Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Podsumowanie

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Streszczenie

Glioblastoma multiforme (GBM) to najczęstsze i najbardziej agresywne pierwotne guzy mózgu u dorosłych¹. W ostatnich latach dokonano znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów inwazji nowotworowej, a bezpośrednia inokulacja wewnątrzczaszkowa guza daje możliwość obserwacji procesu inwazji w fizjologicznie odpowiednim środowisku². Jeśli chodzi o ludzkie guzy mózgu, obecnie dostępne modele ortotopowe są tworzone albo poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie zawiesiny komórek, albo poprzez implantację litego fragmentu guza za pomocą skomplikowanej procedury kraniotomii³. W naszej technice pobieramy komórki z hodowli tkankowej, aby stworzyć zawiesinę komórkową służącą do bezpośredniej implantacji do mózgu. Czas trwania operacji wynosi około 30 minut, a ponieważ mysz musi znajdować się w stałej płaszczyźnie chirurgicznej, stosuje się anestetyk do wstrzykiwań. Myszy umieszcza się w aparacie stereotaktycznym firmy Stoetling (rycina 1). Po oczyszczeniu i przygotowaniu pola operacyjnego wykonuje się nacięcie, a następnie lokalizuje punkt bregma, aby wyznaczyć miejsce kraniotomii. Miejsce kraniotomii znajduje się 2 mm na prawo i 1 mm rostralnie od punktu bregma. Głębokość wynosi 3 mm od powierzchni czaszki, a komórki wstrzykuje się w tempie 2 μl co 2 minuty. Skórę zszywa się nicią 5-0 PDS, a mysz pozostawia do wybudzenia na podgrzewaczce. Z naszego doświadczenia wynika, że w zależności od linii komórkowej leczenie może rozpocząć się od 7 do 10 dni po operacji. Podawanie leków zależy od składu leku. W przypadku radioterapii myszy są znieczulane i umieszczane w specjalnie wykonanym uchwycie. Ołów osłania ciało myszy, eksponując jedynie jej mózg. Badanie tumorigenazy oraz ocena nowych terapii GBM wymagają dokładnych i powtarzalnych zwierzęcych modeli guzów mózgu. Dlatego stosujemy ten ortotopowy model mózgu do badania interakcji między mikrośrodowiskiem mózgu a guzem oraz do testowania skuteczności różnych środków terapeutycznych z zastosowaniem radioterapii i bez niej.

Protokół

I. Przygotowanie komórek

1. Komórki hoduje się do osiągnięcia konfluencji w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS; jedna naczynie o powierzchni 225 cm² jest w około 80% konfluentne.³ kolba na każde 5 myszy przeznaczonych do implantacji.
2. Odssać pożywkę z komórek; przemyć 10 ml PBS bez wapnia i magnezu. Odssać PBS z komórek.
3. Poddać komórki trypsynizacji, używając 3 ml trypsyny, odczekać 10–15 min, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą 15 ml pożywki.
4. Przenieś pipetą wszystkie komórki i medium do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawartość dwóch dużych kolb mieści się w jednej probówce stożkowej 50 ml.
5. Wirować komórki przy 1600 obr./min przez 7 min w temperaturze 4 °C. Całkowicie odessać nadsącz. Resuspendować komórki w 10 ml zimnego PBS i wypłukać je, delikatnie pipetując w górę i w dół. Upewnić się, że osad komórkowy został jednorodnie wymieszany z PBS. Zawiesina powinna być mętna.
6. W tym momencie wykonuje się liczenie komórek za pomocą licznika Coulter. Komórki są ponownie wirowane przy 1600 obr./min przez 7 min w temperaturze 4 °C.
7. Po 2^nd odwirować komórki, odessać cały PBS i zawiesić ponownie w 1 ml PBS.
8. Komórki wiruje się w 1 ml PBS przy 3000 obr./min przez 10 min w temperaturze 4 °C. PBS odsysa się, a następnie dodaje PBS w celu dostosowania stężenia końcowego do 1x10⁶ na każde 5 μl dla komórek U87; inne linie komórkowe mogą wymagać innej liczby i stężenia komórek dla optymalnego wzrostu guza.
9. Po uzyskaniu końcowej objętości i stężenia komórki są przechowywane w lodzie w probówce typu Eppendorf.

