Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Podsumowanie

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Streszczenie

Test adhezji z użyciem mikropipety został opracowany w 1998 roku w celu pomiaru kinetyki dwuwymiarowego (2D) wiązania receptor-ligand¹. W teście tym ludzki erytrocyt (RBC) służy jako sensor adhezji oraz komórka prezentująca jedną z oddziałujących cząsteczek. Metoda wykorzystuje mikromanipulację, aby doprowadzić erytrocyt do kontaktu z inną komórką wykazującą obecność drugiej oddziałującej cząsteczki, przy precyzyjnie kontrolowanej powierzchni i czasie kontaktu w celu umożliwienia powstania wiązań. Zdarzenie adhezyjne jest wykrywane jako elongacja erytrocyta podczas rozdzielania obu komórek. Poprzez kontrolę gęstości ligandów unieruchomionych na powierzchni erytrocyta, prawdopodobieństwo adhezji utrzymuje się w zakresie średnim między 0 a 1. Prawdopodobieństwo adhezji szacuje się na podstawie częstotliwości zdarzeń adhezyjnych w serii powtarzalnych cykli kontaktu między dwiema komórkami dla danego czasu kontaktu. Zmieniając czas kontaktu, otrzymuje się krzywą wiązania. Dopasowanie probabilistycznego modelu kinetyki reakcji receptor-ligand¹ do krzywej wiązania pozwala wyznaczyć powinowactwo 2D oraz stałą dysocjacji (off-rate).

Metodę analizy zwalidowano, badając oddziaływania receptorów Fcγ z Fc^1-6 IgG, selektyn z ligandami glikokonjugatami^6-9, integryn z ligandami^10-13, wiązania homotypowe kadheryn¹⁴ oraz receptora i koreceptora limfocytów T z kompleksami peptyd-główny układ zgodności tkankowej^15-19.

Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia regulacji kinetyki 2D przez czynniki biofizyczne, takie jak mikrotopografia błony⁵, kotwiczenie w błonie², orientacja i długość cząsteczek⁶, sztywność nośnika⁹, krzywizna²⁰ oraz siła uderzenia²⁰, a także czynniki biochemiczne, takie jak modulatory cytoszkieletu i mikrośrodowiska błony, w którym znajdują się oddziałujące cząsteczki, oraz organizacja powierzchniowa tych cząsteczek^15,17,19.

Metodę tę wykorzystano również do badania jednoczesnego wiązania podwójnych gatunków receptor-ligand^3,4 oraz oddziaływań trimolekularnych¹⁹ z zastosowaniem zmodyfikowanego modelu²¹.

Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na badanie receptorów w ich naturalnym środowisku błonowym. Wyniki mogą znacznie różnić się od tych uzyskanych z wykorzystaniem oczyszczonych receptorów¹⁷. Metoda ta umożliwia również badanie oddziaływań receptor-ligand w skali subsekundowej, z rozdzielczością czasową znacznie wyższą niż w przypadku typowych metod biochemicznych.

Aby zilustrować metodę pomiaru częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety, przedstawiamy pomiar kinetyki wiązania cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 (ICAM-1) unieruchomionej na erytrocytach (RBCs) z integryną α_Lβ₂ na neutrofilach, przy obecności dimerycznej E-selektyny w roztworze w celu aktywacji α_Lβ₂.

Protokół

1. Izolacja RBC z krwi pełnej

1. Przygotuj roztwory EAS-45. Odważ wszystkie składniki wymienione w Tabeli I i rozpuść je w 100-200ml wody DI. Dolej wodę do uzyskania 1000ml roztworu i dostosuj pH do wartości 8.0. Przefiltruj i rozdziel na alikwoty po 50ml. Przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20°C.

Uwaga: Krok 1.2 powinien być wykonany przez przeszkolonego specjalistę medycznego, na przykład pielęgniarkę, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board).

