Wyprowadzanie prekursorów z ograniczeniami glejowymi od myszy E13

Summary

Ten protokół opisuje pochodzenie prekursorów o ograniczonym gleju z rdzenia kręgowego płodu i utrzymywanych in vitro zarówno do przeszczepu, jak i do badania linii oligodendrocytów.

Abstract

To jest protokół do pozyskiwania komórek prekursorowych z ograniczeniami glejowymi (GRP) z rdzenia kręgowego płodów myszy E13. Komórki te są wczesnymi prekursorami w linii komórek oligodendrocytarnych. Ostatnio komórki te zostały przebadane jako potencjalne źródło terapii naprawczych w chorobach istoty białej. Leukomalacja okołokomorowa (PVL) jest główną przyczyną niegenetycznej choroby istoty białej w dzieciństwie i dotyka do 50% skrajnych wcześniaków. Dane sugerują zwiększoną podatność rozwijającego się mózgu na niedotlenienie-niedokrwienie, stres oksydacyjny i ekscytotoksyczność, które selektywnie celują w powstającą istotę białą. Prekursory o ograniczonym dostępie glejowym (GRP), komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) i niedojrzałe oligodendrocyty (preOL) wydają się być kluczowymi graczami w rozwoju PVL i są przedmiotem ciągłych badań. Co więcej, wcześniejsze badania zidentyfikowały podzbiór tkanki OUN, który ma zwiększoną podatność na ekscytotoksyczność glutaminianu, a także wzorzec rozwojowy tej podatności. Nasze laboratorium bada obecnie rolę progenitorów oligodendrocytów w PVL i wykorzystuje komórki na etapie rozwoju GRP. Wykorzystujemy te pochodne komórki GRP w kilku paradygmatach eksperymentalnych, aby przetestować ich reakcję na wybrane naprężenia zgodne z PVL. Komórkami GRP można manipulować in vitro w OPC i preOL do eksperymentów transplantacyjnych z mysimi modelami PVL i modelami in vitro urazów podobnych do PVL, w tym niedotlenienia i niedokrwienia. Dzięki zastosowaniu hodowli komórkowych i badań in vitro zmniejszyłaby się zmienność między eksperymentami, co ułatwiłoby interpretację danych. Hodowla komórek pozwala również na wzbogacenie populacji GRP przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu zanieczyszczających komórek o fenotypie innym niż GRP.

Protocol

Wprowadzenie

W tym protokole pokazujemy, jak wyodrębnić, wybrać i umieścić komórki prekursorowe z ograniczeniami glejowymi (GRP) z rdzenia kręgowego płodów myszy E13. Komórki te są wczesnymi prekursorami w liniach komórek oligodendrocytarnych i astrocytarnych i są definiowane przez ich ekspresję A2B5. W pożywce GRP uzupełnionej FGF-2 GRP A2B5 + zaczną wyrażać wczesne markery linii oligodendrocytarnej PDGFαR i NG2^1,2. Te komórki linii oligodendrocytów przechodzą przez szereg odrębnych etapów fenotypowych, z których każdy charakteryzuje się zmianami morfologicznymi, a także ekspresją markerów do określonych etapów rozwoju.

Te komórki prekursorowe są obecnie badane jako potencjalne źródło dla metod terapeutycznych opartych na komórkach w zaburzeniach istoty białej ośrodkowego układu nerwowego, w tym stwardnieniu rozsianym, leukodystrofii i leukomalacji okołokomorowej (PVL)^3,4,5,6. Badania z wykorzystaniem prekursorów linii oligodendrocytów pochodzących z ludzkiego mózgu wykazały udaną remielinizację w mózgach modelu dysmielinizacji myszy z dreszczami, a także w zdemielinizowanych modelach gryzoni rdzenia kręgowego^6,7,8,9. Te glejowe komórki prekursorowe były również wykorzystywane w badaniach innych modeli chorób istoty białej, takich jak uraz rdzenia kręgowego i stwardnienie zanikowe boczne^10,11,12,13.

