Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test adhezji z użyciem mikropipety został opracowany w 1998 roku w celu pomiaru kinetyki dwuwymiarowego (2D) wiązania receptor-ligand1. W teście tym ludzki erytrocyt (RBC) służy jako sensor adhezji oraz komórka prezentująca jedną z oddziałujących cząsteczek. Metoda wykorzystuje mikromanipulację, aby doprowadzić erytrocyt do kontaktu z inną komórką wykazującą obecność drugiej oddziałującej cząsteczki, przy precyzyjnie kontrolowanej powierzchni i czasie kontaktu w celu umożliwienia powstania wiązań. Zdarzenie adhezyjne jest wykrywane jako elongacja erytrocyta podczas rozdzielania obu komórek. Poprzez kontrolę gęstości ligandów unieruchomionych na powierzchni erytrocyta, prawdopodobieństwo adhezji utrzymuje się w zakresie średnim między 0 a 1. Prawdopodobieństwo adhezji szacuje się na podstawie częstotliwości zdarzeń adhezyjnych w serii powtarzalnych cykli kontaktu między dwiema komórkami dla danego czasu kontaktu. Zmieniając czas kontaktu, otrzymuje się krzywą wiązania. Dopasowanie probabilistycznego modelu kinetyki reakcji receptor-ligand1 do krzywej wiązania pozwala wyznaczyć powinowactwo 2D oraz stałą dysocjacji (off-rate).
Metodę analizy zwalidowano, badając oddziaływania receptorów Fcγ z Fc1-6 IgG, selektyn z ligandami glikokonjugatami6-9, integryn z ligandami10-13, wiązania homotypowe kadheryn14 oraz receptora i koreceptora limfocytów T z kompleksami peptyd-główny układ zgodności tkankowej15-19.
Metodę tę wykorzystano do ilościowego określenia regulacji kinetyki 2D przez czynniki biofizyczne, takie jak mikrotopografia błony5, kotwiczenie w błonie2, orientacja i długość cząsteczek6, sztywność nośnika9, krzywizna20 oraz siła uderzenia20, a także czynniki biochemiczne, takie jak modulatory cytoszkieletu i mikrośrodowiska błony, w którym znajdują się oddziałujące cząsteczki, oraz organizacja powierzchniowa tych cząsteczek15,17,19.
Metodę tę wykorzystano również do badania jednoczesnego wiązania podwójnych gatunków receptor-ligand3,4 oraz oddziaływań trimolekularnych19 z zastosowaniem zmodyfikowanego modelu21.
Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na badanie receptorów w ich naturalnym środowisku błonowym. Wyniki mogą znacznie różnić się od tych uzyskanych z wykorzystaniem oczyszczonych receptorów17. Metoda ta umożliwia również badanie oddziaływań receptor-ligand w skali subsekundowej, z rozdzielczością czasową znacznie wyższą niż w przypadku typowych metod biochemicznych.
Aby zilustrować metodę pomiaru częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety, przedstawiamy pomiar kinetyki wiązania cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 (ICAM-1) unieruchomionej na erytrocytach (RBCs) z integryną αLβ2 na neutrofilach, przy obecności dimerycznej E-selektyny w roztworze w celu aktywacji αLβ2.
Protokół
1. Izolacja erytrocytów z krwi pełnej
- Przygotować roztwory EAS-45. Odważyć wszystkie składniki wymienione w Tabeli I i rozpuścić je w 100–200 ml wody DI. Dopełnić wodą do objętości 1000 ml i dostosować pH do wartości 8,0. Przefiltrować i rozdzielić na aliquoty po 50 ml. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C.
Uwaga: Krok 1.2 powinien być wykonany przez wykwalifikowany personel medyczny, np. pielęgniarkę, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board).
- Pobrać 3-5ml krwi z żylnej너지 błony łokciowej do probówki 10ml zawierającej EDTA, a następnie natychmiast i dokładnie wymieszać krew z EDTA, aby zapobiec krzepnięciu.
