Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatnich piętnastu lat powszechnie przyjęto pogląd, że błony komórkowe nie są homogeniczne i opierają swoje funkcje na mikrodomenach. Tratwy lipidowe to mikrodomeny błonowe wzbogacone w cholesterol i sfingolipidy. Odgrywają one rolę w fizjologicznych procesach komórkowych, takich jak sygnalizacja i transport1,2, ale uważa się również, że są kluczowymi elementami w przebiegu wielu chorób, w tym infekcji wirusowych lub bakteryjnych oraz chorób neurodegeneracyjnych3.
Jednak ich istnienie wciąż pozostaje kwestią sporną4,5. Rzeczywiście, wielkość tratw lipidowych szacuje się na około 20 nm6, co znajduje się znacznie poniżej granicy rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii (około 200 nm), uniemożliwiając tym samym ich bezpośrednie obrazowanie. Do tej pory głównymi technikami stosowanymi do oceny partycji białek zainteresowania wewnątrz tratw lipidowych były izolacja błon opornych na detergenty (DRMs) oraz współpatchowanie z przeciwciałami. Chociaż metody te są szeroko stosowane ze względu na stosunkowo łatwą implementację, były one podatne na artefakty, przez co spotykały się z krytyką7,8. Konieczne stało się zatem wprowadzenie ulepszeń technicznych, aby wyeliminować te artefakty i umożliwić badanie partycji tratw lipidowych w żywych komórkach.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę czułej analizy partycji białek lub lipidów znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta, nazywana spektroskopią korelacyjną fluorescencji (FCS), opiera się na różnicy w czasach dyfuzji sond fluorescencyjnych znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. W rzeczywistości, jak wykazano zarówno w błonach sztucznych, jak i w hodowlach komórkowych, sondy dyfundują znacznie szybciej poza gęstymi tratwami lipidowymi niż w ich wnętrzu9,10. Aby wyznaczyć czasy dyfuzji, przy użyciu mikroskopu konfokalnego mierzy się minimalne fluktuacje fluorescencji w funkcji czasu w objętości ogniskowej (około 1 femtolitra), zlokalizowanej w błonie plazmatycznej komórek (Ryc. 1). Na podstawie tych fluktuacji można następnie wykreślić krzywe autokorelacji i dopasować je do odpowiednich matematycznych modeli dyfuzji11.
Metoda FCS może być wykorzystana do określenia rozdziału różnych sond w tratwach lipidowych, pod warunkiem, że są one znakowane fluorescencyjnie. Znakowanie fluorescencyjne można osiągnąć poprzez ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych lub poprzez wiązanie ligandów fluorescencyjnych. Co więcej, FCS można stosować nie tylko w membranach sztucznych i liniach komórkowych, ale także w kulturach pierwotnych, jak opisano w niedawnej pracy12. Metoda ta może być również wykorzystana do śledzenia dynamiki rozdziału w tratwach lipidowych po dodaniu leku lub zmianie składu lipidowego błony12.
Protokół
1. Kalibracja układu FCS
- Uruchom mikroskop konfokalny, lasery, komputery oraz inkubator do kontroli temperatury i CO2.
- Upewnij się, że detektor SPAD (Single Photon Avalanche Diode) jest włączony, a filtr fluorescencyjny wewnątrz SPAD jest odpowiedni dla badanej próbki. Sprawdź, czy SPAD jest zsynchronizowany czasowo. Pamiętaj, aby uruchomić oprogramowanie do FCS dopiero po skonfigurowaniu ustawień SPAD do akwizycji.
- Przygotuj świeży roztwór toksyny cholerycznej z Alexa488 rozcieńczony w PBS do uzyskania stężenia 1 μg/ml (17.5 nM).
- Zoptymalizuj obrazowanie konfokalne roztworu, korzystając z wewnętrznej detekcji mikroskopu.
- Przełącz urządzenie w tryb skanowania punktowego i wybierz punkt w próbce roztworu. Upewnij się, że czas naświetlania laserem jest wystarczająco długi, aby przeprowadzić akwizycje FCS (> 5 minut).
- Przełącz się na detekcję zewnętrzną za pomocą SPAD oraz na oprogramowanie FCS. Monitoruj sygnał fluorescencji i upewnij się, że jest on odpowiedni dla detektora SPAD (sygnał wystarczający, ale bez nasycenia; zakres 10 000 do 50 000 counts/s jest prawidłowy). W razie potrzeby zmień pozycję z, wzmocnienie i/lub moc lasera, aby uzyskać poprawny sygnał fluorescencji.
- Wykonaj 10 serii pomiarów trwających 30 sekund każda. Czas akwizycji powinien być zoptymalizowany dla badanej próbki (kompromis między najlepszym próbkowaniem a problemem fotobielenia).
- Przeanalizuj dane (patrz krok 4), aby upewnić się, że krzywa autokorelacji odpowiada jednemu gatunkowi fluorescencyjnemu dyfundującemu w roztworze (równanie na Ryc. 2) oraz że czas dyfuzji uzyskany po dopasowaniu modelu jest poprawny (około 0.2 ms) (Ryc. 3).
