Pakiet Maze-Suite składa się z trzech głównych aplikacji: programu edycyjnego do konstruowania środowisk labiryntowych (MazeMaker), modułu wizualizacji i renderowania (MazeWalker) oraz narzędzia do analizy i wizualizacji ścieżek (MazeAnalyzer). W poniższych sekcjach opisano sposób użytkowania MazeSuite, a więcej szczegółów znajduje się w trzech filmach uzupełniających, po jednym dla każdego modułu MazeSuite.
1. Projektowanie labiryntów
Aplikacja MazeMaker wchodząca w skład pakietu Maze-Suite umożliwia tworzenie środowisk trójwymiarowych (3D) poprzez proste rysowanie ich na dwuwymiarowym (2D) płótnie z perspektywy z lotu ptaka. Ściany i podłogi można rysować za pomocą kliknięć myszą w celu wskazania współrzędnych, a użytkownicy mogą importować pliki obiektów 3D lub edytować właściwości elementów w labiryncie, takie jak pozycja, orientacja, kolor, tekstura i oświetlenie.
Oprócz innych kryteriów wyjścia, takich jak limit czasu, można przypisać obszary startowe i końcowe labiryntu. Można również wyświetlać oddzielne komunikaty tekstowe informujące uczestnika o każdym z warunków wyjścia. Na etapie projektowania labirynty można testować, korzystając z funkcji „quick run” w programie MazeMaker.
W badaniach obrazowania funkcjonalnego uczestnicy są zazwyczaj proszeni o wykonanie serii zadań z powtarzalnymi próbami. Aby ułatwić przeprowadzanie takich powtarzalnych prób, MazeMaker może tworzyć pliki list labiryntów, które stanowią posortowane listy labiryntów oraz wiadomości tekstowych dla danej sesji eksperymentalnej. Kluczowe jest, aby plik listy labiryntów do eksperymentu został przygotowany i dokładnie przetestowany w ramach pilotażu przed dniem właściwego badania.
Krótki samouczek dotyczący użytkowania i tworzenia środowisk za pomocą MazeMaker znajduje się w „Supplementary video II – MazeMaker”.
2. Konfiguracja fNIR i rozmieszczenie podkładki z czujnikiem fNIR
Przygotowanie zestawu fNIR
- Z tyłu obudowy fNIR znajdują się dwa złącza kablowe. Jedno z gniazd służy do połączenia USB, a drugie do podłączenia przewodu zasilającego.
- Podłącz obudowę urządzenia fNIR za pomocą kabla USB do komputera PC lub laptopa, który będzie wykorzystywany do akwizycji danych.
- Podłącz zasilacz do urządzenia i włącz przełącznik.
- Kabel wstęgowy służy do połączenia panelu czujników z obudową fNIR.
- Panel czujników zawiera źródła światła (diody LED) oraz fotodetektory.
- Diody LED emitują światło podczerwone o długościach fal 730nm i 850nm, które są pochłaniane odpowiednio głównie przez hemoglobinę odtlenowaną i utlenioną, dzięki czemu mogą one przenikać przez tkankę biologiczną.
Umieszczanie podkładki czujnika
- Poproś uczestnika o odsunięcie włosów z czoła przed umieszczeniem czujnika. Umieść pasek czujnika tuż nad brwiami. Dopasuj środek czujnika do pionowej osi symetrii, która przechodzi również przez nos.
- Mocno dociśnij podkładkę czujnika do czoła i użyj klipsa, aby spiąć kable z tyłu głowy. Choć nie jest to absolutnie konieczne, zaleca się użycie opaski na głowę lub frotki tenisowej w celu zabezpieczenia podkładki czujnika.
- Po umieszczeniu podkładki czujnika na czole podłącz dwa końce taśmy sygnałowej do urządzenia fNIR. Taśmy należy podłączyć, dopasowując strony „I” i „II” taśmy do odpowiadających im złączy „I” i „II” w urządzeniu.
