Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Podsumowanie

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Streszczenie

Terapie oparte na komórkach macierzystych oferują znaczny potencjał dla medycyny regeneracyjnej. Jednak wciąż wiele pozostaje niejasne w kwestii kinetyki in vivo przeszczepionych komórek. Nieinwazyjna metoda powtarzalnego monitorowania przeszczepionych komórek macierzystych in vivo pozwoliłaby badaczom na bezpośrednią obserwację transplantacji komórek macierzystych oraz identyfikację udanych lub nieudanych wyników engraftmentu.

Szeroki zakres komórek macierzystych jest nadal badany pod kątem niezliczonych zastosowań. Niniejszy protokół koncentruje się na trzech różnych populacjach komórek macierzystych: ludzkich komórkach embrionalnej nerki 293 (HEK293), ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych (hMSC) oraz indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPS). Komórki HEK293 pochodzą z ludzkich komórek embrionalnej nerki hodowanych z fragmentami DNA adenowirusa 5. Komórki te są powszechnie stosowane w badaniach, ponieważ są łatwe w hodowli, szybko rosną i łatwo ulegają transfekcji. hMSC występują w szpiku dorosłych. Komórki te mogą być powielane jako komórki niedróżnicowane przy zachowaniu multipotencji, czyli potencjału do różnicowania się w ograniczoną liczbę typów komórek. hMSC mogą różnicować się w linie tkanek mezenchymalnych, w tym w osteoblasty, adipocyty, chondrocyty, ścięgna, mięśnie i zrąb szpiku. Komórki iPS to genetycznie przeprogramowane komórki dorosłych, które zostały zmodyfikowane tak, aby eksponować geny i czynniki podobne do cech definiujących embrionalne komórki macierzyste. Komórki te są pluripotencjalne, co oznacza, że mają zdolność różnicowania się we wszystkie linie komórkowe ¹. Zarówno hMSC, jak i komórki iPS wykazały zdolność do regeneracji tkanek in-vivo.

Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) wraz z zastosowaniem markerów komórkowych w postaci superparamagnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza (SPIO) okazało się skuteczne w śledzeniu komórek macierzystych in vivo dzięki niemal mikroskopowej rozdzielczości anatomicznej, dłuższemu okresowi półtrwania we krwi umożliwiającemu obrazowanie podłużne oraz wysokiej czułości wykrywania komórek zapewnianej przez obrazowanie MR nanocząsteczek SPIO ^2-4. Ponadto obrazowanie MR z wykorzystaniem SPIO jest możliwe do wdrożenia w praktyce klinicznej. SPIO składają się z rdzenia tlenku żelaza z powłoką powierzchniową z dekstranu, karboksydekstranu lub skrobi, która służy do izolacji bioreaktywnego rdzenia żelaznego od składników osocza. Środki te tworzą lokalne niejednorodności pola magnetycznego, które prowadzą do osłabienia sygnału na obrazach MR ważonych w czasie T2 ⁵. Niestety SPIO nie są już produkowane. Alternatywę stanowią jednak ultramałe nanocząsteczki SPIO (USPIO) drugiej generacji. Ferumoksytol (FerahemeTM) jest jednym z USPIO składających się z niestochiometrycznego rdzenia magnetytu otoczonego powłoką z poli-glukozowego sorbitolowego karboksymetyleteru. Koloidalna wielkość cząsteczek ferumoksytolu wynosi 17-30 nm, co określono metodą rozpraszania światła. Masa cząsteczkowa wynosi 750 kDa, a stała relaksacyjna przy natężeniu pola MRI 2T wynosi 58,609 mM-1 sec-1⁴. Ferumoksytol został niedawno zatwierdzony przez FDA jako suplement żelaza do leczenia niedoboru żelaza u pacjentów z niewydolnością nerek ⁶. Nasz zespół zastosował ten środek poza oficjalnymi wskazaniami („off label”) do znakowania komórek. Nasza technika wykazuje efektywne znakowanie komórek macierzystych ferumoksytolem, co prowadzi do znaczących efektów sygnału MR znakowanych komórek na obrazach MR. Technika ta może być stosowana do nieinwazyjnego monitorowania terapii komórkami macierzystymi w warunkach przedklinicznych i klinicznych.

Protokół

1. Dzień 1

1) Wysianie komórek

1. Wysiać hMSC w kolbie T75 do osiągnięcia 80% konfluencji na co najmniej 18-24 godziny przed znakowaniem. Instrukcje dotyczące innych naczyń znajdują się w Tabeli 1.

2. Dzień 2

2) Przygotuj roztwór do znakowania. Ta ilość pozwoli na oznakowanie jednej (1) kolby T75 przy 80% konfluencji z zastosowaniem stężenia 400 μg Fe/ml. Instrukcje dla innych naczyń znajdują się w Tabeli 1.

1. Przygotować roztwór (roztwór 1), mieszając 1 ml medium bez surowicy i 93,1 μl ferumoksytolu (stężenie zapasu: 30 mg/ml) w stożkowej probówce o pojemności 15 m....

Dyskusja

Poprawa skuteczności engraftmentu komórek macierzystych jest kluczowa dla rozwoju medycyny regeneracyjnej. Nieinwazyjna technika wizualizacji komórek macierzystych in vivo znacząco zwiększa naszą zdolność do zrozumienia mechanizmów prowadzących do pomyślnego przylegania i integracji przeszczepu. Znakowanie magnetyczne do wizualizacji w MR, takie jak zaprezentowana przez nas procedura, umożliwia śledzenie komórek macierzystych in vivo za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste znakowane magnetycznie b.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648	Lub inne pożywka podstawowa dla zamierzonej do użycia linii komórek macierzystych
D-PBS (wolny od Ca++ i Mg++)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsyna-EDTA 0,05%	Invitrogen	25300-120
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoksytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-01
Siarczan protaminy	APP Pharmaceuticals	22930