2. Barwienie żywych komórek markerem tratw lipidowych
- Dzień przed obrazowaniem wysiać komórki HEK293 na płytki 8-dołkowe Labteks pokryte poli-L-lizyną (1mg/ml), aby zapewnić ich prawidłową adhezję. Należy użyć pożywki bez czerwieni fenolowej, aby uniknąć zakłóceń sygnału fluorescencyjnego.
- Przemyć komórki dwukrotnie za pomocą HBSS (zbuforowanego roztworu soli Hanksa).
- Do komórek dodać toksynę cholery-Alexa488 (1 μg/ml)/BSA (0,1 %) w 500 μl HBSS na 30 minut w temperaturze 37 °C. Toksyna cholery zwiąże się z gangliozydem GM1, który wykazuje preferencyjną lokalizację w tratwach lipidowych.
- Przemyć komórki dwukrotnie za pomocą HBSS (zbuforowanego roztworu soli Hanksa).
3. Pozyskiwanie danych FCS w żywych komórkach
- Umieść zabarwione komórki na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że temperatura i stężenie CO2 są optymalne, w przeciwnym razie może to prowadzić do powstania artefaktów w czasach dyfuzji.
- Zoptymalizuj obrazowanie konfokalne wybranej komórki, korzystając z wewnętrznej detekcji mikroskopu (Rys. 4).
- Przełącz urządzenie w tryb skanowania punktowego i wybierz punkt w błonie plazmatycznej badanej komórki. Wykonaj 1-2 obrazy żywej komórki, aby upewnić się, że nie przemieszcza się ona podczas akwizycji.
- Przełącz detekcję na zewnętrzną za pomocą SPAD oraz przejdź do oprogramowania FCS. Monitoruj sygnał fluorescencji i upewnij się, że jest on odpowiedni dla SPAD (wystarczający sygnał, ale bez nasycenia; przedział od 10 000 do 50 000 counts/s jest prawidłowy). W razie potrzeby zmień pozycję z, wzmocnienie i/lub moc lasera, aby uzyskać poprawny sygnał fluorescencji. Jeśli to nie wystarczy, można rozważyć zmianę warunków barwienia.
- Wykonaj 10 pomiarów trwających 30 sekund każdy. Ponieważ większość komórek wykazuje autofluorescencję, podczas pierwszych pomiarów może nastąpić spadek fluorescencji z powodu wygasania autofluorescencji.
4. Analiza danych FCS
- Ustaw przedział korelacji i wygeneruj krzywe autokorelacji za pomocą oprogramowania FCS. Przedział korelacji zazwyczaj obejmuje zakres od najkrótszego możliwego do rozdzielenia czasu opóźnienia do najdłuższego możliwego czasu (ponieważ statystyka pomiaru staje się coraz mniej adekwatna, gdy maksymalny czas korelacji zbliża się do całkowitego czasu akwizycji, w oprogramowaniu Picoquant maksymalny czas opóźnienia jest ograniczony do 80% czasu akwizycji).
- Dla każdej próbki wyeksportuj pliki odpowiadające fluktuacjom fluorescencji oraz autokorelacji w funkcji czasu.
- Użyj oprogramowania do analizy danych i dopasowywania krzywych, takiego jak Origin Pro, aby zaimportować pliki.
- W przypadku każdej próbki upewnij się, że podczas akwizycji nie występuje fotoblaknięcie, tzn. że fluorescencja pozostaje stabilna przez 30 sekund. Odrzuć każdy pomiar wykazujący fotoblaknięcie, ponieważ może to prowadzić do sztucznego wydłużenia czasów dyfuzji.
- Sprawdź, czy kształt pozostałych krzywych FCS jest prawidłowy (patrz Ryc. 5). Wyznacz średnią krzywą FCS.
- Dopasuj krzywą do odpowiedniego modelu matematycznego (Ryc. 2). Dopasowanie to pozwoli wyznaczyć czas(y) dyfuzji oraz proporcję cząsteczek dyfundujących z tymi czasami dyfuzji.
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład kalibracji FCS z użyciem roztworu toksyny cholerycznej znakowanej Alexa488 przedstawiono na Rysunku 3. Po sprawdzeniu, że poszczególne pomiary fluorescencji w funkcji czasu nie wykazały fotobleachingu (Rysunek 3A), obliczono indywidualne i średnie krzywe FCS. Średnie krzywe FCS dopasowano do równań odpowiadających różnym modelom dyfuzji (przykłady na Rysunku 2). Parametrem tradycyjnie uznawanym za wyznacznik jakości dopasowania jest współczynnik determinacji R2. Im bliżej 1 znajduje się wartość R2, tym lepsze jest dopasowanie. W tym przypadku modelem najdokładniej dopasowanym do średniej krzywej FCS jest model opisujący populację cząsteczek fluorescencyjnych dyfundujących swobodnie w trzech wymiarach (równanie 1 na Rysunku 2 i Rysunku 3B). Czas dyfuzji wynikający z dopasowania wynosi 0,32 ms. Reszty z dopasowania krzywej (Rysunek 3C) oraz współczynnik R2 (0,99906) pozwalają ocenić jakość dopasowania.
