Artykuł metodologiczny

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3483

⸱

9 października 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Wirus Maedi-visna (MVV) jest lentiwirusem owiec, wywołującym powoli postępujące zapalenie śródmiąższowe płuc oraz zapalenie mózgu i rdzenia1. Uważa się, że głównymi komórkami docelowymi MVV in vivo są komórki linii monocytów2. Niektóre szczepy MVV mogą jednak replikować się w innych typach komórek3,4. Zielone białko fluorescencyjne jest powszechnie stosowanym markerem do badania lentiwirusów w żywych komórkach. Wprowadziliśmy gen egfp do genu dUTPazy MVV. Gen dUTPazy jest dobrze zachowany w większości szczepów lentiwirusów owiec i kóz i wykazano jego istotną rolę w replikacji CAEV5. Wykazano jednak, że dUTPaza jest zbędna dla replikacji klonu molekularnego MVV użytego w niniejszym badaniu, zarówno in vitro, jak i in vivo6. Replikacja MVV jest ściśle ograniczona do komórek pochodzenia owczego lub koziego. Do transfekcji i propagacji wirusa wykorzystujemy pierwotną linię komórkową z splotu naczyniówkowego owiec (komórki SCP)7. Fluorescencyjny MVV jest w pełni zakaźny, a ekspresja EGFP pozostaje stabilna przez co najmniej 6 pasażów8. Istnieje dobra korelacja między pomiarami TCID50 a EGFP. Wirus ten powinien być zatem przydatny do szybkiego wykrywania zainfekowanych komórek w badaniach tropizmu komórkowego i patogenności in vitro oraz in vivo8.

Protokół

1. Transfekcja

Klon molekularny znajduje się w dwóch plazmidach, p8XSp5-egfp oraz p67r, o wielkości odpowiednio 12 kb i 4,5 kb.9,10

  1. Przetraw ekvimolarne ilości dwóch plazmidów, tj. 4,4 μg p8XSp5-egfp oraz 1,6 μg p67r przy użyciu enzymu XbaI, a następnie przeprowadź ligację przed transfekcją.
  2. Do ligacji wykorzystaj 1 jednostkę Weissa ligazy w reakcji o objętości 50 μl i inkubuj przez noc w temperaturze 16°C.
  3. Po zakończeniu ligacji inkubuj mieszaninę w temperaturze 65°C przez 15 min w celu inaktywacji ligazy. Krok ten można pominąć.
  4. Na dwa dni przed transfekcją wysiej 106 komórek SCP do kolby hodowlanej T25 i hoduj komórki przez dwa dni w 5 ml DMEM z dodatkiem 10% surowicy jagnięcej i 2mM glutaminy, bez antybiotyków, aż do uzyskania monowarstwy o 90% konfluencji. Jeśli po dwóch dniach komórki nie osiągnęły 90% konfluencji, pozostaw je do wzrostu na jeden dodatkowy dzień.

Uwaga: serum jagnięce można zastąpić płodową surowicą bydlęcą (FBS). Rutynowo stosujemy serum jagnięce, ponieważ niektóre szczepy MVV są hamowane przez FBS; jednak ten szczep MVV nie jest hamowany przez FBS.

  1. Gdy komórki będą gotowe do transfekcji, należy wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicą (surowica jagnięca lub FBS) bez antybiotyków.
    Do transfekcji wykorzystujemy Lipofectamin 2000 (Invitrogen).
  2. Rozcieńcz DNA w 500μl pożywki Opti-MEM.
  3. Rozcieńcz 20μl Lipofectamin 2000 w 500μl pożywki Opti-MEM i pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 5 min.
  4. Po 5-minutowej inkubacji połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczoną Lipofectaminą 2000 (objętość całkowita = 1000 μl). Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20-30 min w RT.
  5. Dodaj mieszaninę do transfekcji (1 ml) do kolby T25 zawierającej komórki SCP i pożywkę (5 ml). Wymieszaj, delikatnie kołysząc kolbą.
  6. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez noc (18 – 24 h).
  7. Następnego dnia wymień pożywkę na DMEM z 1% surowicą, 2mM glutaminą, 100IU penicyliną i 100IU streptomycyną.
  8. Monitoruj produkcję GFP w komórkach SCP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W przypadku tych komórek pierwotnych można spodziewać się niskiej wydajności transfekcji, zazwyczaj na poziomie 5 – 15%.
  9. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez kilka dni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa w kolbie. Pełna infekcja zajmuje zazwyczaj od 7 do 14 dni.
  10. Zabierz wirusa, rozdzielając nadsącz do probówek Eppendorfa. Wirować w mikrocentryfudze przy 3000 rpm przez 5 min, aby usunąć szczątki komórkowe. Przenieś nadsącz zawierający wirusa do nowych probówek. Przechowuj w temperaturze -80°C.

