Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

17.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3400

⸱

1 listopada 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Streszczenie

Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), który wywołuje u ludzi gorączkę krwotoczną, zaburzenia neurologiczne lub ślepotę, a u przeżuwaczy wysoką częstotliwość aborcji i wad rozwojowych płodów1, został sklasyfikowany jako czynnik selektywny overlap HHS/USDA oraz patogen grupy ryzyka 3. Należy on do rodzaju Phlebovirus z rodziny Bunyaviridae i jest jednym z najbardziej zjadliwych przedstawicieli tej rodziny. Od 2006 roku opracowano kilka systemów genetyki odwrotnej dla szczepu szczepionkowego RVFV MP-122,3, a także dla szczepów RVFV typu dzikiego 4-6, w tym ZH548 i ZH501. Szczep MP-12 (który jest patogenem grupy ryzyka 2 i nie jest czynnikiem selektywnym) jest silnie atenuowany dzięki kilku mutacjom w segmentach M i L, lecz nadal posiada zjadliwe RNA segmentu S3, które koduje funkcjonalny czynnik wirulencji, NSs. Wariant rMP12-C13type (C13type), posiadający 69% delecję w ramce odczytu ORF białka NSs, jest pozbawiony wszystkich znanych funkcji NSs, podczas gdy replikuje się w komórkach VeroE6 pozbawionych IFN typu I równie efektywnie jak MP-12. NSs indukuje zahamowanie transkrypcji gospodarza, w tym mRNA interferonu (IFN)-beta7,8, oraz promuje degradację kinazy białkowej zależnej od dwuniciowego RNA (PKR) na poziomie potranslacyjnym.9,10 Ekspresja IFN-beta jest regulowana transkrypcyjnie przez czynnik regulacyjny interferonu 3 (IRF-3), NF-kB oraz białko aktywacyjne-1 (AP-1), a wiązanie IFN-beta z receptorem IFN-alfa/beta (IFNAR) stymuluje transkrypcję genów IFN-alfa lub innych genów stymulowanych przez interferon (ISGs)11, co indukuje przeciwwirulentne działania gospodarza; tymczasem supresja transkrypcji gospodarza, w tym genu IFN-beta przez NSs, zapobiega nadekspresji tych ISGs w odpowiedzi na replikację wirusa, mimo że IRF-3, NF-kB i białko aktywacyjne-1 (AP-1) mogą być aktywowane przez RVFV7. . Zatem NSs jest doskonałym celem do dalszej atenuacji MP-12 oraz wzmocnienia wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza poprzez zniesienie funkcji supresji IFN-beta. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół generowania rekombinowanego szczepu MP-12 kodującego zmutowane NSs i przedstawiamy przykład metody przesiewowej służącej do identyfikacji mutantów NSs pozbawionych zdolności do supresji syntezy mRNA IFN-beta. Poza kluczową rolą w odporności wrodzonej, IFN typu I jest ważny dla dojrzewania komórek dendrytycznych i indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej12-14. W związku z tym mutanty NSs indukujące IFN typu I są dodatkowo atenuowane, a jednocześnie skuteczniej stymulują odpowiedzi immunologiczne gospodarza niż MP-12 typu dzikiego, co czyni je idealnymi kandydatami do strategii szczepień.

Protokół

1. Odzyskiwanie rekombinowanego szczepu MP-12 kodującego mutację(e) NSs z plazmidowych DNA2

  1. Wysiej komórki nerki młodego chomika (BHK)/T7-915, które stabilnie wykazują ekspresję polimerazy RNA T7, do naczyń o średnicy 6 cm zawierających Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Cat# 32561037) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicyliny i streptomycyny (penicylina: 100 U/ml, streptomycyna: 100 μg/ml) (Invitrogen, Cat#15140122) oraz 600 μg/ml hygromycyny B (Cellgro, Cat#30-240-CR).
    * Wydajność odzyskiwania wirusa jest wyższa w naczyniach o średnicy 6 cm niż w naczyniach o średnicy 35 mm. Komórki BHK/T7-9 o niskim numerze pasażu zapewniają wyższe wskaźniki odzyskiwania. Alternatywnie można zastosować inne linie komórkowe BHK stabilnie wykazujące ekspresję polimerazy RNA T74,5,16,17.
  2. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, wymień supernatant hodowlany na świeże MEM-alpha zawierające 10% FBS oraz penicylinę i streptomycynę (bez dodatku hygromycyny B).