Uruchomienie oprogramowania COBI Studio w celu zbierania danych
- Kliknij ikonę Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio13 na pulpicie, aby otworzyć główne okno.
- Program posiada określone ustawienia domyślne dla gromadzenia i wizualizacji danych.
- W razie potrzeby należy sprawdzić i potwierdzić parametry akwizycji danych oraz wyzwalanie (synchronizację markerów) w oknie ustawień urządzenia.
- COBI Studio może automatycznie nazywać wszystkie powiązane pliki danych, jeśli „Tryb eksperymentu” zostanie aktywowany za pomocą kreatora „Nowy eksperyment”.
- W folderze z danymi zostaną utworzone 3 typy plików: (*.nir) dla danych fNIR, (*.mrk) dla danych markerów oraz (*.txt) dla dziennika sesji eksperymentalnej.
3. Przeprowadzenie eksperymentu: Renderowanie labiryntów
Konfiguracja urządzenia i rozpoczęcie akwizycji danych fNIR
- Prąd sterujący diodami LED (LED Drive Current) określa jasność świecenia każdej diody LED. Domyślna wartość prądu sterującego LED wynosi 20mA. Wartość ta może wymagać zmiany w zależności od pigmentacji skóry i innych cech uczestnika. Sugerowany zakres prądu LED mieści się w przedziale od 5mA do 20mA
- Domyślna wartość początkowego wzmocnienia (gain) dla wszystkich kanałów wynosi 20. Sugerowane wartości wzmocnienia to 1, 5, 10, 15, 20.
- Kliknij łącze „Start current device” i sprawdź jakość sygnału. Jeśli surowe wartości intensywności wyświetlane w COBI zbliżają się do 4000 lub są niższe niż 1000, kliknij „Stop Device” i dostosuj prąd sterujący LED oraz wzmocnienie urządzenia (Device Gain), aż do uzyskania odpowiednich wartości. W przypadku słabego sygnału najpierw zwiększ prąd sterujący LED, a dopiero potem wzmocnienie urządzenia. W przypadku nasyconego sygnału najpierw zmniejsz wzmocnienie urządzenia, a dopiero potem prąd sterujący LED. Po uzyskaniu akceptowalnej jakości sygnału przejdź do kroku 4.
- Uruchom Baseline. Operacja ta spowoduje zebranie danych z 10 sekund, które zostaną wykorzystane jako linia bazowa w zmodyfikowanym zestawie równań Beera-Lamberta do obliczenia zmian stężeń hemoglobiny utlenowanej i odtlenionej8.
- Poczekaj na zakończenie pomiaru Baseline (może to potrwać 10-20 sekund)
- Kliknij „Start recording”. Rozpocznie to zapisywanie wszystkich danych. Po tej czynności należy rozpocząć protokół eksperymentu.
- Eksperymentator może zdecydować się na dodawanie manualnych markerów w trakcie sesji eksperymentalnej w celu oznaczenia określonych zdarzeń, naciskając przyciski „add manual marker” w menu markerów manualnych znajdującym się w lewym dolnym rogu ekranu.
- Uruchom Maze Suite, aby zaprezentować bodźce wizualne.
Wykorzystanie MazeWalkera do renderowania labiryntów
- Uruchom program MazeWalker z menu Start>Maze Suite>MazeWalker
- Włącz synchronizację markerów, wybierając opcję „Enable Serial Port” w menu Advanced>Serial Port Options. Upewnij się, że wybrany został prawidłowy adres portu COM.
- Wybierz plik z listą labiryntów (utworzony w programie MazeMaker), a następnie określ nazwę nowego pliku dziennika dla bieżącej sesji. W polu „walker” można zapisać imię lub numer uczestnika. Opcjonalnie można skorzystać z funkcji autolog, aby automatycznie zapisywać dane do pliku dziennika z aktualną datą i godziną, zamiast ręcznie określać nazwę pliku.