2. Miareczkowanie wirusa

  1. Wysiać 3x104 komórek SCP w 100 μl pożywki DMEM uzupełnionej o 10% surowicy, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na każdą studzienkę w płytce 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2.
  2. Jeśli następnego dnia komórki osiągną konfluencję, wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicy, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny, w ilości 100 μl na każdą studzienkę.
  3. Rozcieńczyć wirusa w następujący sposób:
    1. Do 4 x 10 studzienek w 96-dołkowej płytce z dnem okrągłym lub w kształcie litery V dodać po 180 μl pożywki DMEM z 1% surowicy, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na studzienkę.
    2. W celu wykonania dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w czterech powtórzeniach, dodać 20 μl wirusa do każdej z 4 studzienek w pierwszej kolumnie płytki, a następnie, używając pipety czterokanałowej, pipetować w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek. Wymienić końcówki pipety i przenieść 20 μl do kolejnych 4 studzienek i tak dalej. Pozostałe ostatnie studzienki pozostawić bez wirusa jako kontrolę negatywną.
  4. Dodać 100 μl rozcieńczeń wirusa do komórek SCP i pożywki.
  5. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2. Obserwować pod kątem fluorescencji GFP oraz efektów cytopatycznych przez dwa tygodnie.
    Efekty cytopatyczne objawiają się zaokrągleniem komórek i mniejszą przezroczystością w porównaniu do normalnych komórek, z wydłużającymi się wypustkami, co kończy się pojawieniem się komórek wielojądrowych i śmiercią komórek.
  6. Obliczyć miano wirusa (TCID50) metodą Reeda i Muencha11.

3. Analiza FACS zainfekowanych komórek

Uwaga: W celu szybkiego monitorowania replikacji wirusa zainfekowane komórki można poddać analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

  1. Zatrawić trypsyną zainfekowane komórki (ok. 105), przemyć 1x buforem PBS i resuspendować w 500μl PBS.
  2. Dodać 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%), inkubować w RT przez 30 min.
  3. Odwirować komórki w mikrowirówce przy 3000 rpm przez 5 min.
  4. Przemyć buforem PBS 2x przez 5 min i przeanalizować na analizatorze FACScan. Policzyć 10 000 zdarzeń.

4. Reprezentatywne wyniki:

Wirus ten powinien być w pełni zakaźny i namnażać się do miana 106 – 107 TCID50/ml. Zainfekowane komórki wykazują fluorescencję, którą można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Zazwyczaj w zainfekowanych kulturach komórkowych GFP można wykryć w ponad 60% komórek przy użyciu cytometrii przepływowej (Ryc. 1). Podobnie, podczas obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej większość komórek wykazuje fluorescencję (Ryc. 2A i B).

Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej; analiza ekspresji GFP; różnicowanie populacji komórek.
Rysunek 1. Analiza FACScan komórek SCP zainfekowanych wirusem KV1772-egfp po 7 dniach od infekcji.

Porównanie morfologii komórek; obrazowanie techniką mikroskopii w polu jasnym (A) i fluorescencyjnej (B).
Rycina 2. Mikroskopia kontrastowa komórek SCP zainfekowanych KV1772-egfp po 7 dniach inkubacji (A). Te same komórki zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj ekspresujący GFP klon molekularny MVV powinien być użyteczny do analizowania interakcji z komórkami gospodarza oraz patogeniczności MVV zarówno in vitro, jak i in vivo. Wirus uzyskany po 7–14 dniach replikacji z pewnością nabył pewne mutacje ze względu na niedokładność odwrotnej transkryptazy. Istnieją jednak ograniczenia w stosowaniu tego klonu jako wektora jednocyklowego. Jednym z nich jest fakt, że użycie tego klonu ogranicza się do komórek pochodzenia owczego i koziego. Wydajność transfekcji tych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana przez Islandzki Fundusz Badawczy (Icelandic Research Fund) oraz Fundusz Badawczy Uniwersytetu Islandzkiego (University of Iceland Research Fund).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGIBCO, od Life Technologies10938025
Opti-MEMGIBCO, od Life Technologies51985018
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019

Bibliografia

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
  3. Andresdottir, V. Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus. Virus Genes. 16, 281-293 (1998).
  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
  5. Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions. J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).
  6. Petursson, G. Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity. J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).
  7. Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).
  8. Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein. J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).
  9. Andresson, O. S. Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus. Virology. 193, 89-105 (1993).
  10. Skraban, R. Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype. J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).
  11. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  12. Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity. Virology. 279, 116-129 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki splotu naczyni wkowego owcymikroskopia fluorescencyjnacytometria przep ywowatest miana wirusapomiar TCID50transfekcja plazmidowapropagacja wirusaefekty cytopatyczne

Powiązane artykuły