Nasze laboratorium opracowało wczesny model mysi niedotlenienia i niedokrwienia po urodzeniu, za pomocą którego oceniamy skuteczność tych komórek GRP pochodzących z rdzenia kręgowego jako podejścia regeneracyjnego w PVL, głównej przyczynie porażenia mózgowego^14,15,16. Istnieje również model OPC pochodzący z mózgu gryzoni, który jest szeroko stosowany do badania uszkodzeń istoty białej, ponieważ komórki GRP mają tendencję do różnicowania się w szlak astrocytarny¹⁷. Fenotyp OPC wkroczył już do szlaku linii oligodendrocytów, co wydaje się zjawiskiem nieodwracalnym. Jesteśmy jednak zainteresowani oceną odpowiedzi szerszego spektrum progenitorów oligodendrocytów, w tym GRP, a być może nawet NEP-ów pochodzących z E10.5. Z tego powodu do naszej pracy przyjęliśmy model GRP pochodzący z rdzenia kręgowego.

Oprócz wykorzystania GRP do wymiany komórek, pochodzenie tych komórek z dzikich i transgenicznych modeli gryzoni chorób istoty białej pozwala na dalsze badania nad różnicowaniem gleju w warunkach normalnych i chorobowych w warunkach in vitro. Poprzednie publikacje pokazują dowody na selektywną podatność komórek prekursorowych linii oligodendrocytarnej na różne zewnętrzne czynniki stresogenne, takie jak ekscytotoksyczność glutaminianu zależna od dojrzewania, stres oksydacyjny i wybrane czynniki związane z zapaleniem nerwów^18,19. Nasze badania koncentrowały się na zrozumieniu mechanizmów komórkowych i molekularnych stojących za rozwojem tych urazów istoty białej, ocenie podatności komórek w spektrum linii oligodendrocytów na obrazę, a także analizie przypuszczalnych podejść terapeutycznych.

Materiały

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zgodne z polityką PHS i JHU IACUC. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w celu utrzymania warunków aseptycznych. Zazwyczaj sekcje wykonuje się w okapie z przepływem poziomym, a prace in vitro w okapie z przepływem pionowym. Wszystkie podłoża używane na zimno podczas sekcji. Myszy użyte w naszym badaniu to dziki szczep CD-1 i transgeniczny GFP na tle C57 / BL6. Jedna matka myszy CD-1 zazwyczaj daje 10+ płodów, które wystarczają do wysiewu 1-2 kolb T25. Zazwyczaj dwie matki są poświęcane na raz, a płodowe rdzenie kręgowe są łączone i platerowane w 1 kolbie T25 na matkę. Po pobraniu komórek można je namnażać i charakteryzować in vitro do kolejnych badań.

1. Przygotowanie pożywek i kolb

• Jako pożywkę do rozwarstwiania stosuje się pożywkę podstawową GRP: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) i albuminy surowicy bydlęcej (BSA; 0,5% w/v).
• Podłoże dysocjacyjne: takie samo jak podłoże preparacyjne.
• Pożywka hodowlana: pożywka podstawowa GRP + FGF-2 (10-20 ng/ml; Invitrogen) i heparyny (1 μg/ml; Sigma).
• PLL/laminina powlekane 75 cm² lub 25 cm² kolby (T75 lub T25).
• Kolby do hodowli tkankowych (75^cm2, Falcon) pokryto 15-20 μg/ml poli-L-lizyny (PLL; Sigma) w destylowanym_H2O, inkubowanym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie zasysany. Kolby przemywa się 1X PBS, a następnie pokrywa 15-20 μg/ml Lamininy (Sigma) w PBS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie zasysa i dodaje świeży PBS lub pożywkę, aż komórki będą gotowe do powlekania. Po powlekaniu kolby nigdy nie powinny być pozostawione do wyschnięcia, ale mogą być przechowywane w PBS lub pożywce w temperaturze 4 °C przez krótki czas przed użyciem.

2. Instrumenty i inne materiały

• szalki Petriego: 4 na matkę: 3 szalki Petriego do rozwarstwienia (75 mm), szalka 20 mm do zbierania pobranych rdzeni kręgowych.
• Duże nożyczki (43 mm Nożyczki operacyjne, Roboz) i kleszcze do tkanek do otwierania brzucha matki.
• Małe nożyczki do preparowania macicy i usuwania płodów (15 mm Micro Dissecting Scissors, Roboz).
• Nożyczki sprężynowe Micro Dissecting (6 mm) do preparowania rdzenia kręgowego płodów.
• Kleszcze kątowe do mikropreparowania do zakotwiczenia matki i ciała płodu podczas operacji, a następnie usunięcia rdzenia kręgowego po odsłonięciu.
• Sitko do komórek o średnicy 40 lub 70 mikrometrów do usuwania resztek komórek przed posiewem.
• 0,05% trypsyny podgrzanej do 37 °C.
• 10 mg/ml DNAzy 1 (Sigma), przygotowana jako 100x podstawa (1 g/ml).
• Worek na zwłoki zwierząt.
• Probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml do przetwarzania wyekstrahowanego rdzenia kręgowego.