2. Pobrać 3-5ml krwi z żyły łokciowej do probówki 10ml zawierającej EDTA, a następnie natychmiast i dokładnie wymieszać krew z EDTA, aby zapobiec krzepnięciu.
3. Przetworzyć próbkę krwi tak szybko, jak to możliwe. Wszystkie poniższe kroki, z wyjątkiem wirowania, powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności preparatu. Przenieść krew do probówki wirówkowej 50ml, dodać 10ml zimnego i sterylnego Histopaque 1077 i wirować przez 5min przy 1000rpm w temperaturze 4°C. Powtórzyć dwukrotnie.
4. Dodać 10ml zimnego i sterylnego PBS, wirować przez 5min przy 1000rpm w temperaturze 4°C. Usunąć nadsącz. Powtórzyć 4 razy (łącznie 5 razy).
5. Przepłukać sterylnym EAS-45 (5min przy 1000rpm, 4°C) dwukrotnie. Podczas ostatniego płukania przenieść RBC do nowej sterylnej probówki 15ml.
6. Resuspendować RBC w 10ml EAS-45.

2. Biotynylacja RBC

1. Wziąć probówkę z RBC z kroku 1. Usunąć cały supernatant po wirowaniu przez 5min @ 1000rpm, 4°C. Przenieść 10μl osadu RBC do każdej z kilku fiolek i dodać odpowiednią ilość PBS do każdej fiolki (patrz Table II w celu uzyskania przykładu przygotowania sześciu różnych stężeń biotynylacji RBC).
2. Przygotować świeże rozcieńczenia Biotin-X-NHS/DMF 1:10 oraz 1:100 zgodnie z Table II.
3. Dodać 10μl 0,1M buforu boranowego do każdej fiolki.
4. Dodać obliczoną ilość roztworu biotyny do każdej fiolki (patrz Table II jako przykład) i natychmiast wymieszać w wortexie.
5. Umieścić każdą fiolkę z RBC w 50ml probówce stożkowej i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze pokojowej.
6. Przemyć każdą fiolkę 3 razy 800μl EAS-45, wirując przez 2min @ 2000rpm.
7. Dodać 100μl EAS-45 do każdej fiolki i przechowywać w 4°C. W każdym 1μl końcowego roztworu powinno znajdować się obecnie ˜1mln RBC.

3. Funkcjonalizacja ligandów sprzężonych z biotyną* na RBC

1. Przygotować roztwór streptavidyny o stężeniu 2mg/ml zgodnie z instrukcjami producenta. Alikwoty roztworu można przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Zmieszać taką samą ilość RBC z etapu 2.7 (10μl) z roztworem streptavidyny, natychmiast wymieszać w wortexie i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze 4°C.
3. Przemyć 3 razy 500μl EAS-45 przez 2min przy 2000rpm. Dodać 15μl EAS-45/ 1% BSA do przechowywania.
4. Zmieszać taką samą ilość RBC z etapu 3.3 (10μl) z roztworem ligandu o stężeniu 20μg/ml, natychmiast wymieszać w wortexie i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć dwa razy 500μl EAS-45/ 1% BSA przez 2min przy 2000rpm. Dodać 15μl EAS-45/1% BSA do przechowywania.

*Jeśli Twoje białko nie posiada wiązania z biotyną, możesz użyć jednego z dostępnych komercyjnie zestawów do biotinylacji białek (na przykład Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit) lub wykorzystać biotynilowane przeciwciała wychwytujące jako etap pośredni, tak jak pokazano w filmie.

4. Ilościowe oznaczenie gęstości receptorów i ligandów

1. Inkubować RBC pokryte ligandem z kroku 3 oraz, w oddzielnej probówce, komórki posiadające receptory z nasycającymi stężeniami odpowiednich mAbs przez 30 min w temperaturze pokojowej. W osobnych probówkach inkubować komórki z nieistotnymi przeciwciałami zgodnymi pod względem izotypu w celu kontroli. Jeśli przeciwciała pierwotne nie są znakowane fluorescencyjnie, inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami wtórnymi zgodnie z instrukcją producenta.
2. Analizować próbki przygotowane w kroku 4.1 metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem odpowiednich fluorescencyjnych kulek kalibracyjnych. Obliczyć gęstości zgodnie z rys. 1.