    * Transfekcję komórek należy przeprowadzić w ciągu 1 godziny od wymiany medium, aby uniknąć utraty ekspresji polimerazy RNA T7.
  3. Do odzyskania RVFV wymagany jest zestaw plazmidów kodujących wirusowe genomowe RNA dla ekspresji pełnowymiarowego RNA wirusa oraz drugi zestaw kodujący wirusowe otwarte ramki odczytu genów dla ekspresji białek wirusowych (Ryciny 1 i 2). Przygotuj w probówce 1,5 ml mieszaninę następujących plazmidów2 (Rycina 2):
    1. pProT7-S(+) z mutacją(mi) w genie NSs (2 mg): plazmid ten koduje anty-wirusowy (dodatni) pełnowymiarowy segment S RVFV MP-12, flankowany przez promotor T7 i sekwencję rybozymu wirusa zapalenia wątroby delta (HDV).
    2. pProT7-M(+) (2 mg): plazmid ten koduje anty-wirusowy (dodatni) pełnowymiarowy segment M RVFV MP-12, flankowany przez promotor T7 i sekwencję rybozymu HDV.
    3. pProT7-L(+) (2 mg): plazmid ten koduje anty-wirusowy (dodatni) pełnowymiarowy segment L RVFV MP-12, flankowany przez promotor T7 i sekwencję rybozymu HDV.
    4. pT7-IRES-vN (2 mg): plazmid ten koduje wirusową otwartą ramkę odczytu (ORF) N RVFV MP-12 poniżej promotora T7 i wewnątrzmiodryboidalnej sekwencji wejścia rybosomów (IRES) wirusa zapalenia mięśnia sercowego i mózgu (EMCV).
    5. pT7-IRES-vL (1 mg): plazmid ten koduje ORF L RVFV MP-12 poniżej promotora T7 i IRES EMCV.
    6. pCAGGS-vG (1 mg): plazmid ten koduje ORF M RVFV MP-12 poniżej promotora kurzej beta-aktyny.
      * Dodatek pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL oraz pCAGGS-vG nie jest niezbędny do odzyskania MP-12, ale zwiększa wydajność procesu ratowania wirusa2. Autorzy odnotowali słabą ekspresję Gn/Gc przy użyciu plazmidu pT7-IRES, prawdopodobnie z powodu braku nieszczelnego skanowania (leaky scanning) sekwencji AUG przez rybosomy. Dlatego skonstruowano plazmid pCAGGS-vG dla ekspresji Gn/Gc zależnej od czapeczki.

  4. Dodaj 30 ml TransIT-LT1 (Mirus, Cat#MIR2300) do 385 ml Opti-MEM (Invitrogen, Cat# 31985070) w probówce 1,5 ml i krótko wymieszaj w wirówce typu vortex.
  5. Po 5 min inkubacji w temperaturze pokojowej powoli dodaj Opti-MEM zawierający liposomy do mieszaniny plazmidów z kroku 1.3, delikatnie wymieszaj pipetując i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  6. Dodawaj mieszaninę liposomów i plazmidów kroplami do medium hodowlanego komórek BHK/T7-9 z kroku 1.2 (Rycina 3).
  7. Inkubuj transfektowane komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 h, a następnie wymień supernatant hodowlany na świeże MEM-alpha zawierające 10% FBS oraz penicylinę i streptomycynę (bez dodatku hygromycyny B).
  8. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez kolejne 4 dni (łącznie 5 dni inkubacji) i zbierz supernaty hodowlane do probówki 15 ml.

