Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Podsumowanie

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Wirus Maedi-visna (MVV) jest lentiwirusem owiec, wywołującym powoli postępujące zapalenie śródmiąższowe płuc oraz zapalenie mózgu i rdzenia¹. Uważa się, że głównymi komórkami docelowymi MVV in vivo są komórki linii monocytów². Niektóre szczepy MVV mogą jednak replikować się w innych typach komórek^3,4. Zielone białko fluorescencyjne jest powszechnie stosowanym markerem do badania lentiwirusów w żywych komórkach. Wprowadziliśmy gen egfp do genu dUTPazy MVV. Gen dUTPazy jest dobrze zachowany w większości szczepów lentiwirusów owiec i kóz i wykazano jego istotną rolę w replikacji CAEV⁵. Wykazano jednak, że dUTPaza jest zbędna dla replikacji klonu molekularnego MVV użytego w niniejszym badaniu, zarówno in vitro, jak i in vivo⁶. Replikacja MVV jest ściśle ograniczona do komórek pochodzenia owczego lub koziego. Do transfekcji i propagacji wirusa wykorzystujemy pierwotną linię komórkową z splotu naczyniówkowego owiec (komórki SCP)⁷. Fluorescencyjny MVV jest w pełni zakaźny, a ekspresja EGFP pozostaje stabilna przez co najmniej 6 pasażów⁸. Istnieje dobra korelacja między pomiarami TCID₅₀ a EGFP. Wirus ten powinien być zatem przydatny do szybkiego wykrywania zainfekowanych komórek w badaniach tropizmu komórkowego i patogenności in vitro oraz in vivo⁸.

Protokół

1. Transfekcja

Klon molekularny znajduje się w dwóch plazmidach, p8XSp5-egfp i p67r, o wielkościach odpowiednio 12 kb i 4,5 kb.^9,10

1. Przetnij ekvimolarności ilości dwóch plazmidów, tj. 4,4 μg p8XSp5-egfp oraz 1,6 μg p67r za pomocą XbaI, a następnie przeprowadź ligację przed transfekcją.
2. Do ligacji użyj 1 jednostki Weissa ligazy w reakcji o objętości 50 μl i inkubuj przez noc w temperaturze 16°C.
3. Po zakończeniu ligacji inkubuj mieszaninę ligacyjną w temperaturze 65°C przez 15 min w celu inaktywacji ligazy. Ten krok można pominąć.
4. Na dwa dni przed transfekcją wysiej 10⁶ komórek SCP do kolby hodowlanej T25 i hoduj komórki przez dwa dni w 5 ml DMEM + 10% surowicy jagnięcej i 2mM glutaminy bez antybiotyków, aż do uzyskania monowarstwy o 90% konfluencji. Jeśli komórki nie osiągną 90% konfluencji po dwóch dniach, pozostaw je do wzrostu na jeden dodatkowy dzień.

Uwaga: Surowicę jagnięcą można zastąpić płodową surowicą bydlęcą (FBS). Rutynowo stosujemy surowicę jagnięcą, ponieważ niektóre szczepy MVV są hamowane przez FBS; ten szczep MVV nie jest jednak hamowany przez FBS.

5. Gdy komórki będą gotowe do transfekcji, należy wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicy (surowica jagnięca lub FBS) bez antybiotyków.
   Do transfekcji wykorzystujemy Lipofectamin 2000 (Invitrogen).
6. Rozcieńczyć DNA w 500μl pożywki Opti-MEM.
7. Rozcieńczyć 20μl Lipofectamin 2000 w 500μl pożywki Opti-MEM i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 5 min.
8. Po 5-minutowej inkubacji połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym Lipofectamine 2000 (objętość całkowita = 1000 μl). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 20-30 min w RT.
9. Dodać mieszaninę do transfekcji (1 ml) do kolby T25 zawierającej komórki SCP i pożywkę (5 ml). Wymieszać, delikatnie kołysząc kolbą.
10. Inkubować w 37°C i 5% CO₂ przez noc (18 – 24 h).
11. Następnego dnia wymienić pożywkę na DMEM z 1% surowicy, 2mM glutaminy, 100IU penicyliny i 100IU streptomycyny.
12. Monitorować produkcję GFP w komórkach SCP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W przypadku tych komórek pierwotnych można spodziewać się niskiej wydajności transfekcji, zazwyczaj na poziomie 5 – 15%.
13. Kontynuować inkubację w 37°C, 5% CO₂ przez kilka dni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa w kolbie. Pełna infekcja trwa zazwyczaj od 7 do 14 dni.
14. Zebrać wirusa, przenosząc supernatant do probówek Eppendorf. Wirować w mikrowirówce przy 3000 rpm przez 5 min w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść supernatant zawierający wirusa do nowych probówek. Przechowywać w -80°C.