II. Ksenoprzeszczep

1. Przygotowanie myszy
   1. Myszy zostają poddane znieczuleniu za pomocą wstrzykniętej mieszaniny ketaminy/ksylazyny/soli fizjologicznej. Mieszanina zawiera 120 mg/kg ketaminy, 16 mg/kg Rompunu oraz sól fizjologiczną. Myszy są ważone indywidualnie i otrzymują dawkę 0,1 ml na każde 10 g masy ciała. Środek znieczulający jest podawany drogą IP za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 26G. Osiągnięcie fazy uśpienia, w której nie występuje reakcja na ból, zajmuje około 15 min. Reakcję na ból u myszy można sprawdzić, ściskając opuszki łap.
   2. Po pełnym znieczuleniu myszy do oczu podaje się maść oczną, aby zapobiec ich wysuszeniu.
   3. Mysz zostaje umieszczona na podkładce aparatu stereotaktycznego, a przednie górne siekacze w notchu poprzeczki ustnej. Następnie podkładka jest mocowana w aparacie stereotaktycznym.
   4. Nad nosem myszy umieszcza się osłonę nosową, aby zapobiec ruchom głowy, a pręty uszne delikatnie wprowadza się do kanałów słuchowych myszy. Należy uważać, aby nie mocować zbyt ściśle ani osłony nosowej, ani prętów usznych, ponieważ może dojść do złamania czaszki i/lub utrudnienia oddychania u myszy.
   5. Należy upewnić się, że głowa myszy jest wypoziomowana; pomocne w tym procesie są znaczniki na aparacie stereotaktycznym.
   6. W celu przygotowania myszy na głowie obficie nanosi się naprzemiennie alkohol i jodowid powidonu – łącznie 3 razy alkohol i 3 razy jod. Na koniec głowę przemywa się gazikiem nasączonym 70% alkoholem.
2. Procedura chirurgiczna
   1. Wszystkie instrumenty wykorzystywane w procedurze powinny zostać wysterylizowane w autoklawie lub poprzez moczenie w 70% etanolu przed rozpoczęciem zabiegu.
   2. Na szczycie czaszki, za prawym okiem, wykonuje się nacięcie biegnące ukośnie w stronę lewej tylnej części czaszki. Nacięcie powinno mieć długość od 10 mm do 15 mm.
   3. Używając patyczka higienicznego, należy powoli rozsunąć brzegi nacięcia, aby odsłonić czaszkę, i usunąć błonę znajdującą się między czaszką a skórą. Patyczkiem higienicznym należy osuszać krew i monitorować, czy nie występuje nadmierne krwawienie.
   4. Odsłania się górną część czaszki, aby zlokalizować bregma. Używając końcówki strzykawki Hamiltona, ustawia się ją nad bregma. Prawidłowe miejsce wywiercenia otworu w czaszce znajduje się 2 mm na prawo i 1 mm przednio od bregma (rycina 2). Do zaznaczenia miejsca otworu używa się sterylnego pisaka filcowego dla chirurgów. Należy pamiętać, że otwór znajduje się blisko przedniej linii szwu.
   5. Następnie w zaznaczonej pozycji wywierca się w czaszce mały otwór, używając końcówki igły 22G w uchwycie lub wprowadzonej przez igłę 18G.
   6. Szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 μl napełnia się 5 μl zawiesiny komórek. Strzykawka Hamiltona 10 μl jest wyposażona w przymocowaną tępo zakończoną igłę o rozmiarze od 30G do 33G. Przed nabraniem komórki należy je wymieszać, pipetując je lub używając strzykawki 1 ml z igłą 25G. Po napełnieniu strzykawki Hamiltona należy umieścić ją z powrotem w ramieniu aparatu, aby wyrównać ją z otworem w czaszce.
   7. Tępy koniec igły opuszcza się do powierzchni czaszki; gdy igła znajdzie się na poziomie czaszki, obniża się ją do głębokości 3 mm poniżej powierzchni czaszki.
   8. Po opuszczeniu igła powinna pozostać w tym miejscu przez 2 minuty, aby uniknąć poważnego urazu mózgu spowodowanego samym wprowadzeniem igły. Implantację komórek przeprowadza się z prędkością 1 μl na minutę przez łącznie 6-8 minut, uważając na ewentualny cofanie się cieczy. Po implantacji wszystkich komórek igłę pozostawia się w miejscu przez kolejne 2 minuty, aby umożliwić osadzenie się wszystkich komórek.
   9. Igłę wyjmuje się z mózgu, a otwór oczyszcza patyczkiem higienicznym. Następnie igłę i strzykawkę czyści się 50% acetonem, 100% EtOH oraz PBS, po 3 razy w każdym roztworze i w tej kolejności.
   10. Na tym etapie skórę na czaszce można zaszyć. Używając nici 5-0 PBS, zamyka się nacięcie za pomocą około 3 szwów.
   11. Mysz pozostawia się do wybudzenia na podkładce grzewczej, w razie potrzeby ponownie podając maść oczną. Mysz można przenieść do klatki, gdy zacznie samodzielnie wykazywać ruchy (np. podnoszenie głowy lub poruszanie barkami).