3. Określanie ciąży w czasie

Ciężarne matki myszy są zamawiane z komercyjnych źródeł, określając poród w embrionalnym dniu E12 lub E13 rozwoju płodu lub ciążę ustaloną wewnętrznie. Krótko mówiąc, późnym popołudniem dwie samice umieszcza się razem z jednym samcem i pozostawia razem na noc. Następnego dnia samice są obserwowane pod kątem obecności czopu śluzowego znajdującego się w pochwie. Czop śluzowy jest jedynie wskazówką, że doszło do krycia, więc zwierzęta są następnie ważone codziennie, aby monitorować tempo wzrostu masy ciała. Dzień, w którym obserwuje się czop śluzowy, określa się jako dzień pierwszy zarodka (E1).

4. Pochodzenie tkanki

1. Pracuj pod okapem z przepływem poziomym, aby utrzymać warunki aseptyki.
2. Spryskaj maskę i obszar roboczy 70% etanolem.
3. Instrumenty w autoklawie lub spryskać obficie 70% etanolem.
4. Przygotuj instrumenty, media i mikroskop do użycia.
5. Wlać 20 ml zimnej pożywki preparacyjnej do sterylnej szalki Petriego.
6. Znieczulić zwierzę hydratem chloralu (500 mg/kg) podawanym dootrzewnowo (IP), a następnie zwichnąć szyjkę macicy lub zdekapitacjonować.
7. Spryskaj okolice brzucha zapory 70-90% etanolem (dezynfekcja)
8. Otwórz brzuch dużymi nożycami i kleszczami.
   1. W szczepach CD1 i C57/BL6: Zwykle od 8 do 14 płodów znajduje się w macicy. Liczba płodów jest zależna od szczepu.
9. Wyciągnij macicę myszy, w tym młode, i umieść w świeżej, zimnej pożywce preparacyjnej na czystej szalce Petriego, aby zmyć krew i resztki tkanek z płodu.
10. Wyjmij każdy płód z rogu macicy i oddziel go od worka embrionalnego i łożyska za pomocą małych nożyczek. Przenieść wyekstrahowane płody do świeżej pożywki preparacyjnej na nowej szalce Petriego.
    1. Pożywka preparcyjna powinna mieć niską temperaturę, aby obniżyć aktywność metaboliczną i zachować żywotność pobranych komórek.
    2. Pracuj od teraz z dwoma kleszczami i mikronożyczkami sprężynowymi do preparowania.
11. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, przetnij skórę wzdłuż rdzenia kręgowego za pomocą mikronożyczek chirurgicznych i oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
12. Przeciąć rdzeń kręgowy nożyczkami mikrochirurgicznymi na około C1 i na początku ogona.
13. Usuń rdzeń kręgowy kleszczami, upewnij się, że wszystkie kości i chrząstki zostały usunięte i przenieś na 3. szalkę Petriego z podłożem preparacyjnym
.
14. Aby zapobiec przerostowi tkanki oponowej w kolejnych hodowlach komórkowych, staraj się usunąć jak najwięcej opon mózgowych z rdzenia kręgowego. Ze względu na powstające wystające nerwy obwodowe jest to trudniejsze niż usunięcie tkanki oponowej z wyekstrahowanego mózgu.
15. Po usunięciu opon mózgowych przenieś rdzeń kręgowy na 20-milimetrową szalkę Petriego
16. Oczyść, dokładnie spryskując obszar 70-90% etanolem.
17. Następujące kroki dysocjacji należy wykonać szybko, aby utrzymać wysoką żywotność uzyskanej tkanki rdzenia kręgowego.