    * Zaobserwowany tutaj efekt cytopatyczny (CPE) nie musi oznaczać sukcesu w odzyskiwaniu wirusa, ponieważ transfekcja indukuje śmierć komórek, która wygląda podobnie do CPE wywołanego przez replikację wirusowego RNA lub syntezę białek wirusowych.
  9. Odwiruj supernaty przy 2 200 ×g w temperaturze 4°C przez 5 min.

    * Celem tego kroku jest osadzenie resztek komórkowych z zapasu wirusa. Dla zwiększenia bezpieczeństwa zaleca się stosowanie szczelnych na aerozole koszyczków do wirowania.
  10. Przenieś supernaty do krioprobówek z nakrętką o pojemności 5 ml i przechowuj zapas wirusa z pasażu 0 (P0) w temperaturze -80°C do dalszego wykorzystania.

2. Amplifikacja wirusa P0

  1. Próbki P0 często zawierają zbyt niski miano wirusa do dalszych eksperymentów2. Etap amplifikacji w komórkach VeroE6, które są klonem komórek nerki małpy zielonej afrykańskiej (Vero) pozbawionym genów IFN-alfa/beta18,19, zwiększa miano wirusa do poziomu maksymalnego. Alternatywnie, do tego etapu można wykorzystać inne komórki pozbawione odpowiedzi na IFN typu I, takie jak komórki Hec1B20 lub komórki MEF od myszy z knockoutem IFNAR121. Wysiać komórki VeroE6 na płytki 10-cm w modyfikowanej przez Dulbecco minimalnej podłożu podstawowym (DMEM) (Invitrogen, Cat# 11965092) zawierającym 10% FBS, penicylinę i streptomycynę (penicylina: 100 U/ml, streptomycyna: 100 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 aż do osiągnięcia 80% konfluencji.
    * Rekombinowane szczepy MP-12 kodujące zmutowane białko NSs często nie replikują się wydajnie w komórkach kompetentnych w odpowiedzi na IFN typu I.
  2. Zmieszać 300 µl próbek P0 z 2,7 ml DMEM z 10% FBS oraz penicyliną i streptomycyną. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek VeroE6 z kroku 2.1 i zastąpić ją rozcieńczoną próbką P0. Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 h w inkubatorze z 5% CO2.
  3. Usunąć inokulum i dodać 10 ml DMEM z 10% FBS oraz penicyliną i streptomycyną do każdej płytki.
  4. Inkubować w temperaturze 37°C od 3 do 4 dni, aż pojawi się efekt cytopatyczny (CPE) komórek VeroE6.
    * Rozpad monowarstwy następuje podczas infekcji MP-12, natomiast rekombinowany MP-12 pozbawiony NSs, taki jak rMP12-C13type (C13type) (Rysunek 4), nie niszczy monowarstwy, lecz 2 do 3 dni po infekcji pojawia się liczba martwych, pływających komórek.
  5. Zebrać nadpłyn w 3. lub 4. dobie po infekcji (dpi), zgodnie z opisem w sekcjach 1.9) i 1.10), i oznaczyć próbki jako E6P1.