2. Miareczkowanie wirusa

1. Zasiać 3x10⁴ komórek SCP w 100 μl pożywki DMEM uzupełnionej o 10% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO₂.
2. Jeśli następnego dnia komórki osiągną konfluencję, wymienić pożywkę na DMEM z 1% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny, wlewać po 100 μl do każdej studzienki.
3. Rozcieńczyć wirusa w następujący sposób:
   1. Do 4 x 10 studzienek w 96-dołkowej płytce z okrągłym lub V-kształtnym dnem dodać po 180 μl DMEM z 1% serum, 2mM glutaminy, 100IU/ml penicyliny i 100IU/ml streptomycyny na studzienkę.
   2. Aby przygotować seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne w czterech powtórzeniach, dodać 20 μl wirusa do każdej z 4 studzienek w pierwszej kolumnie płytki, a następnie, używając pipety czterokanałowej, pipetować w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek. Zmienić końcówki pipety i przenieść 20 μl do kolejnych 4 studzienek i tak dalej. Ostatnie studzienki pozostawić bez wirusa jako kontrolę negatywną.
4. Dodać 100 μl rozcieńczeń wirusa do komórek SCP i pożywki.
5. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Obserwować pod kątem fluorescencji GFP oraz efektów cytopatycznych przez dwa tygodnie.
   Efekty cytopatyczne objawiają się zaokrąglaniem komórek, które stają się mniej przezroczyste niż zdrowe komórki z wydłużonymi wypustkami, co kończy się pojawieniem się komórek wielojądrzastych i śmiercią komórkową.
6. Obliczyć miano wirusa (TCID50) metodą Reeda-Muencha¹¹.

3. Analiza FACS zakażonych komórek

Uwaga: W celu szybkiego monitorowania replikacji wirusa zainfekowane komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej.

1. Poddać zainfekowane komórki (ok. 10⁵) trypsynizacji, przemyć 1x w PBS i resuspendować w 500μl PBS.
2. Dodać 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu (stężenie końcowe 2%) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
3. Odwirować komórki w mikrowirówce przy 3000 rpm przez 5 min.
4. Przemyć PBS 2x przez 5 min i przeanalizować za pomocą analizatora FACScan. Zliczyć 10 000 zdarzeń.

4. Reprezentatywne wyniki:

Wirus ten powinien być w pełni zakaźny i namnażać się do miana 10⁶ – 10⁷ TCID₅₀/ml. Zainfekowane komórki wykazują fluorescencję i mogą być wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Zazwyczaj GFP można wykryć w ponad 60% komórek w zainfekowanych kulturach komórkowych przy użyciu cytometrii przepływowej (Ryc. 1). Podobnie, podczas wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, większość komórek wykazuje fluorescencję (Ryc. 2A i B).

Rysunek 1. Analiza FACScan komórek SCP zainfekowanych wirusem KV1772-egfp po 7 dniach od infekcji.

Rysunek 2. Mikroskopia kontrastowa komórek SCP zainfekowanych KV1772-egfp po 7 dniach inkubacji (A). Te same komórki obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (B).

Dyskusja

Przedstawiony tutaj ekspresujący GFP klon molekularny MVV powinien być użyteczny do analizowania interakcji z komórkami gospodarza oraz patogeniczności MVV zarówno in vitro, jak i in vivo. Wirus uzyskany po 7–14 dniach replikacji z pewnością nabył pewne mutacje ze względu na niedokładność odwrotnej transkryptazy. Istnieją jednak ograniczenia w stosowaniu tego klonu jako wektora jednocyklowego. Jednym z nich jest fakt, że użycie tego klonu ogranicza się do komórek pochodzenia owczego i koziego. Wydajność transfekcji tych ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	GIBCO, od Life Technologies	10938025
Opti-MEM	GIBCO, od Life Technologies	51985018
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019