- Przetworzyć próbkę krwi tak szybko, jak to możliwe. Wszystkie poniższe kroki, z wyjątkiem wirowania, powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności preparatu. Przenieść krew do probówki wirówkowej 50ml, dodać 10ml zimnego i sterylnego Histopaque 1077 i wirować przez 5min @ 1000rpm w temperaturze 4°C. Powtórzyć dwukrotnie.
- Dodać 10ml zimnego i sterylnego PBS, wirować przez 5min @ 1000rpm w temperaturze 4°C. Odpiłować supernatant. Powtórzyć 4 razy (łącznie 5 razy).
- Przemyć sterylnym EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4°C) dwukrotnie. Podczas ostatniego płukania przenieść RBC do nowej sterylnej probówki 15ml.
- Resuspendować RBC w 10ml EAS-45.
2. Biotynylacja RBC
- Należy wziąć probówkę z RBC z kroku 1. Po wirowaniu przez 5min @ 1000rpm w temperaturze 4°C należy usunąć cały nadosad. Do każdej z kilku fiolek należy przenieść 10μl osadu RBC i dodać do każdej odpowiednią ilość PBS (przykład przygotowania sześciu różnych stężeń biotynilacji RBC znajduje się w Tabeli II).
- Należy przygotować świeże rozcieńczenia Biotin-X-NHS/DMF 1:10 oraz 1:100 zgodnie z Tabelą II.
- Do każdej fiolki należy dodać 10μl 0,1M buforu boranowego.
- Do każdej fiolki należy dodać obliczoną ilość roztworu biotyny (przykład w Tabeli II) i natychmiast wymieszać na wirówce vortex.
- Każdą fiolkę z RBC należy umieścić w 50ml probówce stożkowej i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze pokojowej.
- Każdą fiolkę należy przemyć 3 razy 800μl EAS-45, wirując przez 2min @ 2000rpm.
- Do każdej fiolki należy dodać 100μl EAS-45 i przechowywać w temperaturze 4°C. W każdym 1μl końcowego roztworu powinno znajdować się obecnie ok. 1mln RBC.
3. Funkcjonalizacja ligandów sprzężonych z biotyną* na RBC
- Przygotować roztwór streptawidyny o stężeniu 2mg/ml zgodnie z instrukcją producenta. Alikwoty roztworu można przechowywać w temperaturze -20°C.
- Wymieszać równą ilość RBC z kroku 2.7 (10μl) z roztworem streptawidyny, natychmiast wymieszać na wortexie i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze 4°C.
- Przemyć 3 razy 500μl EAS-45 przez 2min przy 2000rpm. Dodać 15μl EAS-45/ 1% BSA do przechowywania.
- Wymieszać równą ilość RBC z kroku 3.3 (10μl) z roztworem ligandu o stężeniu 20μg/ml, natychmiast wymieszać na wortexie i inkubować na rotatorze przez 30min w temperaturze pokojowej.
- Przemyć dwa razy 500μl EAS-45/ 1% BSA przez 2min przy 2000rpm. Dodać 15μl EAS-45/1% BSA do przechowywania.
*Jeśli Twoje białko nie posiada wiązania z biotyną, możesz użyć jednego z dostępnych komercyjnie zestawów do biotynylacji białek (na przykład Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit) lub wykorzystać biotynilowane przeciwciała wychwytujące jako etap pośredni, zgodnie z instrukcją pokazaną w filmie.
4. Ilościowe oznaczenie gęstości receptorów i ligandów
- Inkubować RBC pokryte ligandem z kroku 3 oraz, w oddzielnej probówce, komórki posiadające receptory z nasycającymi stężeniami odpowiednich mAbs przez 30min w temperaturze pokojowej. W osobnych probówkach inkubować komórki z nieistotnymi przeciwciałami dopasowanymi izotypowo w celu kontroli. Jeśli przeciwciała pierwotne nie są znakowane fluorescencyjnie, inkubować z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoresceincją zgodnie z instrukcjami producenta.