3. Miareczkowanie rekombinowanego MP-12 za pomocą metody plackowej

  1. Wysiać komórki VeroE6 do płytek 6-dołkowych.
    * Analiza powtórzona dla każdej próbki jest bardziej wiarygodna niż analiza pojedyncza.
  2. Gdy komórki VeroE6 osiągną 80% konfluencji, należy przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne próbek wirusa w medium DMEM z dodatkiem 10% FBS oraz penicyliny i streptomycyny, aż do rozcieńczenia 10-6, w następujący sposób:
    • 10 μl próbki E6P1 + 990 ml DMEM z 10% FBS i penicyliną-streptomycyną (10-2 rozcieńczenie)
    • 100 μl z 10-2 próbkę + 900 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS oraz penicyliny i streptomycyny (10-3 rozcieńczenie)
    • 100 μl z 10-3 próbka + 900 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS oraz penicyliny i streptomycyny (10-4 rozcieńczenie)
    • 100 μl z 10-4 próbka + 900 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS i penicyliny-streptomycyny (rozcieńczenie 10⁻⁵)
  3. Odssać pożywkę z płytki 6-dołkowej z kroku 3.1 i dodać 400 μl każdego rozcieńczenia (z kroku 3.2) do dołków (Rycina 3).
  4. Inkubować w 37°C przez 1 h w inkubatorze z 5% CO22.
  5. Podczas inkubacji przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml do nakładania warstwy agaru w następujący sposób:
    Probówka A (przechowywać w 42°C kąpiel wodna): 7 ml 1,2% agaru szlachetnego (VWR, nr kat. 101170-362) w wodzie
    Probówka B (przechowywać w 37°C kąpiel wodna): 7 ml zmodyfikowanego medium Eagle'a (MEM 2x) (Invitrogen, nr kat. 11935046) zawierającego 10% FBS, penicylinę i streptomycynę (penicylina: 100 U/ml, streptomycyna: 100 μg/ml), oraz 10% pożywki tryptozowo-fosforanowej (MP biomedicals, kat. nr 1682149).
  6. Po 1 h inkubacji należy usunąć inokulum wirusowe i natychmiast dodać do każdej studzienki 2 ml mieszaniny probówki A i probówki B (z kroku 3.5) w stosunku 1:1.
    Należy pamiętać o niezwłocznym dodaniu warstwy ochronnej, ponieważ wysychanie studzienek prowadzi do śmierci niezakażonych komórek.
  7. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 3 dni w inkubatorze z 5% CO22.
  8. Ponownie przygotuj probówkę A i probówkę B zgodnie z opisem w kroku 3.5. Przygotuj również 500 μl 0,33% roztworu neutral red (Sigma Aldrich, nr kat. N2889-100ML) na płytkę, który jest również przechowywany w 37°C łaźnia wodna
  9. Wymieszać probówkę A, probówkę B oraz 500 ml roztworu neutral red (stężenie końcowe 0,011%) i dodać 2 ml mieszaniny do każdego dołka.
    * Ilość dodawanego roztworu czerwieni neutralnej różni się w zależności od partii roztworu, dlatego wymagana jest wstępna optymalizacja. Długotrwałe przechowywanie 0,33% roztworu czerwieni neutralnej prowadzi do wytrącenia osadu. W takich przypadkach osad można całkowicie rozpuścić poprzez inkubację w 55°C przez 10 min, a następnie intensywnie wstrząsano. Zastosowanie wytrąconego roztworu czerwieni neutralnej prowadzi do słabego barwienia komórek, podczas gdy ponownie rozpuszczony roztwór czerwieni neutralnej barwi komórki dobrze.
  10. Inkubować płytkę przez 16 h (lub przez noc) w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO22.
  11. Policz liczbę plak w studniach, w których znajduje się od 10 do 100 plak na studnię. Oblicz liczbę jednostek tworzących plaki (Plaque Forming Units, PFU)/ml. Na przykład, jeśli w studniach zaszczepionych rozcieńczeniem 10-krotnym zaobserwujemy 28 plak-5 rozcieńczenia, 28 (liczba plamek) x (1 ml/0,4 ml) x 105 (rozcieńczenie) = 7,0 x 106 jednostki tworzące placki (pfu)/ml (Rysunki 5).

