Artykuł metodologiczny

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

DOI:

10.3791/3444

⸱

21 maja 2012

 , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Montreal, 3Department of Medicine, University of Montreal

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie immunologii, aby zrozumieć przebieg odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę, infekcję lub nowotwór, często monitoruje się tę odpowiedź w czasie. Podobnie, badanie homeostazy limfocytów wymaga eksperymentów w serii czasowej. Przeprowadzanie takich badań na tej samej myszy jest idealnym rozwiązaniem, pozwalającym ograniczyć zmienność eksperymentalną oraz liczbę wykorzystanych zwierząt. Pobieranie krwi umożliwia realizację eksperymentów w serii czasowej, lecz dostarcza informacji jedynie o limfocytach krążących i zapewnia ograniczoną liczbę komórek1-4. Ponieważ limfocyty krążące w organizmie oraz rezydujące w węzłach chłonnych posiadają różne właściwości, istotne jest zbadanie obu tych lokalizacji. Sekwencyjne usuwanie węzłów chłonnych drogą chirurgiczną stwarza wyjątkową okazję do śledzenia odpowiedzi immunologicznej lub ekspansji komórek odpornościowych u tej samej myszy w czasie. Co więcej, technika ta pozwala uzyskać od 1-2x106 komórek z jednego węzła chłonnego, co jest wystarczające do przeprowadzenia charakterystyki fenotypowej i/lub testów funkcjonalnych. Sekwencyjna chirurgia węzłów chłonnych lub limfadenektomia była z powodzeniem stosowana przez nas oraz innych badaczy5-11. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób można usunąć węzły chłonne ramienne i pachwinowe, wykonując niewielkie nacięcie skóry znieczulonej myszy. Ponieważ zabieg jest powierzchowny i przeprowadzany szybko, mysz bardzo szybko wraca do zdrowia, dobrze się goi i nie odczuwa nadmiernego bólu. Co drugi dzień możliwe jest pobranie jednego lub dwóch węzłów chłonnych, co pozwala na prowadzenie eksperymentów w serii czasowej. Technika ta jest zatem odpowiednia do badania charakterystyki limfocytów rezydujących w węzłach chłonnych w czasie. Podejście to nadaje się do różnych schematów eksperymentalnych i wierzymy, że wiele laboratoriów odniesie korzyść z przeprowadzania sekwencyjnych zabiegów chirurgicznych węzłów chłonnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie przed operacją

Myszy traktowano zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council on Animal Care).

  1. Znieczuli myszy poprzez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (150/300 mg/kg, i.p.) lub poprzez inhalację izofluranu (2%, 1L tlenu). Jeśli jest dostępny, należy stosować izofluran, ponieważ pozwala on na lepszą kontrolę czasu i głębokości znieczulenia. Ponadto w tym samym czasie podawany jest tlen, co wspomaga funkcje fizjologiczne zwierzęcia. Co więcej, izofluran jest bezpośrednio eliminowany przez płuca, w związku z czym nie wymaga metabolizmu wątrobowego ani nerkowego.
  2. Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg, s.c.) lub inny lek przeciwbólowy.
  3. Przed operacją nałożyć maść na oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu (w przypadku zastosowania izofluranu).
  4. Zweryfikować, czy mysz śpi, poprzez uciśnięcie łapy i obrócenie ogona. Jeśli mysz nie reaguje, można przystąpić do operacji.