III. Leczenie implantu IC za pomocą promieniowania i leków

1. Naświetlanie
   1. W zależności od linii komórkowej naświetlanie myszy może odbyć się od 5 do 7 dni po implantacji. W naszym oddziale do naświetlania wykorzystuje się aparat do radioterapii ortonapięciowej.
   2. Do wizualizacji guza przed randomizacją można wykorzystać techniki obrazowania, takie jak BLI (obrazowanie bioluminescencyjne), MRI lub CT (ryc. 3A).
   3. Myszy anestezuje się wcześniej stosowanym koktajlem Ketamina/Xylazyna/sól fizjologiczna, a na oczy nakłada się maść okulistyczną.
   4. Myszy umieszcza się w specjalnie wykonanym uchwycie do naświetlania, który ma kształt koła, w którym głowy myszy są skierowane do środka. Ciała myszy są osłonięte przed promieniowaniem ołowiem.
   5. Leki można podawać przed lub po naświetlaniu różnymi drogami podania, tj. SQ, IP oraz IV.

IV. Wyniki

Mysz powinna obudzić się po zabiegu w ciągu 45-60 minut od podania znieczulenia. Jeśli mysz ma trudności z wybudzeniem się po zabiegu, a od jego zakończenia minęło ponad 1½ h, istnieje ryzyko, że zwierzę nie odzyska przytomności, w związku z czym skuteczną alternatywą może być eutanazja. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia lub pęknięcia czaszki w dowolnym momencie trwania procedury zaleca się eutanazję. Jeśli wszystko przebiegło pomyślnie, w zależności od linii komórkowej, guz powinien zacząć się formować w ciągu 2-4 tygodni od wykonania zabiegu. W przypadku stosowania wewnątrzczaszkowych modeli ksenoprzeszczepów skuteczność terapeutyczną mierzy się zazwyczaj jako przeżywalność po implantacji⁵. Jednakże, ponieważ jest to model IC, objawy pojawią się przed śmiercią. Do fizycznych oznak, które mogą wystąpić u myszy, należą: zgarbiona postawa, utrata masy ciała oraz brak aktywności. Objawy neurologiczne mogą obejmować drgawki, przechylenie głowy i utratę równowagi. Rysunek 3B przedstawia barwienie HE guza w momencie śmierci zwierzęcia. Do oceny danych wykorzystuje się wykres Kaplana-Meiera (rysunek 4). Oblicza się liczbę dni przeżycia dla 50% osobników i porównuje ją z grupą kontrolną. Jeśli grupa otrzymująca terapię skojarzoną przeżyła dłużej niż suma ram z pojedynczym promieniowaniem i lekiem, uznaje się, że terapia skojarzona była skuteczna.

Rysunek 1. Sprzęt stereotaktyczny firmy Stoelting.

Rycina 2. Schemat lokalizacji otworu wiertniczego w czaszce myszy.

Rysunek 3A. Obrazowanie BLI po implantacji GBM.

Rycina 3B. Barwienie H&E guza GBM w momencie zgonu.

Rysunek 4. Wyniki implantów IC U87 po podaniu inhibitora PARP 7 dni po operacji.

 

Dyskusja

Złośliwe glejaki, takie jak wielopostaciowy glejak obrastały, stanowią najczęstsze pierwotne guzy mózgu i wiążą się z niekorzystnym rokowaniem⁴. Przeżywalność pacjentów z GBM pozostaje praktycznie niezmieniona w ciągu ostatniej dekady (tj. 9-12 miesięcy po diagnozie), mimo postępów w chirurgii, radioterapii i chemioterapii⁵. Cechy odpowiedniego modelu do badania leczenia glejaków powinny obejmować powtarzalną lokalizację guza i wzrost komórek w formie względnie dyskretnego nowotworu; komórki powinny...