4. Przesiewowy dobór mutantów NSs pozbawionych funkcji supresji IFN typu I

  1. Wysiać komórki C57/WT MEF (InvivoGen, Cat#mef-c57wt), które kodują gen wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej (SEAP) indukowany przez NF-kB i IRF-3/7 (Rysunek 6), do płytek 12-dołkowych. Komórki hodować w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS, penicyliny-streptomycyny (penicylina: 100 U/ml, streptomycyna: 100 μg/ml), blastycydyny S (3 mg/ml) i zeocyny (100 μg/ml).
  2. Gdy komórki osiągną stan sub-konfluencji (80%), poddać je infekcji pozorowanej lub zainfekować szczepem MP-12 lub rekombinantnym szczepem MP-12 z mutacjami NSs przy wielokrotności zakażenia (moi) wynoszącej 3 lub 0,1 (patrz sekcje 2 i 3; objętość każdego inokulum powinna wynosić 300 μl). Po 1 h od infekcji usunąć inokulum i dodać 1 ml na dołek pożywki DMEM z dodatkiem 10% FBS oraz penicyliny-streptomycyny (penicylina: 100 U/ml, streptomycyna: 100 μg/ml) (w tym momencie nie dodawać blastycydyny ani zeocyny).
  3. Po 14 h od infekcji zebrać nadnadczyniny hodowlane. Dodać 200 μl odczynnika QUANTI-Blue (InvivoGen, Cat # rep-qb1) i 50 μl każdej próbki (w trzech powtórzeniach) do dołków płytki 96-dołkowej. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 h.
    * Zarówno MP-12, jak i rekombinantny MP-12 pozbawiony NSs wyraźnie indukują supresję translacji gospodarza w komórkach kompetentnych dla IFN-alfa/beta, w tym w komórkach 293, komórkach MRC-5 i mysich fibroblastach embrionalnych (MEF), 14 godzin po infekcji przy wysokim moi. Z drugiej strony, mRNA IFN-beta lub mRNA ISG56 akumuluje się obficie od 7 do 8 godzin po infekcji w komórkach kompetentnych dla IFN typu I. Dlatego zdecydowano się na zebranie nadnadczynin 14 godzin po infekcji, aby zaobserwować akumulację SEAP indukowaną przez wrodzone odpowiedzi immunologiczne.
  4. Odczytać wartości OD przy 650 nm za pomocą czytnika płytek (Rysunek 7).
    * Wyniki są zgodne z danymi uzyskanymi za pomocą metody Northern blot z zastosowaniem sondy RNA specyficznej dla mysiego mRNA ISG56, która wykazuje nadekspresję mRNA ISG56 przy braku ekspresji NSs (Rysunek 8).
    * Należy zauważyć, że aktywność SEAP jest określana przez ilość białek, na którą może wpływać aktywność translacji gospodarza. Relatywny poziom SEAP może nie być wysoki w porównaniu do zwiększonego poziomu mRNA, ponieważ SEAP nie może być syntetyzowane nawet w obecności mRNA SEAP, jeśli translacja komórkowa jest stłumiona. Metoda Northern blot jest prostszym testem i dokładniejszym sposobem oceny ilości mRNA indukowanego brakiem funkcji NSs w zainfekowanych komórkach niż test reporterowy SEAP. Niemniej jednak system reporterowy SEAP jest szybszy niż Northern blot, a zatem przydatny do szybkiego przesiewu mutantów NSs potencjalnie pozbawionych funkcji supresji transkrypcji gospodarza.

5. Reprezentatywne wyniki:

System genetyki odwrotnej konsekwentnie generował żywotne rekombinowane wirusy MP-12 z mianrami wyższymi niż 1 x 106 pfu/ml. Wirus typu C13 pozbawiony funkcji NSs tworzył duże, mętne placki, podczas gdy MP-12 tworzył przejrzyste placki o różnych rozmiarach2 (Rysunek 5). W komórkach MEF C57/WT zakażonych pozornie lub zakażonych MP-12 nie odnotowano wzrostu poziomu SEAP w nadsączu hodowlanym w porównaniu z komórkami zakażonymi pozornie, podczas gdy nadsącz hodowlany komórek MEF C57/WT zakażonych typem C13 zawierał zwiększony poziom SEAP 14 godzin po infekcji (hpi) (Rysunek 7). Wyniki te są zgodne z uzyskanymi za pomocą analizy Northern blot z użyciem sondy RNA specyficznej dla mRNA mysiego ISG56 (Rysunek 8).

Schemat struktury genomu RVFV; segmenty z białkami: S, M, L; polimeraza RNA, rozmiary nukleotydów.
Rycina 1.  Struktura genomu RVFV
RVFV posiada tripartite genom RNA o polarności negatywnej lub ambisensownej, składający się z segmentów S, M i L. Segment S koduje geny N i NSs w sposób ambisensowny. mRNA N jest syntetyzowane z wirusowego (negatywnego) segmentu S, podczas gdy mRNA NSs jest syntetyzowane z antywirusowego (pozytywnego) segmentu S. Segment M koduje pojedyncze mRNA M i syntetyzuje białka 78kD, NSm, Gn lub Gc poprzez mechanizm leaky scanning kilku kodonów AUG w regionie 5' mRNA M, a następnie ich kotranslacyjne cięcie22,23. Segment L koduje białko L. Zarówno białko N, jak i L są niezbędne do transkrypcji i replikacji wirusa, natomiast Gn i Gc są białkami otoczki wirusa. Białka NSs i NSm są białkami niestrukturalnymi, które nie są wbudowane w cząsteczki wirusa.

