Method Article

Chirurgia powierzchownych węzłów chłonnych myszy

DOI:

10.3791/3444

⸱

May 21st, 2012

 , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Montreal, 3Department of Medicine, University of Montreal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby śledzić postęp odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne mogą być sekwencyjnie usuwane chirurgicznie. Tutaj opisujemy, jak można wykonać tę technikę.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie immunologii, aby zrozumieć postęp odpowiedzi immunologicznej przeciwko szczepionce, infekcji lub nowotworowi, odpowiedź jest często śledzona w czasie. Podobnie badanie homeostazy limfocytów wymaga eksperymentów w czasie. Przeprowadzenie tych badań na tej samej myszy jest idealne do zmniejszenia zmienności eksperymentalnej, a także liczby wykorzystanych myszy. Pobranie krwi pozwala na przeprowadzenie eksperymentów w czasie, ale dostarcza tylko informacji o krążących limfocytach i dostarcza ograniczoną liczbę komórek1-4. Ponieważ limfocyty krążące w organizmie i znajdujące się w węzłach chłonnych mają różne właściwości, ważne jest, aby zbadać obie lokalizacje. Sekwencyjne usuwanie węzłów chłonnych za pomocą operacji daje wyjątkową możliwość śledzenia odpowiedzi immunologicznej lub ekspansji komórek odpornościowych u tej samej myszy w czasie. Ponadto technika ta daje od 1 do 2 x 106 komórek na węzeł chłonny, co jest wystarczające do przeprowadzenia charakterystyki fenotypowej i / lub testów funkcjonalnych. Sekwencyjna operacja węzłów chłonnych lub limfadenektomia jest z powodzeniem stosowana przez nas i innych5-11. Tutaj opisujemy, w jaki sposób można usunąć węzły chłonne ramienne i pachwinowe, wykonując małe nacięcie w skórze znieczulonej myszy. Ponieważ operacja jest powierzchowna i wykonywana szybko, mysz bardzo szybko wraca do zdrowia, dobrze się goi i nie odczuwa nadmiernego bólu. Co drugi dzień możliwe jest pobranie jednego lub dwóch węzłów chłonnych, co pozwala na eksperymenty z biegiem czasu. Technika ta jest zatem odpowiednia do badania charakterystyki limfocytów znajdujących się w węzłach chłonnych w czasie. Takie podejście jest odpowiednie dla różnych projektów eksperymentalnych i uważamy, że wiele laboratoriów skorzystałoby na wykonywaniu sekwencyjnych operacji węzłów chłonnych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie przed operacją

Myszy były leczone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

  1. Znieczulenie myszy przez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (150/300 mg/kg, i.p.) lub przez inhalację izofluranu (2%, 1L tlenu). Jeśli to możliwe, należy stosować izofluran, ponieważ pozwala on na lepszą kontrolę czasu i głębokości znieczulenia. W tym samym czasie podawany jest również tlen, który wspomaga funkcje fizjologiczne zwierzęcia. Ponadto izofluran jest bezpośrednio eliminowany przez płuca, a zatem nie wymaga metabolizmu wątrobowego ani nerkowego.
  2. Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg mc., s.c.) lub inny lek przeciwbólowy.
  3. Nałóż maść na oczy myszy przed zabiegiem, aby uniknąć suchości oczu (jeśli stosuje się izofluran).
  4. Sprawdź, czy mysz śpi, szczypiąc ją w łapę i zwijając ogonem. Jeśli mysz nie reaguje, przystąp do operacji.

2. Operacja

Możliwe jest chirurgiczne usunięcie 4 powierzchownych węzłów chłonnych (LN): 2 pachwinowych i 2 ramiennych. Izolacja LN jest łatwiejsza u młodych szczupłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ obecność tkanki tłuszczowej u starszych myszy może zakłócać izolację LN. Ograniczenie to można jednak przezwyciężyć dzięki wielokrotnej praktyce. Dla komfortu myszy zbieramy maksymalnie 2 LN na raz, a kiedy przeprowadzamy eksperymenty z biegiem czasu, zbieramy LN co drugi dzień. Ponadto, aby zapobiec infekcji, mysz może podawać antybiotyki, ale my tego nie robimy, a rany goją się dobrze. Należy mieć świadomość, że w zależności od projektu eksperymentalnego, stosowanie antybiotyku może mieć wpływ na obserwowany wynik (na przykład, jeśli mierzy się odpowiedź na bakterię). Należy pamiętać, że wszystkie narzędzia są sterylizowane po każdym użyciu, a podczas zabiegów utrzymywane są warunki aseptyki.