2. Operacja

Za pomocą operacji możliwe jest usunięcie 4 powierzchownych węzłów chłonnych (LN): 2 pachwinowych oraz 2 ramiennych. Izolacja LN jest łatwiejsza u młodych, szczupłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ obecność tkanki tłuszczowej u starszych zwierząt może utrudniać ten proces. Ograniczenie to można jednak przezwyciężyć dzięki wprawie. Dla zapewnienia komfortu myszy pobieramy maksymalnie 2 LN naraz, a w przypadku eksperymentów z przebiegiem czasowym pobieramy LN co drugi dzień. Ponadto, aby zapobiec infekcjom, myszom można podawać antybiotyki, jednak w naszej procedurze z nich rezygnujemy, a rany goją się prawidłowo. Należy mieć na uwadze, że w zależności od projektu eksperymentalnego zastosowanie antybiotyku może wpłynąć na obserwowane wyniki (na przykład w przypadku pomiaru odpowiedzi na bakterie). Należy pamiętać, że wszystkie narzędzia są sterylizowane po każdym użyciu, a podczas procedur utrzymywane są warunki aseptyczne.

  1. Ułożyć mysz na boku.
  2. Zlokalizować obszar, w którym wykonane zostanie nacięcie, w zależności od rodzaju węzła chłonnego (LN), który ma zostać pobrany (Rysunek 1).
  3. Nanieść chlorheksydynę lub inny środek dezynfekujący na ten obszar.
  4. Wykonać niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami (około 5 mm) albo na tylnej części przedniej kończyny, albo nad tylną łapą w pobliżu brzucha (Rysunek 1).
  5. Usunąć pęsetą odcięte, luźne włosy. Jeśli preferujesz, można ogolić mysz przed wykonaniem nacięcia. Wydłuża to jednak procedurę, a nasze doświadczenia wskazują, że nie jest to konieczne, ponieważ, jak pokazano tutaj, nie poprawia to gojenia ani nie zmniejsza ryzyka infekcji, które w obu przypadkach zdarzają się bardzo rzadko.
  6. Rozszerzyć nacięcie za pomocą dwóch pęset, aby odsłonić LN. Nacięcie może osiągnąć 10 mm. LN ma kolor szary lub ciemniejszy niż otaczająca go tkanka tłuszczowa.
  7. Chwycić pęsetą powięź (cienką błonę pokrywającą tłuszcz i tkankę) nad LN i delikatnie pociągnąć, nie uszkadzając otaczających tkanek.
  8. Umieścić drugą pęsetę jak najgłębiej pod LN. Pierwszą pęsetą przerwać powięź i wyjąć LN. Jeśli pobranie LN przebiegło pomyślnie, w miejscu, gdzie wcześniej znajdował się węzeł, powinna pojawić się plamka krwi. Należy zauważyć, że LN tonie w roztworze izotonicznym. Ten prosty test pozwala potwierdzić, że wyekstrahowano LN, a nie tkankę tłuszczową.
  9. Upewnić się, że w ranie nie pozostały żadne włosy.
  10. Zamknąć nacięcie, złączając dwie części skóry (wnętrzem skóry) i spinając je klipsem. Używamy klipsów typu Michel wraz z pęsetą aplikacyjną. Założyć jeden lub dwa klipsy, w zależności od wielkości nacięcia. Najczęściej klipsy odpadają samoistnie podczas gojenia się tkanki.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Umieść na dnie klatki niewielką ilość mokrej karmy, aby myszy mogły łatwo się żywić po zabiegu.
  2. Około 6 do 8 godzin po operacji sprawdź stan myszy, aby upewnić się, że nie odczuwają one bólu. Uważnie obserwuj ich zachowanie (postawę ciała, chód, interakcje z osobnikami tego samego gatunku oraz wygląd futra). Jeśli ogólna kondycja myszy jest zła, podaj drugą dawkę buprenorfiny. Do następnego dnia myszy powinny odzyskać normalne zachowanie; w przeciwnym razie należy kontynuować podawanie buprenorfiny. Myszy nigdy nie powinny osiągnąć punktów końcowych wcześniej określonych i zatwierdzonych przez komisję ds. opieki nad zwierzętami (Animal Care Council). W razie potrzeby można zwrócić się o poradę i pomoc do technika weterynaryjnego w wiryarium.

