Multiplexowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek pod wpływem siły z wykorzystaniem pęset magnetycznych

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczych cząsteczek w sposób wysoce zrównoleglony.

Streszczenie

Generowanie i wykrywanie sił mechanicznych jest powszechnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośredni związek z przerzutowaniem nowotworów¹, aterogenezą² oraz gojeniem ran³. W każdym z tych przykładów komórki zarówno wywierają siłę na swoje otoczenie, jak i jednocześnie enzymatycznie przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wpływ sił na ECM stał się zatem obszarem znacznego zainteresowania ze względu na jego prawdopodobne znaczenie biologiczne i medyczne^4-7.

Techniki pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapki optyczne⁸, mikroskopia sił atomowych⁹ oraz pęsety magnetyczne^10,11, pozwalają badaczom na analizę funkcji enzymów na poziomie molekularnym poprzez wywieranie sił na pojedyncze białka. Spośród tych technik pęsety magnetyczne (MT) wyróżniają się niskim kosztem i wysoką przepustowością. MT wywierają siły w zakresie ~1-100 pN i mogą zapewniać milisekundową rozdzielczość czasową, co czyni je odpowiednimi do badania mechanizmów enzymatycznych na poziomie pojedynczych cząsteczek¹². W niniejszej pracy przedstawiamy wysoce zrównoleglalny test MT do badania wpływu siły na proteolizę pojedynczych cząsteczek białek. Prezentujemy konkretny przykład proteolizy trymerycznego peptydu kolagenu przez metaloproteinazę macierzy 1 (MMP-1); jednak test ten można łatwo dostosować do badania innych substratów i proteaz.

Protokół

1. Przygotowanie celi przepływowej

1. Kryszalki (#1.5, 22x22 mm oraz 22x40 mm, VWR) są oczyszczane za pomocą sonikacji.
   1. Umieść kryszalki w niewielkim szklanym pojemniku, który pomieści kryszalki i zmieści się w sonikatorze (patrz krok 2).
   2. Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut.
   3. Wylej izopropanol i wypłucz kryszalki obfitą ilością wody dejonizowanej otrzymanej z aparatu Barnsted MilliQ lub urządzenia o podobnym działaniu. Napełnij pojemnik wodą i sonikuj przez 20 minut.
   4. Po sonikacji wysusz kryszalki strumieniem filtrowanego, wolnego od pyłu powietrza. Używaj tylko kryszalki, które wydają się czyste (tj. nie mają smug).
   5. Delikatnie opal kryszalki płomieniem przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego pyłu i wilgoci: przesuń kryszalki przez płomień gazowy z palnika Bunsena, uważając, aby nie odkształcić kryszalki z powodu nadmiernego ciepła. Krok ten usuwa pozostałe zanieczyszczenia powierzchniowe.
2. Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej połącz dwie kryszalki. Odetnij fragment taśmy o długości ~3 cm i szerokości 0,3 cm. Przyklej taśmę do kryszalki 22x40 mm, pozostawiając w środku kanał o szerokości 1,6 cm. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć kryszalkę i upewnić się, że taśma prawidłowo przylega.