- Próbki przygotowane w kroku 4.1 analizować za pomocą cytometrii przepływowej z odpowiednimi fluorescencyjnymi kuleczkami kalibracyjnymi. Obliczyć gęstości zgodnie z rys. 1.
5. Przygotowanie mikropipety i komory komórkowej
- Wyciągnij mikropipety z rurek kapilarnych, używając poziomego wyciągacza szklanych mikroelektrod Narishige PN-30 lub wyciągacza mikropipet Sutter Instruments.
- Użyj mikromanipulatora z mikrokuźnią, aby dostosować końcówkę wyciągniętej mikropipety do pożądanego rozmiaru (zazwyczaj wymagana średnica wynosi od 1-5μm, w zależności od wielkości komórek wykorzystywanych w badaniu).
- Przygotuj komorę komórkową, docinając szkiełko podstawowe do mikroskopu do pożądanego rozmiaru. Uszczelnij komorę z obu stron za pomocą oleju mineralnego, aby zapobiec odparowywaniu medium i zmianie osmolarności podczas eksperymentu.
- Wprowadź do komory komórki zawierające receptory oraz ligandy.
6. Analiza częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety
- Odessać oddziałujące komórki za pomocą odpowiednich pipet i wykorzystać sterowany komputerowo przetwornik piezoelektryczny, aby wprowadzać erytrocyty (RBC) w kontakt z drugą komórką i oddalać je od niej, kontrolując powierzchnię oraz czas kontaktu. Zdarzenia adhezji wykrywać poprzez obserwację elongacji RBC podczas rozdzielania komórek.
- Powtórzyć cykl kontaktu i retrakcji 50–100 razy dla danego czasu kontaktu. Rejestrować zaobserwowane zdarzenia adhezji, wpisując „1” w przypadku wystąpienia adhezji lub „0” w przypadku braku adhezji w kolumnie arkusza kalkulacyjnego Excel. Do zapisu obrazów mikroskopowych można użyć urządzenia rejestrującego, np. nośnika cyfrowego lub taśmy wideo.
- Wyznaczyć krzywą częstotliwości adhezji w zależności od czasu kontaktu, wykorzystując co najmniej trzy różne pary komórek dla każdego czasu kontaktu, aby uzyskać średnią oraz błąd standardowy średniej (SEM).
- Wyznaczyć krzywą wiązania niespecyficznego dla kontroli, wykorzystując RBC pokryte nieistotnymi ligandami (np. BSA) i/lub blokując ligandy lub receptory za pomocą specyficznych przeciwciał blokujących (mAbs). Specyficzną częstotliwość adhezji dla każdego punktu czasowego kontaktu można obliczyć poprzez odjęcie częstotliwości adhezji niespecyficznej1.
7. Analiza danych
- Dopasuj dane dotyczące specyficznej częstotliwości adhezji Pa w funkcji czasu kontaktu t do modelu probabilistycznego (Równanie 1), który opisuje jednoetapową interakcję między jednym gatunkiem receptorów a jednym gatunkiem ligandów z reakcją w przód drugiego rzędu i reakcją wsteczną pierwszego rzędu1:
![Równanie przedstawiające prawdopodobieństwo w systemach dynamicznych; formuła: P_a = 1-exp{-m_mg_AK_a[1-exp(-k_oft)]}.](/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg "figure-protocol-1")
gdzie Ka to dwuwymiarowe (2D) efektywne powinowactwo wiązania, koff to stała szybkości dysocjacji, mr i ml to odpowiednio gęstości receptorów i ligandów zmierzone w kroku 4, a Ac to powierzchnia kontaktu. Dopasowanie krzywej posiada dwa parametry, AcKa oraz koff, ponieważ Ac i Ka są połączone i określane zbiorczo jako efektywne powinowactwo 2D. Ich iloczyn ze stałą szybkości dysocjacji stanowi efektywną stałą szybkości asocjacji 2D: Ackon = AcKa x koff.
