Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W dziedzinie immunologii, aby zrozumieć przebieg odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę, infekcję lub nowotwór, często monitoruje się tę odpowiedź w czasie. Podobnie, badanie homeostazy limfocytów wymaga eksperymentów w serii czasowej. Przeprowadzanie takich badań na tej samej myszy jest idealnym rozwiązaniem, pozwalającym ograniczyć zmienność eksperymentalną oraz liczbę wykorzystanych zwierząt. Pobieranie krwi umożliwia realizację eksperymentów w serii czasowej, lecz dostarcza informacji jedynie o limfocytach krążących i zapewnia ograniczoną liczbę komórek1-4. Ponieważ limfocyty krążące w organizmie oraz rezydujące w węzłach chłonnych posiadają różne właściwości, istotne jest zbadanie obu tych lokalizacji. Sekwencyjne usuwanie węzłów chłonnych drogą chirurgiczną stwarza wyjątkową okazję do śledzenia odpowiedzi immunologicznej lub ekspansji komórek odpornościowych u tej samej myszy w czasie. Co więcej, technika ta pozwala uzyskać od 1-2x106 komórek z jednego węzła chłonnego, co jest wystarczające do przeprowadzenia charakterystyki fenotypowej i/lub testów funkcjonalnych. Sekwencyjna chirurgia węzłów chłonnych lub limfadenektomia była z powodzeniem stosowana przez nas oraz innych badaczy5-11. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób można usunąć węzły chłonne ramienne i pachwinowe, wykonując niewielkie nacięcie skóry znieczulonej myszy. Ponieważ zabieg jest powierzchowny i przeprowadzany szybko, mysz bardzo szybko wraca do zdrowia, dobrze się goi i nie odczuwa nadmiernego bólu. Co drugi dzień możliwe jest pobranie jednego lub dwóch węzłów chłonnych, co pozwala na prowadzenie eksperymentów w serii czasowej. Technika ta jest zatem odpowiednia do badania charakterystyki limfocytów rezydujących w węzłach chłonnych w czasie. Podejście to nadaje się do różnych schematów eksperymentalnych i wierzymy, że wiele laboratoriów odniesie korzyść z przeprowadzania sekwencyjnych zabiegów chirurgicznych węzłów chłonnych.
Protokół
1. Przygotowanie przed operacją
Myszy były traktowane zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care.
- Zanurz myszy w narkozie poprzez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (150/300 mg/kg, i.p.) lub poprzez inhalację izofluranu (2%, 1L tlenu). Jeśli jest dostępny, należy stosować izofluran, ponieważ pozwala on na lepszą kontrolę czasu i głębokości znieczulenia. Jednocześnie podawany jest tlen, który wspiera funkcje fizjologiczne zwierzęcia. Co więcej, izofluran jest bezpośrednio usuwany przez płuca, w związku z czym nie wymaga metabolizmu wątrobowego ani nerkowego.
- Wstrzyknij buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg, s.c.) lub inny lek przeciwbólowy.
- Przed operacją nałóż maść na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu (w przypadku stosowania izofluranu).
- Sprawdź, czy mysz śpi, uciskając jej łapę i obracając ogonem. Jeśli mysz nie reaguje, przystąp do zabiegu chirurgicznego.
2. Operacja
Za pomocą zabiegu chirurgicznego możliwe jest usunięcie 4 powierzchownych węzłów chłonnych (LN): 2 pachwinowych oraz 2 ramiennych. Izolacja LN jest łatwiejsza u młodych, szczupłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ obecność tkanki tłuszczowej u starszych myszy może utrudniać izolację LN. Ograniczenie to można jednak pokonać dzięki regularnej praktyce. Dla komfortu myszy pobieramy maksymalnie 2 LN jednocześnie, a w przypadku eksperymentów z analizą przebiegu czasowego, pobieramy LN co drugi dzień. Ponadto, aby zapobiec infekcji, myszy można podawać antybiotyki, jednak my tego nie robimy, a rany goją się prawidłowo. Należy mieć na uwadze, że w zależności od projektu eksperymentalnego zastosowanie antybiotyku może wpłynąć na zaobserwowany wynik (na przykład w przypadku pomiaru odpowiedzi na bakterię). Należy pamiętać, że wszystkie narzędzia są sterylizowane po każdym użyciu, a podczas wszystkich procedur zachowane są warunki aseptyczne.
- Połóż mysz na boku.
- Zlokalizuj obszar, w którym wykonasz nacięcie, w zależności od węzła chłonnego (LN), który chcesz pobrać (Rysunek 1).
- Nanieś chlorheksydynę lub inny środek dezynfekujący na ten obszar.
- Wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami (około 5 mm) albo na tylnej części przedniej kończyny, albo nad tylną łapą w pobliżu brzucha (Rysunek 1).
- Za pomocą pęsety usuń luźne, odcięte włosy. Jeśli wolisz, możesz ogolić mysz przed wykonaniem nacięcia. Wydłuża to jednak procedurę, a naszym zdaniem nie jest to konieczne, ponieważ, jak pokazano tutaj, nie poprawia to gojenia ani nie zmniejsza ryzyka infekcji, które w obu przypadkach zdarzają się bardzo rzadko.