Schemat projektu plazmidowego DNA dla rekombinowanego genomu RVFV i ekspresji białek wirusowych z promotorem T7.
Rycina 2.  . Projekt plazmidowego DNA do odzyskiwania rekombinowanego szczepu RVFV MP-12
cDNA kodujące pełnowymiarowe segmenty S, M lub L w sensie anty-wirusowym są klonowane poniżej promotora T7 i powyżej sekwencji rybozymu wirusa zapalenia wątroby delta (HDV), oznaczonych odpowiednio jako pProT7-S(+), pProT7-M(+) lub pProT7-L(+)2. Polimeraza RNA T7 eksprymowana w komórkach BHK/T7-9 przepisuje RNA kodujące pełnowymiarowe segmenty S, M lub L z precyzyjnym końcem 3’ genomu. Otwarte ramki odczytu (ORF) białek N lub L są klonowane pod wewnętrzną sekwencją IRES (internal ribosome entry site) wirusa zapalenia mięśnia sercowego i mózgu (EMCV), oznaczonymi odpowiednio jako pT7-IRES-vN lub pT7-IRES-vL, aby umożliwić rozpoznanie niekapsylkowanego transkryptu RNA T7 przez rybosomy w sposób niezależny od czapeczki. ORF segmentu M jest klonowany pod promotorem beta-aktyny kurczaka plazmidu pCAGGS24, oznaczonego jako pCAGGS-vG, aby umożliwić syntezę białek 78kD, NSm, Gn i Gc, które powstają z różnych sekwencji AUG w wyniku mechanizmu leaky scanning23. Zarówno białka N, jak i L są wymagane do zainicjowania transkrypcji lub replikacji RNA, podczas gdy pT7-IRES-vN i pT7-IRES-vL nie są niezbędne do odzyskiwania rekombinowanego MP-122, prawdopodobnie ze względu na domniemaną nieszczelną ekspresję transkryptów RNA z czapeczką sterowanych przez Pol-II, kodujących odpowiednio N-ORF i L-ORF z pProT7-S(+) i pProT7-L(+).

Schemat regeneracji RVFV MP-12 z plazmidowego DNA: transfekcja, amplifikacja, proces testu plackowego.
Rysunek 3.  Odzyskiwanie szczepu RVFV MP-12 z plazmidowego DNA
Transfekcja komórek BHK/T7-9 plazmidami pProT7-S(+), pProT7-M(+), pProT7-L(+), pT7-IRES-vN, pT7-IRES-vL oraz pCAGGS-vG (Rys. 1) prowadzi do powstania zakaźnego rekombinowanego szczepu RVFV MP-12 w naskładkach hodowlanych. Naskładkę pobiera się w 5. dniu po transfekcji i przenosi do świeżych komórek Vero E6 w celu amplifikacji wirusa. Typowo uzyskuje się ponad 1 x 106 ilość pfu/ml wirusa można odzyskać od 3 do 4 dni po infekcji. Namnożony wirus (wirus E6P1) jest mianowany przy użyciu metody plackowej z wykorzystaniem komórek Vero E6, a następnie użyty do analizy fenotypowej oraz badań immunogenności.

Schemat genu segmentu S przedstawiający strukturę MP-12 i rMP12-C13type z miejscem mutacji Asp-Val.
Rycina 4.  Segment S szczepów MP-12 i rMP12-C13type
Porównanie segmentów S szczepów MP-12 i rMP12-C13type (C13type). W porównaniu do NSs szczepu MP-12, ORF NSs typu C13type jest skrócony o 69% i jest identyczny z ORF naturalnie izolowanego klonu szczepu 132,25.