- Kliknij „Start”, aby rozpocząć proces. W zależności od ustawień wideo, protokół może być uruchomiony w trybie pełnoekranowym lub w oknie.
4. Wizualizacja ścieżki obiektu
Dzięki programowi MazeAnalyzer badacz może zwizualizować labirynt oraz ścieżkę uczestnika na podstawie plików labiryntu i plików dziennika. Dodatkowo generowany jest raport podsumowujący, zawierający całkowitą długość ścieżki oraz czas ukończenia każdego labiryntu, które służą jako wstępne miary behawioralne. Pliki dziennika zawierają informacje z rozdzielczością czasową w milisekundach na temat ścieżki, którą przebył badany, a także wektora widzenia badanego i jego interakcji z obiektami.
Film instruktażowy znajduje się w „Supplementary video I – MazeAnalyzer” i opisuje sposób korzystania z podstawowych funkcji programu MazeAnalyzer wraz z metodami generowania wskaźników behawioralnych opisanych w sekcji wyników.
5. Przetwarzanie i analiza danych fNIR
Usuwanie szumów jest pierwszym krokiem przetwarzania danych. Źródłami szumów są: 1) ruchy głowy, 2) sygnały fizjologiczne, takie jak tętno i oddychanie, oraz 3) szumy związane z aparaturą i środowiskiem.
Ruchy głowy mogą powodować przemieszczenie detektorów fNIR i utratę kontaktu ze skórą, co naraża je na: 1) światło otoczenia; 2) światło emitowane bezpośrednio przez źródła fNIR; lub 3) światło odbite od skóry, zamiast od tkanek kory mózgowej. Ten rodzaj artefaktu ruchowego jest łatwo rozpoznawalny, ponieważ powoduje nagłe, duże skoki w danych fNIR. Bardziej subtelny artefakt ruchu głowy wynika z wpływu grawitacji na krew mózgową. Szybki ruch głowy może spowodować przemieszczenie krwi w stronę (lub z dala od) monitorowanego obszaru, co prowadzi do szybkiego wzrostu (lub spadku) objętości krwi z towarzyszącym temu zniekształceniem danych. Ponieważ dynamika tego typu artefaktu ruchowego jest wolniejsza niż w przypadku „odskoku” (pop) diod LED, mogą one być mylone z rzeczywistą odpowiedzią hemodynamiczną wynikającą z aktywacji mózgu. W związku z tym usunięcie artefaktów ruchowych z danych fNIR jest ważnym i niezbędnym krokiem, jeśli fNIR ma być wykorzystywane jako technologia monitorowania mózgu w środowiskach naturalnych16.
Sygnały fizjologiczne, takie jak tętno (powyżej 0.5 Hz) i oddychanie (powyżej 0.2 Hz), znajdują się w wyższych zakresach częstotliwości niż odpowiedzi hemodynamiczne, w związku z czym można je usunąć za pomocą liniowego filtru FIR dolnoprzepustowego o częstotliwości odcięcia od 0.1 do 0.15 Hz9.
Szum aparatury i środowiskowy może wynikać z oświetlenia otoczenia, takiego jak światło dzienne (DC) i światło pokojowe (60Hz) lub światło z monitora komputera (60-75Hz). Sugeruje się, że najlepszym sposobem na wyeliminowanie tego rodzaju szumu jest odpowiednie przygotowanie środowiska eksperymentalnego oraz procesu akwizycji danych. W urządzeniu fNIR zaimplementowano analogowy filtr dolnoprzepustowy (filtr antyaliasingowy), aby zapobiec nakładaniu się szumów o wysokiej częstotliwości na zakres częstotliwości próbkowania.
Dostępnych jest wiele zaawansowanych algorytmów redukcji szumów, które wykorzystują różne charakterystyki sygnału17-20. Jednakże, jeśli dane są nieodzyskiwalne (np. nasycone), badany lub sesja mogą zostać wykluczone.

