązany, wycięty i rozcięty wzdłużnie w celu odsłonięcia błony śluzowej macicy. Przygotowuje się trzy biopsje o wielkości 2 mm2, z których każdą przyszywa się do tętnicy w kaskadzie tętniczej krezki jelitowej. Po miesiącu od indukcji zmiany endometrioidalne są wypełnione płynem i otoczone zrostami.

Mikroskopowy obraz histologiczny tkanki z barwieniem, porównanie morfologii komórek, analiza patologiczna.
Rycina 2. Przekrój zmiany endometralnej z mysiego modelu endometriozy miesiąc po indukcji, barwiony hematoksyliną i eozyną, wykazujący (A) obecność gruczołów i zrębu endometrium; pasek skali = 50 μm oraz (B) makrofagi obciążone hemosyderyną, z których niektóre wskazano strzałkami; pasek skali = 20 μm.

Disekcja jelit w trzech preparatach; porównanie anatomiczne; skupienie na różnicach w tkankach.
Rysunek 3. Ogniska endometriozy w modelu mysim po eutanazji, albo trzy dni po indukcji (A), albo miesiąc po indukcji (B i C).

Wykresy masy zmian endometriozalnych; wypełnionych płynem (A) i nakłutych (B) w czasie po indukcji.
Rycina 4. Zmiany endometriozalne u myszy z chirurgicznie wywołaną endometriozą zostały wycięte i zważone jeden lub dwa miesiące po indukcji. Dane przedstawiono jako średnia±SEM. Dane poddano transformacji logarytmicznej, a różne litery oznaczają istotność statystyczną w obrębie każdego panelu, wyznaczoną za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie jednostronnego testu najmniejszej istotnej różnicy Fishera (LSD) dla porównań wielokrotnych. (A) Torbielowate, wypełnione płynem zmiany endometriozalne (N = 10, 7 lub 5 odpowiednio dla indukcji, jednego miesiąca lub dwóch miesięcy po indukcji). (B) Nakłute zmiany endometriozalne (N = 10, 8 lub 7 odpowiednio dla indukcji, jednego miesiąca lub dwóch miesięcy po indukcji).

Dane dotyczące masy zmian endometriozowych przedstawione na wykresie słupkowym; wyniki dla zmian wypełnionych płynem w porównaniu do lancowanych w pięciu eksperymentach.
Rycina 5. Mokra masa zmian endometriozowych wypełnionych płynem oraz lancowanych jeden miesiąc po indukcji w pięciu oddzielnych eksperymentach. Dane przedstawiono jako średnia±SEM. Liczba myszy N=10, 6, 8, 7 i 7 dla zmian wypełnionych płynem oraz 0, 7, 10, 8 i 8 dla zmian lancowanych odpowiednio w eksperymentach 1, 2, 3, 4 i 5.

Tabela cytologii pochwy; stadia cyklu rozrodczego; opis pęcherzyków i ciał żółtych; dane laboratoryjne.
Tabela 1. Określanie stadium rui na podstawie cytologii pochwy oraz wyglądu jajników i macicy i indukcji.
Wygląd jajnika i macicy będzie zależny od czasu. Poniższe dane opierają się na uśmierceniu zwierząt około godziny 8:00 rano w każdym dniu cyklu. Ponadto obserwacje są subiektywne, a porównanie jajników i rogów macicy pozwoli na dokładniejszą ocenę niż analiza samych rogów macicy. Obserwacje te mają na celu uzupełnienie informacji uzyskanych z codziennych odczytów cytologii pochwy.

