Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapie oparte na komórkach macierzystych oferują znaczny potencjał dla medycyny regeneracyjnej. Jednak wciąż wiele pozostaje niejasne w kwestii kinetyki in vivo przeszczepionych komórek. Nieinwazyjna metoda powtarzalnego monitorowania przeszczepionych komórek macierzystych in vivo pozwoliłaby badaczom na bezpośrednią obserwację transplantacji komórek macierzystych oraz identyfikację udanych lub nieudanych wyników engraftmentu.
Szeroki zakres komórek macierzystych jest nadal badany pod kątem niezliczonych zastosowań. Niniejszy protokół koncentruje się na trzech różnych populacjach komórek macierzystych: ludzkich komórkach embrionalnej nerki 293 (HEK293), ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych (hMSC) oraz indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPS). Komórki HEK293 pochodzą z ludzkich komórek embrionalnej nerki hodowanych z fragmentami DNA adenowirusa 5. Komórki te są powszechnie stosowane w badaniach, ponieważ są łatwe w hodowli, szybko rosną i łatwo ulegają transfekcji. hMSC występują w szpiku dorosłych. Komórki te mogą być powielane jako komórki niedróżnicowane przy zachowaniu multipotencji, czyli potencjału do różnicowania się w ograniczoną liczbę typów komórek. hMSC mogą różnicować się w linie tkanek mezenchymalnych, w tym w osteoblasty, adipocyty, chondrocyty, ścięgna, mięśnie i zrąb szpiku. Komórki iPS to genetycznie przeprogramowane komórki dorosłych, które zostały zmodyfikowane tak, aby eksponować geny i czynniki podobne do cech definiujących embrionalne komórki macierzyste. Komórki te są pluripotencjalne, co oznacza, że mają zdolność różnicowania się we wszystkie linie komórkowe 1. Zarówno hMSC, jak i komórki iPS wykazały zdolność do regeneracji tkanek in-vivo.
Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) wraz z zastosowaniem markerów komórkowych w postaci superparamagnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza (SPIO) okazało się skuteczne w śledzeniu komórek macierzystych in vivo dzięki niemal mikroskopowej rozdzielczości anatomicznej, dłuższemu okresowi półtrwania we krwi umożliwiającemu obrazowanie podłużne oraz wysokiej czułości wykrywania komórek zapewnianej przez obrazowanie MR nanocząsteczek SPIO 2-4. Ponadto obrazowanie MR z wykorzystaniem SPIO jest możliwe do wdrożenia w praktyce klinicznej. SPIO składają się z rdzenia tlenku żelaza z powłoką powierzchniową z dekstranu, karboksydekstranu lub skrobi, która służy do izolacji bioreaktywnego rdzenia żelaznego od składników osocza. Środki te tworzą lokalne niejednorodności pola magnetycznego, które prowadzą do osłabienia sygnału na obrazach MR ważonych w czasie T2 5. Niestety SPIO nie są już produkowane. Alternatywę stanowią jednak ultramałe nanocząsteczki SPIO (USPIO) drugiej generacji. Ferumoksytol (FerahemeTM) jest jednym z USPIO składających się z niestochiometrycznego rdzenia magnetytu otoczonego powłoką z poli-glukozowego sorbitolowego karboksymetyleteru. Koloidalna wielkość cząsteczek ferumoksytolu wynosi 17-30 nm, co określono metodą rozpraszania światła. Masa cząsteczkowa wynosi 750 kDa, a stała relaksacyjna przy natężeniu pola MRI 2T wynosi 58,609 mM-1 sec-14. Ferumoksytol został niedawno zatwierdzony przez FDA jako suplement żelaza do leczenia niedoboru żelaza u pacjentów z niewydolnością nerek 6. Nasz zespół zastosował ten środek poza oficjalnymi wskazaniami („off label”) do znakowania komórek. Nasza technika wykazuje efektywne znakowanie komórek macierzystych ferumoksytolem, co prowadzi do znaczących efektów sygnału MR znakowanych komórek na obrazach MR. Technika ta może być stosowana do nieinwazyjnego monitorowania terapii komórkami macierzystymi w warunkach przedklinicznych i klinicznych.