Rycina 1. Składniki sygnału fNIR
Surowe sygnały fNIR to pomiary intensywności światła (patrz Rysunek 1). Poprzez pomiar zmian gęstości optycznej (OD) przy dwóch długościach fal, można uzyskać względną zmianę poziomu oxy-Hb i deoxy-Hb w czasie, korzystając z zmodyfikowanego prawa Beera–Lamberta21-23. OD przy określonej długości fali wejściowej (λ) jest logarytmicznym stosunkiem intensywności światła wejściowego (Iin) do intensywności światła wyjściowego (wykrytego) (Iout). OD jest również powiązana z koncentracją (c) i współczynnikiem ekstynkcji (e) chromoforów, skorygowaną odległością (d) między źródłem światła a detektorem oraz stałym współczynnikiem tłumienia (G).

Mając tę samą wartość Iin w dwóch różnych momentach czasowych oraz wykrytą intensywność światła podczas linii bazowej (Irest) i podczas wykonywania zadania (Itest), różnica w OD dla długości fali λ wynosi

Pomiar OD przy dwóch różnych długościach fal pozwala otrzymać

Ten zestaw równań można rozwiązać dla stężeń, jeśli macierz 2x2 jest nieosobliwa. Zazwyczaj dwie długości fal wybiera się i) w zakresie 700-900nm, gdzie absorpcja oxy-Hb i deoxy-Hb dominuje nad innymi chromoforami tkankowymi, oraz ii) poniżej i powyżej punktu izosbestycznego (~805nm, gdzie widma absorpcyjne deoxy-Hb i oxy-Hb przecinają się), aby skupić zmiany absorpcji odpowiednio na deoxy-Hb lub oxy-Hb. Instrument fNIR zastosowany w niniejszym badaniu wykorzystuje długości fal 730nm i 850nm.
Na koniec, wykorzystując markery (sygnały synchronizacji czasu), oznacza się okresy bazowe/odpoczynku oraz zadania, a następnie z danych o utlenowaniu ekstrahuje się wybrane cechy, takie jak wartości średnie, minimalne i maksymalne. Oprogramowanie COBI Studio zapisuje zarówno surowe pomiary natężenia światła, jak i obliczone wartości utlenowania (zgodnie z zmodyfikowanym prawem Beera-Lamberta) w plikach tekstowych, a także pliki synchronizacji czasu (markery). COBI Studio może być również wykorzystane do zastosowania metod usuwania szumów, takich jak filtry dolnoprzepustowe lub pasmowe o skończonej odpowiedzi impulsowej. Pliki wyjściowe można eksportować do powszechnie stosowanego oprogramowania analitycznego (takiego jak Matlab, Excel, SPM i SPSS) lub dedykowanego oprogramowania do analizy, takiego jak fnirSoft24, w celu dalszego przetwarzania.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady sygnałów fNIR
Rysunki 2-5 przedstawiają surowe sygnały fNIR z jednego miejsca pomiaru z dwiema składowymi długości fali (730nm i 850nm) pokazanymi oddzielnie. Rysunek 2 przedstawia prawidłową i akceptowalną epokę sygnału, natomiast rysunki 3 i 4 są nieakceptowalne i muszą zostać odrzucone. Rysunek 5 przedstawia surowy sygnał zanieczyszczony artefaktami ruchowymi, który wymaga oczyszczenia lub odrzucenia.

Rysunek 2. Przykładowy prawidłowy surowy sygnał fNIR

Rysunek 3. Przykładowy błędny surowy sygnał fNIR, w którym kanał 850nm jest nasycony.

Rysunek 4. Przykład błędnego surowego sygnału fNIR, w którym występuje problem sprzętowy lub problem z łącznością kablową.