- Rozszerz nacięcie za pomocą dwóch pęset, aby zobaczyć LN. Nacięcie może osiągnąć 10 mm. LN ma kolor szary lub jest ciemniejszy niż otaczająca go tkanka tłuszczowa.
- Chwyć pęsetą powięź (cienką błonę pokrywającą tłuszcz i tkankę) nad LN i lekko pociągnij, nie uszkadzając otaczającej tkanki.
- Umieść drugą pęsetę jak najgłębiej pod LN. Pierwszą pęsetą przerwij powięź i usuń LN. Jeśli udało się pobrać LN, w miejscu, w którym wcześniej się znajdował, powinna pojawić się plamka krwi. Należy zauważyć, że LN tonie w roztworze izotonicznym. Ten prosty test pozwala potwierdzić, że wyizolowano LN, a nie tkankę tłuszczową.
- Upewnij się, że w ranie nie pozostały żadne włosy.
- Zamknij nacięcie, złączając obie części skóry (od wewnątrz) i spinając je klipsem. Używamy klipsów Michel Clip wraz z pęsetą aplikacyjną. Załóż jeden lub dwa klipsy, w zależności od wielkości nacięcia. Najczęściej klipsy odpadają samoistnie w miarę gojenia się tkanki.
3. Opieka pooperacyjna
- Na dnie klatki należy umieścić mokrą karmę, aby myszy mogły łatwo się żywić po operacji.
- Około 6 do 8 godzin po zabiegu należy sprawdzić stan myszy, aby upewnić się, że nie odczuwają one bólu. Należy uważnie obserwować ich zachowanie (postawę, chód, interakcje z osobnikami tego samego gatunku oraz wygląd futra). Jeśli ogólny stan myszy jest zły, należy podać drugą dawkę buprenorfiny. Do następnego dnia myszy powinny odzyskać normalne zachowanie; w przeciwnym razie należy kontynuować podawanie buprenorfiny. Myszy nie mogą osiągnąć punktów końcowych wcześniej określonych i zaakceptowanych przez właściwą Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (Animal Care Council). W razie potrzeby można zwrócić się o poradę i pomoc do technika laboratorium zwierzęcego.
4. Postępowanie z węzłami chłonnymi
- W laboratorium, w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, przeprowadź dysocjację LN zgodnie ze swoją standardową procedurą. My dociskamy LN do matowych szkiełek i rutynowo uzyskujemy 1-2 x 106 komórek z jednego LN. Alternatywnie przygotowujemy LN do ekstrakcji RNA.
- Przeprowadź barwienie komórek zgodnie ze swoim standardowym protokołem. Powinny zostać uzyskane oczekiwane profile cytometrii przepływowej LN.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład wykresu rozproszenia przedniego i bocznego pokazano dla węzłów chłonnych (LN) pobranych od znieczulonej myszy drogą chirurgiczną lub od myszy uśmierconej (Rycina 2). Profil oraz odsetki komórek w bramce dla żywych limfocytów są takie same, co dowodzi, że chirurgiczne pobieranie LN jest odpowiednią techniką pozyskiwania komórek.
Rycina 1. Lokalizacja węzłów chłonnych (LN) pachwinowych i ramiennych u myszy. A. Węzeł chłonny pachwinowy znajduje się tuż nad tylną łapą, lekko w stronę brzucha. B. Węzeł chłonny ramienny znajduje się za przednią nogą.
Rysunek 2. Profil cytometrii przepływowej limfocytów uzyskanych po operacji węzłów chłonnych (LN). Przedstawiono profile rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC) dla LN pobranych chirurgicznie od znieczulonej myszy (A) lub od uśmierconej myszy (B). Węzły chłonne zostały pobrane, zdysocjowane i przeanalizowane za pomocą cytometru przepływowego. Podano procenty komórek w bramce żywych limfocytów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy protokół operacyjnego usuwania węzłów chłonnych (LN), który może mieć zastosowanie w wielu systemach eksperymentalnych. Mimo że technika ta jest bardzo użyteczna do śledzenia odpowiedzi immunologicznych lub homeostazy komórek odpornościowych, posiada ona kilka ograniczeń. Po pierwsze, można pobrać tylko cztery LN. Po drugie, badana odpowiedź immunologiczna musi mieć charakter systemowy lub występować w powierzchownych LN pachwinowych lub ramiennych (odprowadzających chłonkę ze skóry). Wreszcie, liczba pobranyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Sylvie Lesage oraz wszystkim członkom laboratorium za krytyczną analizę protokołu. Praca ta była finansowana z grantu (MOP-77545) przyznanego przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque korzysta ze wsparcia stypendium FRSQ Senior Scholarship, a Mélissa Mathieu otrzymała stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pinceta precyzyjna Graefe Premium | Harvard Apparatus | 52-2144 | Silnie zakrzywiona, 10 cm (4 in), końcówka 0.8 mm |
| Pinceta do zakładania i zdejmowania klipsów Michela | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Klips Michela 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (chlorowodorek buprenorfiny) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (chlorowodorek ketaminy) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (ksylazyna) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Izofluran | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Maść do oczu Hypotears | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (glukonian chlorheksydyny 2% w alkoholu izopropylowym 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
Bibliografia
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740(2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