4. Obróbka węzłów chłonnych

  1. W laboratorium, w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, zdysocjuj węzeł chłonny (LN) zgodnie ze standardową procedurą. W naszej praktyce dociskamy LN do matowych szkiełek przedmiotowych, uzyskując rutynowo 1-2 x 106 komórek z jednego LN. Alternatywnie, przygotowujemy LN do ekstrakcji RNA.
  2. Przebarw komórki zgodnie ze standardowym protokołem. Powinieneś otrzymać oczekiwane profile cytometrii przepływowej dla LN.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład wykresu rozrzutu dla rozproszenia przedniego i bocznego przedstawiono dla węzłów chłonnych (LNs) pobranych chirurgicznie od znieczulonej myszy lub od myszy uśpionej (Rysunek 2). Profil oraz odsetki komórek w bramce żywych limfocytów są takie same, co dowodzi, że zabieg chirurgicznego usuwania LNs jest odpowiednią techniką pobierania komórek.

figure-protocol-1
Rycina 1. Lokalizacja węzłów chłonnych (LN) pachwinowych i ramiennych u myszy. A. Węzeł chłonny pachwinowy znajduje się tuż nad tylną łapą, lekko w stronę brzucha. B. Węzeł chłonny ramienny znajduje się za przednią nogą.

figure-protocol-2
Rycina 2. Profil cytometrii przepływowej limfocytów uzyskanych po zabiegu chirurgicznym węzłów chłonnych (LN). Przedstawiono profile rozproszenia światła w przód (FSC) i pod kątem (SSC) dla LN pobranych chirurgicznie od znieczulonej myszy (A) lub od myszy uśmierconej (B). LN zostały pobrane, rozdzielone i przeanalizowane za pomocą cytometru przepływowego. Przedstawiono procenty komórek w bramce żywych limfocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy protokół operacyjnego usuwania węzłów chłonnych (LN), który może mieć zastosowanie w wielu systemach eksperymentalnych. Mimo że technika ta jest bardzo użyteczna do śledzenia odpowiedzi immunologicznych lub homeostazy komórek odpornościowych, posiada ona kilka ograniczeń. Po pierwsze, można pobrać tylko cztery LN. Po drugie, badana odpowiedź immunologiczna musi mieć charakter systemowy lub występować w powierzchownych LN pachwinowych lub ramiennych (odprowadzających chłonkę ze skóry). Wreszcie, liczba pobranyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sylvie Lesage oraz wszystkim członkom laboratorium za krytyczną analizę protokołu. Praca ta była finansowana z grantu (MOP-77545) przyznanego przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque korzysta ze wsparcia stypendium FRSQ Senior Scholarship, a Mélissa Mathieu otrzymała stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pinceta precyzyjna Graefe PremiumHarvard Apparatus52-2144Silnie zakrzywiona, 10 cm (4 in), końcówka 0.8 mm
Pinceta do zakładania i zdejmowania klipsów MichelaHarvard Apparatus52-377912.5 cm (5 in)
Klips Michela 100Harvard Apparatus52-37467.5-1.75 mm
Temgesic (chlorowodorek buprenorfiny)Merck & Co.
Vetalar (chlorowodorek ketaminy)Bioniche Animal HealthDIN: 01989529
Rompun (ksylazyna)Bayer AGDIN: 02169592
IzofluranAbbott LaboratoriesDIN: 02032384
Maść do oczu HypotearsNovartis AGDIN: 02133288
Baxedin (glukonian chlorheksydyny 2% w alkoholu izopropylowym 70%)Omega Engineering, Inc.L0000017DIN: 02251477

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
  2. Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
  3. Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
  4. Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
  5. Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
  6. Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
  7. Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
  8. Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740(2010).
  9. Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
  10. Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
  11. Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
  12. Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
  13. Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mysi w ze ch onnyramienny w ze ch onnypachwinowy w ze ch onnyusuwanie w z w ch onnychsekwencyjne w z y ch onnepobieranie w z w ch onnychzawiesina pojedynczych kom rekanaliza cytometrycznaroztw r izotoniczny

Powiązane artykuły