Schemat testu plackowego dla szczepów MP-12 i C13type; układ doświadczalny do obliczania miana wirusa.
Rysunek 5.  Test plackowy dla MP-12 (funkcjonalne NSs) i C13type (niefunkcjonalne NSs)
Do testu plackowego wykorzystuje się monowarstwę komórek Vero E6 w płytce 6-dołkowej. Po 3 dniach inkubacji z 0,6% nakładką agaru dodaje się drugą warstwę agaru zawierającą roztwór czerwieni neutralnej. Następnie, w 4. dniu po infekcji, zlicza się placki. MP-12 tworzy przeźroczyste placki o różnych rozmiarach, podczas gdy C13type tworzy duże mętne placki (lub ogniska). Do liczenia należy wybrać dołek zawierający od 10 do 100 placków.

Szlak aktywacji genu reporterowego SEAP; schemat przedstawiający promotory IFN-α/β i wpływ białka NSs wirusa MP-12.
Rysunek 6. Szlak aktywacji genu reporterowego wydzielanej fosfatazy alkalicznej (SEAP) w komórkach MEF C57/WT
Promotor interferonu-beta zawiera sekwencje wiążące dla AP-1, NF-kB i IRF-3. Replikacja RVFV aktywuje AP-1, NF-kB oraz IRF-37,11. Jednakże białko NSs hamuje uwalnianie kompleksu represora z promotora IFN-beta nawet po związaniu tych czynników transkrypcyjnych, tłumiąc tym samym syntezę mRNA IFN-beta26. Ponadto NSs sekwestruje podjednostki p44 TFIIH8 i promuje degradację podjednostek p62 TFIIH27, wywołując tym samym ogólną supresję transkrypcji gospodarza, w tym genu IFN-alpha oraz genów pod promotorem ISRE. Mutanty NSs typu C13 lub inne mutanty pozbawione funkcji supresji IFN-beta indukują syntezę IFN-beta, co z kolei aktywuje promotor IFN-alpha oraz promotor elementu odpowiedzi wrażliwego na interferon (ISRE). IRF-7 jest następnie transkrypcyjnie upregulowany przez stymulację IFN-alpha/beta, a następnie dodatkowo upregulowany przez IFN-alpha przy wsparciu IRF-328,29. W tym teście komórki MEF C57/WT kodują wydzielaną fosfatazę alkaliczną (SEAP) w regionie downstream od sztucznej sekwencji wiążącej NF-kB, IRF-3 i IRF-7. W związku z tym mutanty NSs pozbawione funkcji supresji IFN-beta upregulują SEAP, której sekrecja jest następnie mierzona.

Indukcja SEAP przez C13type w komórkach MEF C57/WT; wykres słupkowy; krotność zmiany w stosunku do próbek kontrolnych (mock) w 14 hpi.
Rysunek 7.  Indukcja SEAP przez C13type
Komórki MEF C57/WT (InvivoGen) poddano pozornej infekcji (mock) lub zainfekowano szczepem MP-12 lub rMP12-C13type (C13type) przy moi wynoszącym 3 (lewy panel) lub 0,01 (prawy panel). Nadnadczyniny hodowlane (50 μl) pobrane w 14 hpi zmieszano z 200 μl podłoża QUANTI-Blue (InvivoGen) na płytce 96-dołkowej, a następnie zmierzono wartości OD przy 650 nm po 1 h inkubacji w 37°C za pomocą czytnika płytek. Przedstawiono względne wzrosty poziomu SEAP w stosunku do komórek poddanych pozornej infekcji. Dane reprezentują średnią +/- odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. Nadnadczynina hodowlana z komórek zainfekowanych C13type wykazuje zwiększony poziom SEAP, co sugeruje brak supresji transkrypcji gospodarza przez białko NSs.