Protokół
1. Dzień 1
1) Wysianie komórek
- Wysiać hMSC w kolbie T75 do osiągnięcia 80% konfluencji na co najmniej 18-24 godziny przed znakowaniem. Instrukcje dotyczące innych naczyń znajdują się w Tabeli 1.
2. Dzień 2
2) Przygotuj roztwór do znakowania. Ta ilość pozwoli na oznakowanie jednej (1) kolby T75 przy 80% konfluencji z zastosowaniem stężenia 400 μg Fe/ml. Instrukcje dla innych naczyń znajdują się w Tabeli 1.
- Przygotować roztwór (roztwór 1), mieszając 1 ml medium bez surowicy i 93,1 μl ferumoksytolu (stężenie zapasu: 30 mg/ml) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Przygotować drugi roztwór (roztwór 2), mieszając 1 ml medium bez surowicy i 7 μl siarczanu protaminy (stężenie zapasu: 10 mg/ml) w drugiej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Pozostawić każdy z roztworów na 5 minut.
- Połączyć roztwory 1 i 2. Delikatnie wymieszać otrzymany roztwór znakujący. Pozostawić roztwór na 5 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów USPIO-siarczan protaminy.
- Do 2 ml zmieszanego roztworu SPIO/siarczanu protaminy dodać 5 ml medium bez surowicy, aby uzyskać objętość końcową 7 ml.
3) Przygotowanie komórek do znakowania
- Odssać pożywkę z komórek.
- Delikatnie przemyć komórki raz 2-3 ml podgrzanego D-PBS bez Mg/Ca lub pożywki bez surowicy, aby usunąć pozostałości białek surowiczych i/lub inne składniki pożywki, które mogłyby upośledzić wychwyt środka kontrastowego i wydajność znakowania. Odssać płyn do płukania.
4) Oznakowanie komórek
- Do komórek dodać pełną objętość 7 ml roztworu znakującego.
- Umieścić komórki w inkubatorze (37°C/ 5% CO2) i inkubować w roztworze znakującym przez 4 godziny.
- Do roztworu znakującego dodać 700 μl FCS, aby uzyskać końcowe stężenie surowicy wynoszące 10%. Surowicę dodaje się w celu przywrócenia wzbogaconego środowiska, do którego komórki są przyzwyczajone, oraz aby zminimalizować śmierć komórek, która mogłaby nastąpić w wyniku gwałtownej zmiany na 24-godzinną ekspozycję w środowisku bezsurowiczym.
- Inkubować komórki w roztworze znakującym przez dodatkowe 20 godzin.
3. Dzień 3
5) Przygotuj oznakowane komórki
- Odssać roztwór znakujący z komórek.
- Delikatnie wypłukać komórki 2-3 ml uprzednio ogrzanego D-PBS bez Mg/Ca. Odssać PBS. Ważne jest użycie PBS bez Mg/Ca, ponieważ Mg i Ca obniżą wydajność trypsyny w następnym kroku.
- Dodać do komórek 2 ml uprzednio ogrzanej 0,05% trypsyny i przechylać kolbę w przód i w tył, aby upewnić się, że cała powierzchnia kolby jest pokryta cienką warstwą trypsyny. Umieścić komórki w inkubatorze (37°C/ 5% CO2) i pozostawić na 5-7 minut lub do momentu, aż komórki zaczną odrywać się od płytki. Może być konieczne potwierdzenie odrywania się pod mikroskopem. W razie potrzeby delikatnie opukać ścianki kolby, aby ułatwić oddzielenie komórek od powierzchni.
- Dodać do kolby 4 ml uprzednio ogrzanego pożywki kompletnej, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie wypłukać kolbę, pipetując roztwór trypsyny/pożywki/komórek w górę i w dół kilka razy. Zebrać cały roztwór do stożkowej probówki 15 ml. Centryfugować zawiesinę komórkową przy 400 RCF przez 5 minut.
- Ostrożnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspendować komórki w 5 ml pożywki (z surowicą lub bezsurowiczej). Centryfugować zawiesinę komórkową przy 400 RCF przez 5 minut.
- Powtórzyć przemywanie komórek opisane w kroku 5.5. Łącznie komórki zostaną wypłukane trzy razy, aby usunąć pozostałości wolnego środka kontrastowego z pożywki i z powierzchni komórek.