5. Ustanowienie kultury

1. Trypsynę należy wstępnie podgrzać przez co najmniej 30 minut w łaźni o temperaturze 37 °C_{H 2}O. Z wsadu należy usunąć odpowiednią podwielokrotność, aby zmniejszyć narażenie stada na wahania temperatury.
2. Przenieś pobrany rdzeń kręgowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanej trypsyny (0,05%; Quality Biologicals) i 100 μl DNAzy (10 mg/ml) i krótko rozcierać.
3. Inkubować w 37 °C_{H 2}O-bath przez 10 minut.
4. Tryturować i inkubować przez kolejne 10 minut.
5. Dodać 5 ml pożywki GRP (zdefiniowanej powyżej) i wirować przez 5 minut przy 1000 obr./min.
6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad 10 ml pożywki GRP i dodać DNAse-1 (10 mg/ml; Sigma).
7. Inkubować w 37 °C_{H 2}O-bath przez 10 minut.
8. Odwirować 5 minut przy 1000 obr./min i odsysać supernatant.
9. Ponownie zawiesić pelet świeżym podłożem GRP, a następnie przefiltrować zanieczyszczenia za pomocą sitka o wielkości 40 - 70 μm.
10. Płytkę na kolbach o średnicy 25 cm2 pokrytych PLL/lamininą (T25) i inkubować w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%_CO2.
11. 100% zmiana nośnika następnego dnia.
12. W tym momencie dołączyły się GRP i zaczęły rozszerzać procesy.

6. Immunopanning populacji GRP

1. Płytkę tkankę rdzenia kręgowego w kolbach pokrytych PLL / lamininą, aż kolba będzie zlewać się w 85-90% lub około tygodnia.
2. Zebrać komórki przez skrobanie kolby gumowym policjantem lub 0,05% trypsyną, dokładnie, ale delikatnie, roztrzeć, odwirować z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut i dokładnie zawiesić osad z 3 ml pożywki GRP.
3. Przenieść po 1 ml do 3 kolb T25 lub 3 ml do 1 kolby T75, dodać odpowiednią ilość pożywki, aby całkowicie pokryć komórki i pozwolić kolbie osiągnąć 80-90% zbieżności.
4. Zmieniaj nośnik co drugi dzień, wcześniej, jeśli nośnik szybko się wyczerpuje.
5. Bakteriologiczne szalki Petriego (75 mm) pokryć przez noc w temperaturze 4 °C przeciwciałem anty-mysim IgM (Southern Biotech), 10 μg/ml w PBS.
6. Odessać nadmiar buforu i umyć szalki Petriego 3x PBS.
7. Dodać przeciwciało A2B5 (milipore) o stężeniu 5 μg/ml rozcieńczone w PBS i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
8. Umyj talerze ponownie 3x PBS, a następnie dodaj 8 ml podłoża GRP, aby zapobiec wysuszeniu talerza.
9. Przenieść 5 ml pożywki GRP z szalek Petriego i zebrać komórki GRP, zeskrobując kolby gumowym policjantem w celu odłączenia wszystkich komórek
10. Krótko rozetrzeć zawiesinę komórkową, aby rozbić grudki i przenieść 5 ml zawiesiny komórkowej na bakteriologiczne szalki Petriego pokryte A2B5.
11. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
12. Po 1 godzinie odessać pożywkę i umyć płytki 8x PBS.
13. Delikatnie zeskrobać komórki gumowym policjantem w 2 ml pożywki GRP, a następnie przenieść na płytki lub kolby pokryte PLL/lamininą z odpowiednią objętością podłoża GRP.

7. Zamrażanie i przechowywanie komórek pochodnych

1. Komórki pobiera się z 85-90% zlewającej się kolby T25 lub T75 z 2 ml 0,05% trypsyny.
2. Trypsynę rozcieńcza się i inaktywuje 8 ml pożywki GRP i odwirowuje z prędkością 1000 obr./min przez 5 min.
3. Granulki z kolb T25 są ponownie zawieszane w 1 ml pożywki do zamrażania GRP (pożywka podstawowa GRP uzupełniona 10% (v/v) DMSO i opcjonalnie 20% FBS). Większe granulki z kolb T75 rozcieńcza się dwukrotnie.
4. Zawiesiny komórek 1,5 -- 3 x 10^10,11,12,13 są przenoszone do fiolek kriogenicznych (Nalgene) i przechowywane przez noc w pojemniku kriogenicznym (Nalgene) zawierającym izopropanol w temperaturze -80 °C, aby powoli zamarznąć przez noc.
5. Po zamrożeniu przez noc komórki są przenoszone do zamrażarek i przechowywane przez okres od 6 miesięcy do 1 roku w temperaturze -80 °C lub dłużej w N_(l). Rozmrożone komórki są zwykle żywotne w 60-80%, w dużej mierze w zależności od jakości powłoki PLL/lamininy.