2. Konfiguracja i kalibracja pęsety magnetycznej

1. Pincety magnetyczne skonfigurowano z wykorzystaniem stałych magnesów ziemnych, zgodnie z wcześniejszym opisem^10,12. Wykonano aluminiowy wspornik w kształcie litery L z otworem o średnicy 1 mm, który zamontowano na pionowym translaci-z (Thorlabs), aby móc regulować wysokość pincet. Do wspornika, po obu stronach otworu, przytwierdzono dwa stałe magnesy ziemne w celu stworzenia pułapki magnetycznej (Rysunek 1).
2. Przygotowanie DNA: do kalibracji pincet magnetycznych użyto DNA z faga lambda, znakowanego na końcach 5' i 3' biotyną oraz digoksygeniną (IDT DNA, San Diego, CA).
   1. Wymieszać 50 μL 4 nM λ-DNA z 2 μL 40 nM oligonukleotydu koniugowanego z biotyną i podgrzać w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Następnie powoli chłodzić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Dodać ligazę DNA zgodnie ze specyfikacją producenta i przeprowadzić ligację w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
   3. Dodać 2 μL 400 nM oligonukleotydu koniugowanego z digoksygeniną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
   4. Dodać 1,5 μL 10 mM ATP i kontynuować ligację oligonukleotydu koniugowanego z digoksygeniną do λ-DNA przez 3 godziny.
   5. Usunąć nadmiar oligonukleotydów i ligazę DNA za pomocą filtrów wirowych 100 kDa (Microcon Ultracell YM-100). Do usunięcia nadmiaru oligos wystarczająca jest 1000-krotna wymiana buforu na bufor TE. Uwaga: ważne jest, aby nie stosować prędkości wirowania >500xG, ponieważ doprowadzi to do fragmentacji DNA.
   6. Przeanalizować próbkę DNA za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym 0,7%, aby upewnić się, że DNA nie uległo denaturacji ani fragmentacji.
   7. Zmierzyć stężenie DNA. Zaleca się użycie spektrometru UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific), ponieważ dostępna objętość próbki może być bardzo mała.
3. Przygotować komórki przepływowe zgodnie z opisem w sekcji 1.
4. W celu przytwierdzenia DNA do komórki przepływowej, dodać przeciwciało anty-digoksygeninowe (owcza IgG; 1 μg mL^-1; Roche Bioscience, Manheim, Niemcy) i pozostawić do adhezji do szklanej powierzchni na 15 minut.
5. Pasywować powierzchnię komórki przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu DNA, dodając 2 mg mL^-1 BSA i 0,1% Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
6. Powtórzyć krok 2.5.
7. Dodać 50 pM funkcjonalizowanego λ-DNA i pozostawić do przytwierdzenia do szkiełka nakrywki na 15 minut.
8. Wypłukać nadmiar DNA za pomocą 1x PBS.
9. Dodać superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną (kuleczki 1 μm = 2 μg mL^-1; kuleczki 2,8 μm = 20 μg mL^-1) i pozostawić do przytwierdzenia do unieruchomionego DNA na 15 minut.
10. Wypłukać nadmiar kuleczek za pomocą 1x PBS.
11. Kalibracja pincet magnetycznych
    1. Przesunąć magnesy stałe w pozycję oddaloną od powierzchni próbki (>15 mm).
    2. Umieścić przygotowaną komórkę przepływową w mikroskopie.
    3. Przesunąć magnesy stałe w pozycję nad komórką przepływową.
    4. Wybrać płaszczyznę ogniskowania kuleczek funkcjonalizowanych λ-DNA, ustawiając ostrość na kuleczkach z dala od obu szklanych powierzchni. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowania to taka, w której pożądane kuleczki mają jasny środek.
    5. Nagrać wideo ruchu kuleczek z częstotliwością 80 Hz lub wyższą przez 500 klatek.
    6. Przesunąć magnes bliżej powierzchni próbki. Dla odległości powyżej 5 mm przesuwać w przyrostach 1 mm. Dla odległości między 1 a 5 mm przesuwać w przyrostach 0,5 mm. Dla odległości mniejszych niż 1 mm przesuwać w przyrostach 0,25 mm.
    7. Powtórzyć kroki 2.11.5 i 2.11.6 dla każdej nowej pozycji magnesu.
    8. Dla każdego zestawu danych wyznaczyć środek kuleczek, stosując dopasowanie gaussowskie 2D.
    9. Obliczyć siłę na podstawie fluktuacji Browna, korzystając z wzoru:
    
    
    gdzie k_BT to termiczna energia Boltzmanna, L to długość λ-DNA, a 2> to wariancja pozycji centroidu.
    
    10. Potwierdzić dokładność sił, sprawdzając obliczenie siły poprzez dopasowanie lorentzowskie widma mocy w celu wyznaczenia częstotliwości odcięcia. Przyłożona siła jest powiązana z częstotliwością odcięcia zależnością:
    
    
    Gdzie ƒ₀ to częstotliwość odcięcia, a to promień kuleczki, a μ to lepkość cieczy¹².
    

3. Mocowanie peptydów kolagenowych do komór przepływowych

Aby przedstawić konkretny przykład zastosowania naszej metodologii, opisujemy ostatnie prace w naszym laboratorium dotyczące charakterystyki proteolizy trymerycznego peptydowego modelu kolagenu. Przewidujemy, że to ogólne podejście może znaleźć szerokie zastosowanie w odniesieniu do innych białek i polinukleotydów.