Rycina 5. Przykładowy nieprawidłowy surowy sygnał fNIR z widocznymi artefaktami ruchowymi.
Protokół badania
Oceny procesu uczenia się najlepiej obrazują testy retencji (tj. pamięci) oraz transferu (tj. zdolności do generalizacji). W naszym badaniu podczas fazy nabywania umiejętności ćwiczono trzy labirynty (maze1, maze2 i maze3), wykonując łącznie po 105 prób dla każdego z nich w ciągu trzech dni. Dwa warunki: losną kolejność ćwiczeń (RND) oraz blokową kolejność ćwiczeń (BLK) przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 6. W czterodniowym badaniu uczestniczyły dwie osoby. W 4tym dniu przeprowadzono 10 prób retencyjnych dla każdego labiryntu, a labirynty prezentowano w losowej kolejności. Stworzono dwa nowe labirynty (maze4 i maze5), które posiadały dodatkowe korytarze oraz inne punkty startowe i końcowe niż labirynty ćwiczone pierwotnie. Uczestnicy wykonali po dziesięć prób dla każdego z dwóch nowych labiryntów. Labirynty te stanowiły fazę transferu i były prezentowane wszystkim w losowej kolejności. Labirynty w fazie transferu posłużyły do określenia stopnia, w jakim każdy uczestnik był w stanie zgeneralizować zdobytą wiedzę i umiejętności nabyte podczas ćwiczeń z labiryntami w fazie nabywania.

Rysunek 6. Reprezentatywny schemat protokołu eksperymentalnego.
Analiza wyników behawioralnych
Poniższe rysunki od 7 do 9 przedstawiają średnie wartości cech (długość ścieżki, całkowity czas ukończenia oraz prędkość) badanych w każdym dniu. Najpierw przedstawiono wyniki dla labiryntu maze1, maze2 i maze3 zarówno dla praktyki RND, jak i BLK. Następnie wymieniono wyniki dla labiryntu maze4 i maze5, aby porównać wyniki praktyki losowej (random) i blokowej (blocked). Wszystkie słupki błędu przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM).

Rycina 7. Podsumowanie wyników behawioralnych w treningu RND dla zadań nabywania i utrwalania umiejętności, obejmujące całkowitą długość ścieżki, całkowity czas wykonania oraz średnią prędkość.

Rysunek 8. Podsumowanie wyników behawioralnych treningu BLK dla zadań nabywania i retencji, obejmujące całkowitą długość ścieżki, całkowity czas wykonania oraz średnią prędkość.

Rycina 9. Porównanie wyników behawioralnych dla praktyki BLK i RND w zadaniach transferowych, obejmujące całkowitą długość ścieżki, całkowity czas wykonania oraz średnią prędkość.
Analiza wyników fNIR
Zmiany stężenia hemoglobiny utlenowanej względem wartości bazowej zostały uśrednione w czasie przejścia każdego labiryntu z osobna, z wykorzystaniem danych znacznikowych otrzymanych z systemu MazeWalker (wskazujących początek i koniec każdego labiryntu). Przyjęto, że większa amplituda zmian stężenia reprezentuje wyższy poziom regionalnej aktywacji mózgu. Wyższy poziom aktywacji zaobserwowano zarówno podczas zadań retencyjnych, jak i transferowych w przypadku praktyki typu BLK w porównaniu do praktyki typu RND. Podczas zadań transferowych odnotowano wyższy poziom aktywacji przy praktyce BLK w porównaniu z praktyką RND (patrz Rysunek 10).
W przypadku badanego z grupy praktyki BLK próby transferu wymagały wyższej aktywacji w porównaniu do prób retencji. W przypadku badanego z grupy praktyki RND poziom aktywacji NIE różnił się dla zadań transferu i retencji, w przeciwieństwie do badanego z grupy praktyki BLK (patrz Rycina 11).

Rysunek 10. Porównanie średnich zmian stężenia oxy-Hb dla praktyki BLK w stosunku do RND w przypadku zadań retencyjnych (po lewej) oraz zadań transferowych (po prawej).

Rysunek 11. Porównanie średnich zmian stężenia oxy-Hb dla zadań zapamiętywania i transferu zarówno dla praktyki BLK (lewo), jak i RND (prawo).