5. Przygotowanie mikropipety i komory komórkowej

1. Wyciągnij mikropipety z rurek kapilarnych, używając poziomego wyciągacza szklanych mikroelektrod PN-30 firmy Narishige lub wyciągacza mikropipet firmy Sutter Instruments.
2. Użyj mikromanipulatora z mikrokuźnią, aby dopasować końcówkę wyciągniętej mikropipety do pożądanej wielkości (zazwyczaj wymagana średnica wynosi od 1-5μm, w zależności od wielkości komórek wykorzystywanych w badaniu).
3. Przygotuj komorę komórkową, wycinając szkło cover glass do mikroskopu o pożądanym rozmiarze. Uszczelnij komorę z obu stron za pomocą oleju mineralnego, aby zapobiec odparowywaniu medium i zmianie osmolarności podczas eksperymentu.
4. Wprowadź do komory komórki z receptorami oraz ligandami.

6. Test częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety

1. Odessać oddziałujące komórki za pomocą odpowiednich pipet i użyć zaprogramowanego komputerowo przetwornika piezoelektrycznego, aby doprowadzić do kontaktu i rozdzielenia RBC z drugą komórką przy kontrolowanej powierzchni i czasie kontaktu. Wykryć zdarzenia adhezji, obserwując wydłużenie RBC podczas rozdzielania komórek.
2. Powtórzyć cykl kontaktu i retrakcji 50-100 razy dla danego czasu kontaktu. Odnotować zaobserwowane zdarzenia adhezji, wpisując „1” w przypadku adhezji lub „0” w przypadku braku adhezji w kolumnie arkusza kalkulacyjnego Excel. Do zapisu obrazów mikroskopowych można użyć urządzenia rejestrującego, np. nośnika cyfrowego lub taśmy wideo.
3. Zarejestrować krzywą częstotliwości adhezji w funkcji czasu kontaktu, wykorzystując co najmniej trzy różne pary komórek dla każdego czasu kontaktu, aby uzyskać średnią i SEM.
4. Zarejestrować krzywą wiązania niespecyficznego dla grupy kontrolnej, używając RBC pokrytych nieistotnymi ligandami (np. BSA) i/lub blokując ligandy lub receptory za pomocą specyficznych funkcjonalnych przeciwciał blokujących (mAbs). Specyficzną częstotliwość adhezji dla każdego punktu czasowego kontaktu można obliczyć poprzez odjęcie częstotliwości adhezji niespecyficznej¹.

7. Analiza danych

1. Dopasuj dane dotyczące swoistej częstotliwości adhezji P_a w funkcji czasu kontaktu t do modelu probabilistycznego (Równanie 1), który opisuje jednokrokową interakcję między jednym gatunkiem receptorów a jednym gatunkiem ligandów, z reakcją bezpośrednią drugiego rzędu i reakcją odwrotną pierwszego rzędu¹:
   
   gdzie K_a jest dwuwymiarowym (2D) efektywnym powinowactwem wiązania, k_off jest stałą szybkości dysocjacji, m_r oraz m_l to odpowiednio gęstości receptorów i ligandów zmierzone w kroku 4, a A_c to powierzchnia kontaktu. Dopasowanie krzywej posiada dwa parametry, A_cK_a oraz k_off, ponieważ A_c i K_a są łączone w jeden parametr określany wspólnie jako efektywne powinowactwo 2D. Iloczyn tego parametru i stałej szybkości dysocjacji stanowi efektywną stałą szybkości asocjacji 2D: A_ck_on = A_cK_a x k_off.
   Swoistą częstotliwość adhezji P_a oblicza się poprzez odjęcie frakcji adhezji nieswoistej (P_nonspecific) od całkowitej zmierzonej adhezji (P_measured)^1,21:
   

8. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 Wyznaczanie gęstości rozmieszczenia integryny α_Lβ₂ na neutrofilach. Neutrofile inkubowano najpierw z 1μg/ml E-selectin-Ig przez 10min, aby dopasować do warunków eksperymentalnych stosowanych na Rysunkach 3 i 4, lub bez E-selectin-Ig, a następnie z saturującymi stężeniami (10μg/ml) przeciwciała mAb anty-CD11a przeciwko ludzkim antygenom sprzężonego z PE (Klon HI111, patrz Tabela specyficznych odczynników i sprzętu) lub nieistotnego IgG1 mysiego w celu kontroli, po czym komórki przemyto i natychmiast poddano analizie. Próbki odczytano na cytometrze przepływowym BD LSR z zastosowaniem standardowych kulek kalibracyjnych QuantiBRITE PE. Panel A przedstawia histogramy fluorescencji kulek kalibracyjnych (kolor różowy) wraz z histogramami komórek traktowanych E-selectin-Ig (kolor niebieski) lub nietraktowanych (kolor zielony). Specyficzne barwienie mAb CD11a pokazano liniami ciągłymi, a barwienie przeciwciałem kontrolnym o dopasowanym izotypie liniami przerywanymi. Traktowanie komórek E-selectin-Ig (obecność we wszystkich etapach płukania oraz w buforze FACS) nie wpłynęło na gęstość CD11a, co wynika z porównania z komórkami nietraktowanymi. Panel B przedstawia proces ilościowego wyznaczania gęstości. Obliczono Log10 dla średniej intensywności fluorescencji (FI) dla każdej wartości szczytowej czterech histogramów kulek kalibracyjnych z Panelu A (różowe kółka) oraz dla specyficznej dla partii liczby cząsteczek PE na kulkę (według producenta). Wykreślono regresję liniową Log10 cząsteczek PE na kulkę względem Log10 fluorescencji. Dla komórek traktowanych E-selectin wartości Log10 FI (y) wyniosły odpowiednio 3,99 (niebieskie pełne kółko) dla specyficznego mAb oraz 2,23 (niebieskie puste kółko) dla przeciwciała kontrolnego. Rozwiązano równanie liniowe dla x (wartości naniesiono jako zielone i niebieskie kółka na Panelu B). x = Log10 PE/komórka i, ponieważ stosunek PE:mAb wynosił 1:1, całkowitą liczbę α_Lβ₂ na neutrofilach obliczono jako 9587. Gęstość powierzchniową obliczono na 43 cząsteczki/μm², przyjmując średnicę neutrofila równą 8,4μm²². Gęstość ICAM-1 zmierzono analogicznie metodą cytometrii przepływowej z użyciem PE-anty-ludzkiego mAb CD54, co dało wynik 65 mol/μm².

Rycina 2 Schematy systemu mikropipetowego. Nasz system mikropipetowy został zbudowany wewnętrznie i składa się z trzech podsystemów: podsystemu obrazowania, który umożliwia obserwację, rejestrację i analizę ruchów komórki wciągniętej do mikropipety; podsystemu mikromanipulacyjnego, pozwalającego na wybór komórek z komory komórkowej, oraz podsystemu ciśnienia, służącego do aspiracji komórek do mikropipet. Centralnym elementem podsystemu obrazowania jest mikroskop odwrócony (Olympus IMT-2 IMT2) z obiektywem imersyjnym 100x o aperturze numerycznej 1.25 N.A. Obraz jest przesyłany do magnetowidza za pomocą kamery CCD (charge couple device). Do systemu dołączono timer wideo w celu śledzenia czasu. Każda mikropipeta może być sterowana za pomocą napędu mechanicznego zamontowanego na mikroskopie i precyzyjnie pozycjonowana trójośowym hydraulicznym mikromanipulatorem. Można również zastosować manipulatory mechaniczne firmy Newport. Jeden z uchwytów mikropipety zamontowano na translatorze piezoelektrycznym, którego sterownik jest kontrolowany przez kod LabView w komputerze (dostępny na żądanie), a sygnał przesyłany jest przez kartę DAQ za pomocą wzmacniacza napięcia (własnej konstrukcji) do siłownika piezoelektrycznego. Pozwala to na precyzyjne i powtarzalne przemieszczanie pipety w cyklu testu adhezji. Podsystem regulacji ciśnienia służy do kontrolowania ssania podczas eksperymentu. Linia hydrauliczna łączy uchwyt mikropipety z rezerwuarem cieczy. Precyzyjny pozycjoner mechaniczny pozwala na dokładną manipulację wysokością rezerwuaru.