Przykład analizy FCS dla komórek HEK293 barwionych toksyną choleryczną znakowaną Alexa488 przedstawiono na rycinie 5. Wielofazowy kształt średniej krzywej FCS ujawnia istnienie populacji cząsteczek fluorescencyjnych o różnych czasach dyfuzji. Najlepsze dopasowanie dla tej krzywej odpowiada modelowi z trzema populacjami sond fluorescencyjnych: dwiema o utrudnionej dyfuzji (dyfuzja dwuwymiarowa w płaszczyźnie błony) oraz jedną dyfundującą swobodnie w trzech wymiarach (równanie 2 na rycinie 2 i rycinie 5). Ta ostatnia populacja odpowiada cząsteczkom fluorescencyjnym poruszającym się poza płaszczyzną błony, tj. wiążącym się lub odłączającym od celów błonowych, docierającym do błony poprzez szlak sekrecji lub recyklingu lub opuszczającym błonę w wyniku endocytozy. Dwa czasy dyfuzji w błonie, odpowiadające toksynie cholerycznej związanej z GM1, wynosiły 2 ms (25% cząsteczek), co odpowiada dyfuzji poza tratwami lipidowymi, oraz 75 ms (50% cząsteczek), co odpowiada dyfuzji w tratwach lipidowych. Należy pamiętać, że jakiekolwiek fotoblaknięcie podczas akwizycji doprowadzi do sztucznego wydłużenia czasów dyfuzji, co może stworzyć błąd w kierunku lokalizacji GM1 w domenach tratw lipidowych.
Rycina 1. Schematyczny rysunek układu FCS (rysunek zmodyfikowany z Marquer i wsp..12)
Rysunek 2. Przykład modeli dyfuzji i odpowiadających im równań wykorzystywanych do dopasowania krzywych autokorelacji. Parametr strukturalny S można zapisać jako S = z0/w0, gdzie z0 to efektywny promień ogniskowania wzdłuż osi optycznej przy natężeniu 1/e2, a w0 to efektywny boczny promień ogniskowania przy natężeniu 1/e2. Wartości te można wyznaczyć z pomiaru klasycznej funkcji rozproszenia punktu (PSF).
Rycina 3. Ocena czasu dyfuzji toksyny cholerycznej-Alexa488 w roztworze do kalibracji FCS. A) Fluktuacja fluorescencji jako funkcja czasu dla reprezentatywnego przykładu 30-sekundowej akwizycji. B) Średnia krzywa autokorelacji uzyskana z 10 próbek 30-sekundowej akwizycji, dopasowana do równania 1 (patrz Rycina 2). C) Residua z dopasowania krzywej.
Rycina 4. Komórka HEK-293 barwiona toksyną choleryczną-Alexa488. Obrazy komórek wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy) z wewnętrzną linią lasera 488nm. Fluorescencję zarejestrowano za pomocą obiektywu plan-apochromatycznego z imersją olejową x60 w zakresie od 500 do 650 nm.
Rycina 5. Ocena czasu dyfuzji toksyny cholerycznej-Alexa488 w błonie plazmatycznej komórek HEK293. A) Średnia krzywa autokorelacji dopasowana równaniem 2 (patrz Rycina 2). B) Residua z dopasowania krzywej. (zmodyfikowano na podstawie Marquer et al.12)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda FCS umożliwia czułą i szybką analizę partycji sond fluorescencyjnych w tratwach lipidowych w żywych komórkach. FCS łączy dokładność lokalizacji charakterystyczną dla mikroskopii konfokalnej z czułością zliczania pojedynczych fotonów. Główną różnicą między FCS a standardowymi technikami biochemicznymi jest to, że FCS pozwala na bezwzględne oznaczenie partycji celu w tratwach lipidowych, a nie partycji względnej, co ma miejsce w przypadku izolacji DRM lub co-patchingu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Jesteśmy również wdzięczni Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) za wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podjednostka B toksyny cholerowej-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Mikroskop konfokalny | Leica Microsystems | SP5 | |
| Inkubator z kontrolą temperatury i CO2 | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices | seria PDM (100 µm powierzchni czułej) | |
| Filtr górnoprzepustowy 488 nm | Semrock | Filtr długoprzepustowy BrightLine z krawędzią blokującą 488 nm, nr katalogowy FF01-488/LP-25 | |
| Jednostka detekcyjna FCS | Picoquant | Moduł Picoharp 300 | |
| Oprogramowanie do akwizycji i autokorelacji | Picoquant | SymPhoTime | |
| Oprogramowanie do dopasowania danych | OriginLab | OriginPro8 |
Bibliografia
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