8. Reprezentatywne wyniki

CO₂ nie jest używany do znieczulania zwierzęcia ze względu na możliwy wpływ na żywotność płodów i ostatecznie na pobrane komórki. Co więcej, bardzo trudno będzie całkowicie usunąć opony mózgowe z rdzenia kręgowego podczas procedury derywacji, ale połączenie pożywki GRP i immunopanningu wyeliminuje te szybko rosnące komórki. Podobnie, cały rdzeń kręgowy jest pobierany pomimo większej koncentracji brzusznej populacji GRP ze względu na jej pochodzenie z brzusznego rdzenia kręgowego i migrację grzbietową²⁰. Jednak pożywka GRP selekcjonuje fenotyp GRP, a populacja ta jest maksymalizowana przez immunopanning A2B5. Po posieciu tkanek rdzenia kręgowego kultury in vitro inkubuje się przez dwa pasaże lub około tygodnia. Po 2 dniach w hodowli w kolbach do hodowli tkankowej można zaobserwować komórki o różnej morfologii, co wskazuje na niejednorodność populacji, ale pożywka GRP dokonuje selekcji pod kątem fenotypu GRP. Komórki te są kombinacją A2B5 + GRP, E-NCAM + prekursorów ograniczonych neuronów (NRP) i komórek neuronabłonkowych nestin+, A2B5 - i prawdopodobnie komórek opon mózgowych fibronektyny +. Ponadto mogą być obecne bardziej dojrzałe fenotypy wykazujące ekspresję markerów, w tym podwójnej kortyny i Tuj1 dla linii neuronalnej, GFAP dla astrocytów oraz PDGFaR i GalC dla linii oligo. Aby zmaksymalizować populację wysoce wzbogaconą w GRP z początkowej puli heterogenicznej (Figura 1A), komórki można poddać podwójnej immunogenizacji w celu wyselekcjonowania i wyeliminowania komórek E-NCAM+, a następnie selekcji do populacji GRP A2B5 +, gdy gęstość komórek wzrośnie do około 85-90% zbiegu w T75 Kolby. Te komórki GRP zachowują swoją zdolność do stawania się astrocytami, mimo że znajdują się w pożywce, która selekcjonuje fenotyp oligodendrocytów, więc późniejsza immunopanacja A2B5 może być konieczna do utrzymania wysoce wzbogaconej populacji GRP. Immunopanning zazwyczaj daje do 95% komórek A2B5+, ale w celu uzyskania jeszcze większej wydajności można zastosować sprzężone kulki magnetyczne A2B5 (Miltenyi Biotec Inc.), aby zapewnić wydajność do 97%. Czujność w utrzymaniu kultur GRP, takich jak regularne zmiany pożywki, zminimalizuje proliferację typów komórek innych niż GRP. Nawet przy braku BMP-4 astrocyty mogą być nadal znalezione, a zubożone pożywki, w szczególności, wydają się indukować różnicowanie do fenotypu astrocytowego. Chociaż suplement witaminy B27 zawiera hormon trójjodotyroninowy (T3), nie zaobserwowano tendencji do różnicowania się w oligodendrocyty w populacji GRP, zjawisko to występuje tylko wtedy, gdy do pożywki dodaje się wyższe poziomy T3. Jednak suplement B27 wolny od T3 można zastąpić, jeśli istnieje obawa o zanieczyszczenie dojrzałymi oligodendrocytami (ryc. 1B). Te komórki GRP można łatwo zidentyfikować na podstawie morfologii małej somy z 2 lub 3 krótkimi procesami, ale w celu wykrycia innych typów komórek, które mogą być obecne, można przeprowadzić immunocytochemię dla wcześniej nazwanych wspólnych markerów rozwojowych i specyficznych dla typu komórki. Zwykle będzie istniała niewielka trwała populacja komórek A2B5, które są neuronabłonkowe (NEP) i mogą stać się GRP lub NRP. Na szczęście im dłużej komórki są utrzymywane w pożywce GRP, tym większe prawdopodobieństwo, że pożywka dokona selekcji dla fenotypu GRP.