Specyficzną częstotliwość adhezji Pa oblicza się poprzez odjęcie frakcji adhezji niespecyficznej (Pnonspecific) od całkowitej zmierzonej adhezji (Pmeasured)1,21:
8. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1 Wyznaczenie gęstości miejsc wiązania integryny αLβ2 na neutrofilach. Neutrofile inkubowano najpierw z 1μg/ml E-selectin-Ig przez 10min w celu dopasowania do warunków eksperymentalnych zastosowanych na Ryciny 3 i 4 lub bez E-selectin-Ig, a następnie z nasycającymi stężeniami (10μg/ml) koniugatu PE z przeciwciałem mAb przeciwko ludzkiemu CD11a (Klon HI111, patrz Tabela specyficznych odczynników i sprzętu) lub nieistotnym mysim IgG1 jako kontrolą, przemyto i przeanalizowano natychmiast. Próbki odczytano na cytometrze przepływowym BD LSR z użyciem standardowych kuleczek kalibracyjnych QuantiBRITE PE. Panel A przedstawia histogramy fluorescencji kuleczek kalibracyjnych (kolor różowy) wraz z histogramami komórek traktowanych E-selectin-Ig (kolor niebieski) lub nietraktowanych (kolor zielony). Specyficzne barwienie mAb CD11a przedstawiono liniami ciągłymi, a barwienie przeciwciałem kontrolnym o identycznym izotypie liniami przerywanymi. Traktowanie komórek E-selectin-Ig (obecność we wszystkich etapach przemywania i w buforze FACS) nie wpłynęło na gęstość CD11a, co wynika z porównania z komórkami nietraktowanymi. Panel B przedstawia proces kwantyfikacji gęstości. Obliczono Log10 dla średniej intensywności fluorescencji (FI) każdej wartości szczytowej czterech histogramów kuleczek kalibracyjnych z Panelu A (różowe kółka) oraz dla specyficznej dla serii liczby cząsteczek PE na kuleczkę (według producenta). Wykreślono regresję liniową Log10 cząsteczek PE na kuleczkę względem Log10 fluorescencji. Dla komórek traktowanych E-selectin wartości Log10 FI (y) wyniosły odpowiednio 3,99 (niebieskie pełne kółko) dla specyficznego mAb i 2,23 (niebieskie puste kółko) dla przeciwciała kontrolnego. Rozwiązano równanie liniowe dla x (wartości naniesiono jako zielone i niebieskie kółka na Panelu B). x = Log10 PE/komórkę i, ponieważ stosunek PE:mAb wynosił 1:1, całkowita liczba αLβ2 na neutrofilach została obliczona jako 9587. Gęstość powierzchniową obliczono na 43 molecules/μm2, przyjmując średnicę neutrofila równą 8,4μm22. Gęstość ICAM-1 zmierzono analogicznie za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem PE-anti-human CD54 mAb, co dało wynik 65 mol/μm2.
Rycina 2 Schematy systemu mikropipet. Nasz system mikropipet został zbudowany wewnętrznie i składa się z trzech podsystemów: podsystemu obrazowania, który umożliwia obserwację, rejestrację i analizę ruchów komórki zassanej do mikropipety; podsystemu mikromanipulacji, pozwalającego na wybiór komórek z komory komórkowej, oraz podsystemu ciśnienia, umożliwiającego zasysanie komórek do mikropipet. Centralnym elementem podsystemu obrazowania jest mikroskop odwrócony (Olympus IMT-2 IMT2) z obiektywem imersyjnym olejowym 100x o aperturze 1.25 N.A. Obraz jest przesyłany do rejestratora kaset wideo za pomocą kamery CCD (charge couple device). Do systemu podłączono timer wideo w celu monitorowania czasu. Każdą mikropipetą można sterować za pomocą napędu mechanicznego zamontowanego na mikroskopie, a jej precyzyjne pozycjonowanie odbywa się za pomocą trójosiowego hydraulicznego mikromanipulatora. Można również zastosować manipulatory mechaniczne firmy Newport. Jeden z uchwytów mikropipet zamontowano na translatorku piezoelektrycznym, którego sterownik jest kontrolowany przez komputer za pomocą kodu LabView (dostępnego na życzenie), a sygnał przechodzi przez kartę DAQ za pomocą wzmacniacza napięcia (własnej konstrukcji) do aktuatora piezoelektrycznego. Pozwala to na precyzyjne i powtarzalne przesuwanie pipety w cyklu testu adhezji. Podsystem regulacji ciśnienia służy do kontrolowania ssania podczas eksperymentu. Linia hydrauliczna łączy uchwyt mikropipety z zbiornikiem z cieczą. Precyzyjny pozycjoner mechaniczny umożliwia dokładną regulację wysokości zbiornika.