  1. Połóż mysz na boku.
  2. Zlokalizuj region, w którym wykonasz nacięcie, w zależności od LN, który chcesz zebrać. (Rysunek 1).
  3. Nałóż chlorheksydynę lub inny środek dezynfekujący na ten obszar.
  4. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami (około 5 mm) z tyłu przedniej nogi lub nad tylną łapą w pobliżu brzucha (ryc. 1).
  5. Usuń luźne włosy, które obcięłeś kleszczami. Jeśli wolisz, możesz ogolić mysz przed wykonaniem nacięcia. Wydłuża to jednak procedurę i okazuje się, że nie jest to konieczne, ponieważ, jak pokazano tutaj, nie poprawia gojenia ani nie zmniejsza infekcji, które są bardzo rzadkie.
  6. Rozciągnij nacięcie za pomocą 2 kleszczy, aby zobaczyć LN. Nacięcie może sięgać 10 mm. LN wydaje się szarawy lub ciemniejszy niż otaczający tłuszcz.
  7. Ściśnij powięź (cienką błonę pokrywającą tłuszcz i tkankę) na wierzchu LN jednym kleszkiem i lekko pociągnij, nie przerywając otaczającej tkanki.
  8. Umieść drugie kleszcze jak najdalej pod LN. Za pomocą pierwszych kleszczy przerwij powięź i usuń LN. Jeśli udało Ci się zebrać LN, w miejscu, w którym wcześniej znajdował się LN, powinna pojawić się plama krwi. Należy pamiętać, że LN tonie w roztworze izotonicznym. Ten prosty test pozwala zweryfikować, czy wyekstrahowano LN, a nie tkankę tłuszczową.
  9. Sprawdź, czy w ranie nie ma włosów.
  10. Zamknij nacięcie, sklejając ze sobą 2 części skóry (wnętrze skóry) i zszywając je klipsem. Używamy klipsa Michel Clip z kleszczami do nakładania. Zamontuj jeden lub 2 klipsy w zależności od wielkości nacięcia. Najczęściej klipsy odpadają, gdy tkanka się goi.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Dodaj trochę mokrej karmy na dno klatki, aby myszy mogły łatwo się odżywiać po operacji.
  2. Około 6 do 8 godzin po zabiegu sprawdź myszy, aby upewnić się, że nie odczuwają bólu. Uważnie obserwuj ich zachowanie (postawę, chód, interakcję z kongenerem i wygląd futra). Jeśli ogólny wygląd myszy jest zły, należy podać drugą dawkę buprenorfiny. Następnego dnia myszy powinny powrócić do normalnego zachowania, w przeciwnym razie kontynuować podawanie buprenorfiny. Myszy nigdy nie powinny osiągnąć punktów końcowych wcześniej określonych i zaakceptowanych przez Radę ds. Opieki nad Zwierzętami. Możesz zasięgnąć porady i pomocy u technika wiwarium zajmującego się opieką nad zwierzętami.

4. Obsługa węzłów chłonnych

  1. W laboratorium, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, należy zdysocjować LN zgodnie ze zwykłą procedurą. Dociskamy LN do matowych szkiełek i rutynowo uzyskujemy 1-2 x 106 komórek na LN. Alternatywnie przygotowujemy LN do ekstrakcji RNA.
  2. Barwić komórki zgodnie ze zwykłym protokołem. Należy uzyskać oczekiwane profile cytometrii przepływowej LN.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład wykresu punktowego do przodu i z boku jest pokazany dla LN pobranych od znieczulonej myszy chirurgicznie lub od myszy ofiarowanej (Rysunek 2). Profil i procentowa liczba komórek w żywej bramie limfocytów są takie same, co pokazuje, że chirurgia LN jest odpowiednią techniką pobierania komórek.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Lokalizacja LN pachwinowa i ramienna u myszy. A. LN pachwinowy znajduje się tuż nad tylną łapą, nieco w kierunku brzucha. B. LN ramienny znajduje się za przednią nogą.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Profil cytometrii przepływowej limfocytów uzyskany po operacji LN. Profile rozproszenia przedniego i bocznego są pokazane dla LN pobranych od znieczulonej myszy chirurgicznie (A) lub od myszy ofiarowanej (B). LN zebrano, zdysocjowano i przeanalizowano na cytometrze przepływowym. Pokazano procentową zawartość komórek w żywej bramie limfocytów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy protokół chirurgii LN, który może mieć zastosowanie w wielu systemach eksperymentalnych. Chociaż jest bardzo przydatna do śledzenia odpowiedzi immunologicznych lub homeostazy komórek odpornościowych, technika ta ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, można zebrać tylko cztery LN. Po drugie, badana odpowiedź immunologiczna musi być ogólnoustrojowa lub występować w powierzchownych pachwinach lub ramiennych (drenujących skórę) LN. Wreszcie, na liczbę pobranych komórek ma wpływ jakość usuwania LN, co jest ograniczeniem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sylvie Lesage i wszystkim członkom laboratorium za krytyczne zapoznanie się z protokołem. Prace te były wspierane przez grant (MOP-77545) z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR). Nathalie Labrecque jest wspierana przez stypendium dla seniorów FRSQ, a Mélissa Mathieu otrzymała stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kleszcze Graefe Fine Pattern Premium Aparat Harvard52-2144Mocno zakrzywiony, 10 cm (4 cale), końcówka 0,8 mm
Michel Clip Kleszcze do nakładania i zdejmowaniaAparat Harvard52-377912,5 cm (5 cali)
Aparat HarvardMichel Clip 10052-37467,5-1,75 mm
Temgesic (chlorowodorek buprenorfiny)Merck & Co.
Vetalar (chlorowodorek ketaminy)Bioniche Animal HealthDIN: 01989529
Rompun (Xylazine)Bayer AGDIN: 02169592
IsofluraneAbbott LaboratoriesDIN: 02032384
Maść do oczu HypotearsNovartis AGDIN: 02133288
Baxedin (glukonian klorheksydyny 2% w alkoholu izopropylowym 70%)Inżynieria Omega, Inc.L0000017DIN: 02251477

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
  2. Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
  3. Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
  4. Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
  5. Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
  6. Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
  7. Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
  8. Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740(2010).
  9. Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
  10. Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
  11. Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
  12. Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
  13. Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node SurgeryMurine Lymph NodeBrachial Lymph NodeInguinal Lymph NodeLymph Node RemovalSequential Lymph NodeLymph Node HarvestingSingle Cell SuspensionFlow Cytometry AnalysisIsotonic Solution

Related Articles