Rysunek 1. a) Platerowane komórki rdzenia kręgowego o niejednorodnej morfologii obserwuje się po 2 dniach w hodowli. b) Immunopanacja maksymalizuje populację wysoce wzbogaconą w GRP z wyjściowej puli heterogenicznej.

Discussion

Zaburzenia istoty białej ośrodkowego układu nerwowego obejmują dużą liczbę etiologii, w tym przyczyny genetyczne, zapalne, niedokrwienne i toksyczne^{19,21,22,23,24}. Podczas gdy stwardnienie rozsiane i waskulopatie są główną przyczyną choroby istoty białej u dorosłych, leukomalacja okołokomorowa związana z wcześniactwem jest najczęstszą przyczyną uszkodzenia istoty białej w populacji dziecięcej. W celu dokładniejszego nakreślenia mechanizmów chorobowych konieczne są dalsze badania komórek linii ofoligodendrocytarnej, na które duży wpływ ma uraza okołoporodowa. GRP wyizolowano z embrionalnego rdzenia kręgowego gryzonia i wykazano, że mają one charakter tripotencjalny, dając początek oligodendrocytom i dwóm odrębnym populacjom astrocytów, ale nie różnicują się w neurony^2,25,26. Wykazano również, że komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) pochodzące z nerwu wzrokowego szczura i późnoembrionalnego lub wczesnego postnatalnego mózgu szczura dojrzewają do funkcjonalnych oligodendrocytów w odpowiednich warunkach pożywki^27,28. Dodatkowo, ludzkie OPC pochodzące od płodu lub osoby dorosłej zostały następnie zmanipulowane w celu uzyskania bardziej dojrzałych fenotypów oligodendrocytów^29,30.

Komórki GRP wyizolowano zarówno z rdzenia kręgowego szczurów E13.5, jak i E12-13.5 u myszy. U szczurów odnotowano różnice między komórkami GRP pochodzącymi z grzbietu i brzuszu w ich odpowiedzi na warunki, które sprzyjają wytwarzaniu oligodendrocytów lub astrocytów z GRP pochodzącymi z brzusznej, wykazujących większą skłonność do różnicowania się w bardziej dojrzałe fenotypy^25,26,28. Może to być spowodowane migracją brzuszną do grzbietowej powstających komórek GRP, które mogą być mniej podatne na sygnały różnicowania. Immunopaning pozwala na wyizolowanie i zebranie subpopulacji, która wyraża A2B5 w celu utrzymania w hodowli.

Nasze mysie hodowle GRP pochodzą z całkowitej tkanki rdzenia kręgowego, która daje niejednorodną, zbiorczą populację komórek, z których komórki GRP są wybierane za pomocą technik chemicznych (pożywki) i opartych na przeciwciałach. Podczas gdy w naszych badaniach wykorzystano mysie komórki GRP pochodzące z rdzenia kręgowego, ostatnio doniesiono o pochodzeniu komórek progenitorowych oligodendrocytów myszy pochodzących z mózgu, które są również zdolne do rozwoju w dojrzałe oligodendrocyty³¹. Tutaj uzyskane komórki są początkowo hodowane jako oligosfery, które przy użyciu odpowiedniej pożywki hodowlanej są manipulowane w celu wzbogacenia populacji PDGFαR+, OPC³¹. Nasze badania koncentrowały się na wpływie naszego modelu uszkodzenia niedotlenieniowo-niedokrwiennego na komórki w spektrum linii oligodendrocytów od prekursorów A2B5+, PDGFαR-GRP do dojrzałych oligodendrocytów eksprymujących podstawowe białko mieliny (MBP+). Rzeczywiście, nasza charakterystyka in vitro wykazała, że te niedojrzałe komórki GRP dojrzewają do komórek wyrażających MBP w monokulturach lub w kokulturach z neuronami korowymi. Komórkami tymi można manipulować w hodowli w celu uzyskania specyficznych szlaków różnicowania w celu badania mechanizmów związanych z okołoporodowym uszkodzeniem istoty białej. Istnieje kilka mysich modeli chorób istoty białej obejmujących komórki linii oligodendrocytów, a dostępność tej populacji pozwala na dokładne zbadanie mechanizmów powodujących uszkodzenia, a także na zbadanie przydatności możliwych opcji terapii komórkowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsyna (0,05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLI-L-LIZYNA HBr	Sigma-Aldrich	P1274-25MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Dnaza 1	Sigma-Aldrich	DN25