Mikropipety są wytwarzane z borokrzemowych szklanych rurek kapilarnych KIMAX (o średnicy zewnętrznej 1,0±0,07 mm i średnicy wewnętrznej 0,7±0,07 mm). W pierwszym etapie mikropipety są wyciągane z rurek kapilarnych za pomocą horyzontalnego wyciągacza szklanych mikroelektrod PN-30 Narishige (alternatywnie można zastosować wyciągacz mikropipet Sutter Instruments). W drugim etapie system Microforge (zbudowany wewnętrznie) jest wykorzystywany do przycinania mikropipet do pożądanej wielkości otworu. Dostępne są również komercyjne modele systemów Microforge.
Aby uniknąć drgań mikropipet podczas eksperymentu, mikroskop wraz z mikromanipulatorami zostaje umieszczony na stole pneumatycznym.
Rysunek 3 Bieżąca częstotliwość adhezji Fi dla wiązania specyficznego (A) i niespecyficznego (B) przy czasie kontaktu 1 s (czerwony) i 10 s (niebieski), zmierzona w powtarzalnych cyklach testów adhezji między RBC powlekanymi ICAM-1 (A) lub hIgG (B) a ludzkimi neutrofilami wykazującymi ekspresję integryny αLβ2. Fi = (X1 + X2 +…+ Xi)/i (1 ≤i ≤ n), gdzie i to indeks cyklu testowego, a Xi przyjmuje wartość „1” (adhezja) lub „0” (brak adhezji). Fn (n=50) zastosowano jako najlepszą ocenę prawdopodobieństwa adhezji.
Rycina 4 Kinetyka wiązania ICAM-1 do integryny αLβ2 neutrofili (
). Prawdopodobieństwo adhezji, zmierzone zgodnie z opisem na Rycini 3 dla trzech par komórek przy każdym czasie kontaktu, zostało uśrednione i przedstawione w funkcji czasu kontaktu. Medium w komorze stanowił HBSS z dodatkiem 1mM Ca2+ i 1mM Mg2+ oraz 1μg/ml dimerycznej E-selectin-Ig w celu zwiększenia wiązania αLβ2. Aby uchwycić ICAM-1-Ig na erytrocytach (RBC), po etapie inkubacji ze streptawidyną dodano krok pośredni polegający na inkubacji RBC z 10μg/ml przeciwciała wychwytującego (biotynilowane przeciwciało kozie przeciwko ludzkiemu Fc, eBioscience). W celu kontroli wiązania nieswoistego zastosowano dwa różne warunki: 1) RBC pokryte przeciwciałem wychwytującym anty-human-Fc i inkubowane z ludzkim IgG zamiast ICAM-1-Ig (O) oraz 2) neutrofile wiążące się z RBC niepokrytymi przeciwciałem wychwytującym (Δ). Do medium dodano 10μg/ml ludzkiego IgG, aby zminimalizować wiązanie E-selectin-Ig w roztworze z przeciwciałem wychwytującym na powierzchni RBC. Wiązanie nieswoiste, zarejestrowane jako krzywa kontrolna ludzkiego IgG, wykorzystano do uzyskania krzywej swoistego prawdopodobieństwa adhezji (
) przy użyciu równania 2. Dopasowanie krzywej swoistego prawdopodobieństwa adhezji za pomocą równania 1 (linia ciągła) pozwoliło wyznaczyć efektywną powinowactwo wiązania AcKa = 1.4•10-4 μm4 oraz koff = 0.3 s-1.