Rozmiary nici chirurgicznych dla myszy i szczurów; podwiązanie macicy, implantacja, zamknięcie ściany brzusznej.
Tabela 2. Porównanie zabiegów chirurgicznych u myszy i szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych parametrów. Po pierwsze, endometrioza jest chorobą zależną od estrogenów, dlatego zabieg ten powinien być przeprowadzany u zwierząt z zachowanymi jajnikami lub alternatywnie u zwierząt po owariektomii z suplementacją estrogenów20. Po drugie, przyszywanie biopsji błony śluzowej endometrium do kaskady tętniczej musi być wykonane z najwyższą starannością. Stwierdziliśmy, że zastosowanie zaledwie dwóch stosunkowo luźn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Szczególne podziękowania kierujemy do Chrisa Kassotisa i Audrey Bailey za krytyczny przegląd niniejszego manuskryptu oraz do dr. Scotta Korte, Josepha Beemana, Alison Curfman, Paula Kimballa, Bridget Neibreggue, Jacoba Redela, Amy Schroder, Maiji Steinberga i Stacey Winkeler za pomoc w optymalizacji tego modelu w naszym laboratorium. Finansowanie zostało zapewnione przez Clinical Biodetectives Training Grant (NIH T90) (KEP), University of Missouri Life Sciences Undergraduate Research Opportunities Program, MU Research Council, granty MU Research Board oraz NIH R21HD056441 (SCN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ołówek woskowyFisher ScientificNC9954135
Krawędź szkiełka przedmiotowegoFisher Scientific12-550-433
Pipeta zakraplaczFisher ScientificS79383
Standardowy mikroskop świetlny do oceny rozmazów cytologicznych z pochwy
Buprenorfina HCL c3 (CARJET) 10X1mlButler Animal Health Supply022891
Sterylny roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS)GIBCO, by Life Technologies14040-117
10 000 U/ml penicyliny, 10 000μg/ml streptomycyny w 0,85% NaClHycloneSV30010
IzofluranAbbott Laboratories05260-05
System anestezjologiczny z izofluranem bez powrotu wydychanego powietrza
Podkładka grzewcza z recyrkulacją gorącej wody
osłona strzykawki 30 mlFisher Scientific14-823-16G
Sterylne rękawiczki bezpudroweFisher Scientific19020558
Maść okulistycznaGłówne produkty farmaceutyczne10033691
Małe maszynki elektryczne do strzyżeniaWahl Clipper Corp.9861-600
Mycie preparatem chlorheksydynowymFisher ScientificNC9863042
70% etanol
Wielowarstwowe pole sterylneWyroby jednorazowe dla szpitali Busse696
Skalpel nr 3Fisher Scientific22-079-657
Ostrza skalpela nr 10Fisher Scientific22-079-681
Małe nożyczki chirurgiczneRoboz Surgical Instruments Co.RS-5850
Małe ząbkowane pęsety półzakrzywioneRoboz Surgical Instruments Co.RS-5135
czarna pleciona nici jedwabna 5-0Ethicon Inc.K870H
Sterylne szalki Petri z borokrzemianowego szkła PyrexCorning70160-101
biopsja trepanacyjna 2 mmMiltex Inc.33-31
Sterylna gazaKendall1806
nici chirurgiczne nylonowe jednoniciowe ethilon 6-0 czarneEthicon Inc.697G
Igły chirurgiczne (opcjonalnie)World Precision Instruments, Inc.500023
nici chirurgiczne Vicryl, plecione, powlekane, niebarwione, rozmiar 5-0Ethicon Inc.J490G
Klamry do ran Autoclip 9 mmBD Biosciences427631
Aplikator do klipsów Autoclip &usuń amp;BD Biosciences427630
igła 23GBD Biosciences305193
strzykawka 1 mlBD Biosciences301025
stojak z lupą 5X (opcjonalnie)Fisher Scientific14-648-23
10% buforowana formalinaFisher ScientificSF100-4
SuwmiarkaRoboz Surgical Instruments Co.RS-6466
Kasety do przetwarzania/zatapianiaFisher Scientific15-197-700A
Gąbczaste podkładki biopsyjneFisher Scientific22-038-222
zestaw do izolacji RNA RNAqueousAmbionAM1912
Azot ciekły
Probówka do mikrocentrifugowania z płaskim dnem i nakrętką typu snap capFisher Scientific02-681-240
Ketamina (opcjonalnie)Sigma-AldrichK4138
Domitor (chlorowodorek medetomidyny) (opcjonalnie)Tocris Bioscience2023
Antisedan (atipamezol) (opcjonalnie)Sigma-AldrichA9611

Bibliografia

  1. Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
  2. Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Hum. Reprod. Update. 12, 641-649 (2006).
  3. Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
  4. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
  5. Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
  6. Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
  7. Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364, 1789-1799 (2004).
  8. Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
  9. Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
  10. Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
  11. Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
  12. Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
  13. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
  14. Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
  15. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
  16. Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
  17. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
  18. Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
  19. Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
  20. Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
  21. Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
  22. Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
  23. Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
  24. Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
  25. Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
  26. Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
  27. Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
  28. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
  29. Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
  30. Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
  31. Dmitrieva, N. Endocannabinoid involvement in endometriosis. Pain. 151, 703-710 (2010).
  32. Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
  33. Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
  34. Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
  35. Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
  36. Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mysi model endometriozyprzeniesienie tkanki macicyoperacja krezki jelitowejimplanty endometrioidalnetechnika szycia chirurgicznegohistologiczna analiza zmianwzorce ekspresji gen wbadanie wp ywu hormonalnegoefekty w obr bie uk adu odporno ciowegoocena b lu i p odno ci

Powiązane artykuły