Mikropipety wytwarza się przy użyciu kapilar z borokrzemianowego szkła o niskiej temperaturze topnienia KIMAX (o średnicy zewnętrznej 1,0±0,07 mm i średnicy wewnętrznej 0,7±0,07 mm). W pierwszej kolejności mikropipety z rurek kapilarnych są wyciągane za pomocą poziomego wyciągacza szklanych mikroelektrod PN-30 Narishige (inną opcją jest wyciągacz mikropipet Sutter Instruments). Następnie do przycięcia mikropipet do pożądanej średnicy otworu wykorzystuje się system Microforge (budowany wewnętrznie). Dostępne są również komercyjne modele systemów Microforge.

Aby uniknąć drgań mikropipet podczas eksperymentu, mikroskop wraz z mikromanipulatorami umieszczono na stole pneumatycznym.

Rycina 3 Bieżąca częstotliwość adhezji F_i dla wiązania specyficznego (A) i niespecyficznego (B) przy czasie kontaktu 1s (czerwony) i 10s (niebieski), zmierzona w powtórzonych cyklach testów adhezji między RBC powlekanymi ICAM-1 (A) lub hIgG (B) a ludzkimi neutrofilami wykazującymi ekspresję integryny α_Lβ₂. F_i = (X₁ + X₂ +…+ X_i)/i (1 ≤i ≤ n), gdzie i jest indeksem cyklu testowego, a X_i przyjmuje wartość „1” (adhezja) lub „0” (brak adhezji). F_n (n=50) posłużyło jako najlepsza ocena prawdopodobieństwa adhezji.

Rycina 4 Kinetyka wiązania ICAM-1 z integryną α_Lβ₂ neutrofili (). Prawdopodobieństwo adhezji, zmierzone zgodnie z procedurą przedstawioną na Rycini 3 dla trzech par komórek w każdym czasie kontaktu, zostało uśrednione i naniesione na wykres w funkcji czasu kontaktu. Medium w komorze stanowiło HBSS z dodatkiem 1mM Ca²⁺ i 1mM Mg²⁺ oraz 1μg/ml dimerycznej E-selectin-Ig w celu zwiększenia wiązania α_Lβ₂. Aby uchwycić ICAM-1-Ig na erytrocytach (RBCs), po etapie inkubacji ze streptawidyną dodano krok pośredni polegający na inkubacji RBCs z 10μg/ml przeciwciałem wychwytującym (biotynilowane przeciwciało kozie anty-ludzkie Fc, eBioscience). W celu kontroli wiązania nieswoistego zastosowano dwa różne warunki: 1) RBCs powleczone przeciwciałem wychwytującym anty-human-Fc i inkubowane z ludzkim IgG zamiast ICAM-1-Ig (O) oraz 2) neutrofile wiążące się z RBCs niepowleczonymi przeciwciałem wychwytującym (Δ). Do medium dodano 10μg/ml ludzkiego IgG, aby zminimalizować wiązanie E-selectin-Ig z roztworu z przeciwciałem wychwytującym na powierzchni RBCs. Wiązanie nieswoiste, zapisane jako krzywa kontrolna dla ludzkiego IgG, posłużyło do wyznaczenia krzywej specyficznego prawdopodobieństwa adhezji () przy użyciu równania 2. Dopasowanie krzywej specyficznego prawdopodobieństwa adhezji za pomocą równania 1 (linia ciągła) pozwoliło wyznaczyć efektywną powinowactwo wiązania A_cK_a = 1.4•10^-4 μm4 oraz k_off = 0.3 s^-1.