- Na tym etapie policzyć komórki, aby uzyskać najdokładniejszy wynik, ponieważ podczas poprzednich przemywań nastąpiła utrata komórek. Wykonać test żywotności komórek. Komórki są teraz gotowe do dalszych analiz i/lub zastosowań eksperymentalnych. Obrazowanie MR można przeprowadzić z parametrami T1-w i T2-w, ponieważ mimo że ferumoksytol jest środkiem kontrastowym T2-w, wykazuje on również efekty T1. Reprezentatywne parametry MRI T2-w, które można wykorzystać do obrazowania komórek znakowanych ferumoksytolem, obejmują: sekwencje FSE lub SE_Multislice z TR 2000-2500 ms i TE 60-80 ms. Aby uzyskać obraz T1-w, należy zmniejszyć wartość TE w sekwencji FSE lub SE_Multislice lub zastosować sekwencję GRE z wysokim TR i niskim TE. Rycina 4 przedstawia potencjalne zastosowanie in vivo w obrazowaniu znakowanych komórek macierzystych.
4. Reprezentatywne wyniki:
Komórki znakowane wykazują znaczne ściemnienie lub efekt kontrastu negatywnego na obrazach MR ważonych w czasie T2 oraz rozjaśnienie lub efekt kontrastu pozytywnego na obrazach MR ważonych w czasie T1 (Rycina 2). Podłużne obrazowanie MR oraz testy żywotności przeprowadzone 5 dni po znakowaniu nie wykazały istotnego sygnału MR ani znaczącego wpływu na żywotność w porównaniu z nieznakowanymi kontrolami (dane nie zostały przedstawione).
Oznakowane komórki macierzyste mogą być następnie różnicowane w różne typy komórek lub wstrzykiwane dożylnie w celu przeprowadzenia badań in vivo.
Rycina 1. Schematyczny harmonogram znakowania komórek macierzystych nanocząsteczkami tlenku żelaza, ferumoksytolem.
Rysunek 2. Obrazy MR przekrojów strzałkowych przez probówki Eppendorf z osadem komórkowym. A) Kontrole nieznakowane. B) Komórki znakowane wykazujące znaczący efekt T2 lub efekt negatywnego środka kontrastowego w obrazowaniu FSE lub SE_Multislice zależnym od T2 oraz efekt T1 lub efekt pozytywnego środka kontrastowego w sekwencji GRE zależnej od T1.
Rycina 3. Przekroje strzałkowe probówek Eppendorf z osadami komórkowymi. Za pomocą obrazowania MR w obrazach T2-w można wykryć już 10 000 komórek znakowanych ferumoksytolem.
Rysunek 4. Wizualizacja MR komórek macierzystych znakowanych ferumoksytolem, wstrzykniętych do komór mózgowia myszy. A) Osiowy obraz MR mózgu myszy bez wstrzyknięcia komórek macierzystych znakowanych USPIO. B) Osiowy, C) czołowy i D) strzałkowy obraz MR przedstawiający efekt negatywnego kontrastu T2 komórek macierzystych znakowanych USPIO (białe strzałki) wstrzykniętych do mózgu myszy.
Tabela 1. Adaptacje ilościowe dla znakowania komórek w różnych naczyniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Poprawa skuteczności engraftmentu komórek macierzystych jest kluczowa dla rozwoju medycyny regeneracyjnej. Nieinwazyjna technika wizualizacji komórek macierzystych in vivo znacząco zwiększa naszą zdolność do zrozumienia mechanizmów prowadzących do pomyślnego przylegania i integracji przeszczepu. Znakowanie magnetyczne do wizualizacji w MR, takie jak zaprezentowana przez nas procedura, umożliwia śledzenie komórek macierzystych in vivo za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste znakowane magnetycznie b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy niniejszego badania nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases: 3R01AR054458-02S2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Lub inne pożywka podstawowa dla zamierzonej do użycia linii komórek macierzystych |
| D-PBS (wolny od Ca++ i Mg++) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsyna-EDTA 0,05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoksytol (Feraheme) | AMAG | 59338-0775-01 | |
| Siarczan protaminy | APP Pharmaceuticals | 22930 |
Bibliografia
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