Schemat Northern blotu z sondami RNA znakowanymi DIG, wykazujący mRNA ISG56 w próbkach MP-12 i C13type.
Rysunek 8. Northern blot z sondą RNA znakowaną DIG
Komórki fibroblastów zarodkowych myszy (MEF) typu dzikiego poddano infekcji pozorowanej lub zainfekowano szczepami MP-12 lub rMP12-C13type (C13type) przy moi równym 3. Całkowite RNA wyizolowano po 7 hpi przy użyciu Trizol (Invitrogen), a Northern blot wykonano z zastosowaniem sond RNA znakowanych digoksygeniną, specyficznych dla mysiego endogennego mRNA ISG56 lub mRNA N MP-12/anty-wirusem poczuciu segmentu S2,30. W celu przygotowania sond dla mysiego endogennego mRNA ISG56 lub mRNA N RVFV/anty-wirusem poczuciu segmentu S, fragmenty PCR powielone za pomocą zestawów primerów KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) i HindmISG56 (TAC AAA GCT TAT GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA CCA GG) dla mRNA ISG56 lub KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G) i HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG) dla mRNA N RVFV/anty-wirusem poczuciu segmentu S, poddano trawieniu enzymami KpnI i HindIII, a następnie ligowano do plazmidu pSPT18 (Roche). Następnie zsyntezowano sondy RNA znakowane digoksygeniną przy użyciu DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche, Cat#1 175 025). Poziom 28S rRNA dla każdej próbki przedstawiono jako kontrolę ładowania. Komórki MEF typu dzikiego zainfekowane szczepem C13type indukowali syntezę mRNA ISG56, podczas gdy komórki zainfekowane MP-12 jej nie indukowali, co sugeruje brak supresji transkrypcji gospodarza w komórkach zainfekowanych C13type. Dane te są zgodne z wynikami otrzymanymi w teście SEAP na Rysunku 6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Systemy genetyki odwrotnej dla RVFV zostały opracowane przez kilka grup z wykorzystaniem promotora T72,4,5 lub promotora pol-I mysiego3 lub ludzkiego4. W niniejszej pracy opisujemy protokół generowania rekombinowanych szczepów RVFV MP-12 przy użyciu komórek BHK/T7-915, które stabilnie ekspresują polimerazę RNA T7. Efektywność odzyskiwania wirusa różniła się w zależności od stanu komórek BHK/T7-9, ilości plazmidów, liczby transfektowanych komórek i innych czynników. W celu uzysk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantu nr 5 U54 AI057156-07 przyznanego przez Western Regional Center of Excellence (WRCE), grantu 1 R01 AI08764301-A1 z National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz funduszy wewnętrznych Sealy Center for Vaccine Development na University of Texas Medical Branch.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podłoże Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen32561037
Modyfikowane podłoże minimum essential medium według Dulbecco’ Invitrogen11965092
Modyfikowane podłoże Eagle'a (MEM 2x) Invitrogen11935046
Penicylina-streptomycyna Invitrogen15140122
Higromycyna B Cellgro30-240-CR
Bulion tryptone-fosforanowy MP Biomedicals1682149
Agar Noble VWR international101170-362
TransIT-LT1 Mirus Bio LLCMIR2300
Opti-MEM Invitrogen31985070
Szczelna pokrywka przeciwaerozolowa EppendorfC-2223-25
0.33% roztwór czerwieni neutralnej Sigma-AldrichN2889-100ML
Komórki MEF C57/WTInvitrogenmef-c57wt
Blastycydyna SInvitrogenAnt-bl-1
ZeocynaInvitrogenant-zn-1
QUANTI-BlueInvitrogenrep-qb1
Komórki BHK/T7-915 Uniwersytet Gifu, Japonia
Komórki Vero E6ATCCCRL-1586

Bibliografia

  1. Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
  2. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  3. Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
  4. Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
  5. Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
  6. Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
  7. May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  8. Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
  9. Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
  10. Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
  11. Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
  12. Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
  13. Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
  14. Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
  15. Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
  16. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  17. Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
  18. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
  19. Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
  20. Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
  21. Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
  22. Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
  23. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  24. Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
  25. Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
  26. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  27. Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
  28. Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
  29. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
  30. Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
  31. Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
  32. Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Manipulacja genem NSsmetoda plackowasupresja interferonukom rki Vero E6kom rki BHK T7 9test SEAP
Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.