Odczynnik	MW (g/mol)	Stężenie (mM)	Ilość (g)
Adenina	135.13	2	0.27
D-glukoza (dekstroza)	180.16	110	19.82
D-mannitol	182.17	55	10.02
Chlorek sodu (NaCl)	58.44	50	2.92
Fosforan sodu, zasadowy (Na HPO )	141.95	20	2.84
L-glutamina	146.15	10	1.46

Tabela 1. Przygotowanie buforu EAS-45 (1L).

25 mg biotyny-XHS w 550 μl DMF	0,1M roztwór biotyny
roztwór 0,1 biotyny w DMF rozcieńczony 1:10	0,01M roztwór biotyny
roztwór 0,1 biotyny w DMF rozcieńczony 1:100	0,001M roztwór biotyny

Tabela 2. Przygotowanie roztworu biotyny.

końcowe stężenie biotyny (μM)	4	10	20	50	100	160
roztwór zapasu osadu RBC (μl)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (μl)	179.2	178	176	179	178	176.8
bufor boranowy 0.1M (μl)	10	10	10	10	10	10
roztwór biotyny 0.01M (μl)				1	2	3.2
roztwór biotyny 0.001M (μl)	0.8	2	4

Tabela 3. Biotynilacja RBC.

Dyskusja

Aby skutecznie przeprowadzić test częstotliwości adhezji z użyciem mikropipety, należy uwzględnić kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, należy upewnić się, że zarejestrowano specyficzną interakcję dla badanego układu receptor-ligand. Pomiary kontrolne niespecyficzne (por. Ryc. 3, 4) zapewniają specyficzność badania. W idealnym przypadku prawdopodobieństwa niespecyficznej adhezji powinny być niższe niż 0,05 dla wszystkich przedziałów czasu kontaktu, a różnica między prawdopodobieństwami adhezji specyficznej i niespecyfic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Rozcieńczyć do 1x wodą dejonizowaną przed użyciem
Vacutainer EDTA	BD Biosciences	366643	izolacja RBC
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	izolacja RBC
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	przygotowanie EAS-45
D-glukoza (dekstroza)	Sigma-Aldrich	G7528	przygotowanie EAS-45
D-mannitol	Sigma-Aldrich	6360	przygotowanie EAS-45
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	przygotowanie EAS-45
Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na₂HPO₄)	Fisher Scientific	S374	przygotowanie EAS-45
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G5763	przygotowanie EAS-45
Biotyna-X-NHS	Calbiochem	203188	biotynylacja RBC
Dimetyloformamid (DMF)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20673	biotynylacja RBC
Bufor boratowy (0,1M)	Electron Microscopy Sciences	11455-90	biotynylacja RBC
Streptawidyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21125	funkcjonalizacja ligandu
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	funkcjonalizacja ligandu
Kuleczki Quantibrite PE	BD Biosciences	340495	ilościowe oznaczenie gęstości
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	BD LSR II	ilościowe oznaczenie gęstości
Kapilara 0,7-1,0mm x 30"	Kimble Chase	46485-1	wyciąganie mikropipety
Olej mineralny	Fisher Scientific	BP2629-1	montaż komory
Szkiełko cover glass do mikroskopu	Fisher Scientific	12-544-G	montaż komory
PE α-ludzki CD11a Klon HI 111	eBioscience	12-0119-71	Odczynnik do Rys. 1
PE anty-ludzki CD54	eBioscience	12-0549	Odczynnik do Rys. 1
Kontrola izotypowa mysia IgG1 PE	eBioscience	12-4714	Odczynnik do Rys. 1
hydrauliczny mikromanipulator	Narishige International	MO-303	system mikropipety
Manipulator mechaniczny	Newport Corp.	461-xyz-m, SM-13, DM-13	system mikropipety
translatory piez–elektryczny	Physik Instruments	P-840	system mikropipety
LabVIEW	National Instruments	Wersja 8.6	system mikropipety
Karta DAQ	National Instruments	USB-6008	system mikropipety
Stół optyczny	Kinetic Systems	Seria 5200	system mikropipety