| Odczynnik | MW (g/mol) | Stężenie (mM) | Ilość (g) |
|---|---|---|---|
| Adenina | 135.13 | 2 | 0.27 |
| D-glukoza (dekstroza) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D-Mannitol | 182.17 | 55 | 10.02 |
| Chlorek sodu (NaCl) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na HPO ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L-glutamina | 146.15 | 10 | 1.46 |
Tabela 1. Przygotowanie buforu EAS-45 (1L).
| 25 mg biotyny-XHS w 550 μl DMF | roztwór biotyny 0,1 M |
| roztwór 0,1 biotyny w DMF w rozcieńczeniu 1:10 | roztwór biotyny 0,01 M |
| rozcieńczenie 1:100 0,1 biotyny w DMF | roztwór biotyny 0,001 M |
Tabela 2. Przygotowanie roztworu biotyny.
| końcowe stężenie biotyny (μM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Zapas osadu RBC (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (μl) | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| bufor boratowy 0,1 M (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| roztwór biotyny 0,01 M (μl) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| roztwór biotyny 0,001 M (μl) | 0.8 | 2 | 4 |
Tabela 3. Biotynylacja RBC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby skutecznie przeprowadzić test częstotliwości adhezji za pomocą mikropipety, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, należy upewnić się, że zarejestrowano specyficzną interakcję dla badanego układu receptor-ligand. Pomiary kontrolne niespecyficzne (por. Ryc. 3, 4) zapewniają specyficzność badania. W idealnym przypadku prawdopodobieństwa adhezji niespecyficznej powinny być niższe niż 0,05 dla wszystkich czasów kontaktu, a różnica między prawdopodobieństwem adhezji specyficznej a niespecyficznej po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantów NIH o numerach R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 oraz R01GM096187.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q | Rozcieńczyć do 1x wodą dejonizowaną przed użyciem |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | izolacja RBC |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | izolacja RBC |
| Adenina | Sigma-Aldrich | A2786 | przygotowanie EAS-45 |
| D-glukoza (dekstroza) | Sigma-Aldrich | G7528 | przygotowanie EAS-45 |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | przygotowanie EAS-45 |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | przygotowanie EAS-45 |
| Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | przygotowanie EAS-45 |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G5763 | przygotowanie EAS-45 |
| Biotyna-X-NHS | Calbiochem | 203188 | biotynylacja RBC |
| Dimetyloformamid (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | biotynylacja RBC |
| Bufor boratowy (0,1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | biotynylacja RBC |
| Streptawidyna | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | funkcjonalizacja ligandu |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | funkcjonalizacja ligandu |
| Kuleczki Quantibrite PE | BD Biosciences | 340495 | ilościowe oznaczenie gęstości |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | BD LSR II | ilościowe oznaczenie gęstości |
Kapilara 0,7-1,0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | wyciąganie mikropipety |
| Olej mineralny | Fisher Scientific | BP2629-1 | montaż komory |
| Szkiełko cover glass do mikroskopu | Fisher Scientific | 12-544-G | montaż komory |
PE α-ludzki CD11a Klon HI 111 | eBioscience | 12-0119-71 | Odczynnik do Rys. 1 |
| PE anty-ludzki CD54 | eBioscience | 12-0549 | Odczynnik do Rys. 1 |
| Kontrola izotypowa mysia IgG1 PE | eBioscience | 12-4714 | Odczynnik do Rys. 1 |
| hydrauliczny mikromanipulator | Narishige International | MO-303 | system mikropipety |
| Manipulator mechaniczny | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | system mikropipety |
| translatory piez–elektryczny | Physik Instruments | P-840 | system mikropipety |
| LabVIEW | National Instruments | Wersja 8.6 | system mikropipety |
| Karta DAQ | National Instruments | USB-6008 | system mikropipety |
| Stół optyczny | Kinetic Systems | Seria 5200 | system mikropipety |
Bibliografia
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