1. Modelowy peptyd kolagenowy składa się z N-końcowego znacznika 6x His służącego do oczyszczania, a następnie znacznika 5x myc, sekwencji (GPP)₁₀ wymuszającej tworzenie potrójnej helisy, reszt 772-786 kolagenu α1 (GPQGIAGQRGVVGL), które tworzą miejsce rozpoznawania przez MMP-1, sekwencji foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) oraz C-końcowej sekwencji KKCK ułatwiającej znakowanie biotyną-maleimidem. Foldon pochodzi z białka fibrytyny faga T4 i stabilizuje modelowe trimery kolagenu, gdy jest przyłączony do N- lub C-końca^13,14.
2. Peptyd kolagenowy oraz białka MMP-1 zostały wyekspresowane i oczyszczone zgodnie z wcześniejszymi opisami^4,15.
3. Do komory przepływowej należy dodać przeciwciało anty-myc (15 μg mL^-1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić przyłączenie przeciwciała anty-myc do powierzchni komory przepływowej.
4. Komorę przepływową należy pasywować, aby zapobiec niespecyficznemu przyłączaniu białek, używając 5 mg mL^-1 BSA w ten sam sposób, który opisano w kroku 2.5.
5. Należy dodać 150 pM peptydu kolagenowego i pozwolić mu przyłączyć się do przeciwciała poprzez znacznik myc przez 45 minut.
6. Nadmiar kolagenu należy wypłukać buforem PBS.
7. Należy dodać superparamagnetyczne koraliki pokryte streptawidyną (koraliki 1 μm = 2 μg mL^-1 oraz koraliki 2,8 μm = 20 μg mL^-1) i pozwolić im przyłączyć się do cząsteczek kolagenu przez 45 minut. Koraliki 1 μm należy rozcieńczyć do pożądanego stężenia w PBS. Koraliki 3 μm należy oddzielić od roztworu za pomocą silnych magnesów, a następnie ponownie rozpuścić w PBS. Proces ten należy powtórzyć 3 razy. Zauważono, że ten krok jest niezbędny, aby koraliki 3 μm wiązały się z unieruchomionym na powierzchni peptydem kolagenowym.

4. Analiza wymuszonej proteolizy

1. Po złożeniu komory przepływowej z peptydem kolagenowym i koralikami magnetycznymi, wykonaj obrazowanie komory w pułapce magnetycznej przy niskiej sile, ok. 1 pN. Z naszego doświadczenia wynika, że subpopulacja koralików czasami słabo przylega do powierzchni w sposób nieswoisty. Zastosowanie niewielkiej siły zapewnia uwolnienie tych koralików.
2. Do komory przepływowej dodaj aktywowany enzym. W tym przypadku MMP-1 został uprzednio aktywowany poprzez dodanie 3,5 mM APMA (octanu 4-aminofenylo-rtęciowego) i inkubowany w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Aktywację zweryfikowano za pomocą SDS-PAGE.
3. Niezwłocznie po ponownym wprowadzeniu komory przepływowej do aparatu z pęsetą magnetyczną, nagraj wideo obejmujące kilka pól widzenia, co zazwyczaj pozwala na uzyskanie kilkuset przyczepionych koralików. Będzie to moment t = 0.
4. Powtórz proces nagrywania kilku pól widzenia (powracając do tego samego pola widzenia) w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie koraliki się odczepią lub proteoliza nie będzie już zauważalna.
5. Analiza danych kinetycznych
   1. Policz koraliki w różnych polach widzenia w różnych punktach czasowych i oblicz ich średnią. Znormalizuj liczbę koralików, dzieląc średnią liczbę koralików w każdym punkcie czasowym przez liczbę koralików w t = 0. Pozwala to na porównanie szybkości proteolizy z różnych eksperymentów, ponieważ absolutna liczba koralików będzie różnić się między poszczególnymi próbami.
   2. Przedstaw ten stosunek jako funkcję czasu. W tym przypadku dopasowano go do wykładniczego zaniku z dodatkiem stałej.
   
   
   gdzie ƒ(t) to stosunek przyczepionych koralików (lub nieprzeproteolizowanych cząsteczek kolagenu), t to czas, a to frakcja koralików przyczepionych za pomocą wiązania kolagenowego, b to stała szybkości zaniku, a c to frakcja koralików przyczepionych nieswoiście.
   
   3. Ten sam eksperyment powtarza się przy różnych wartościach siły i stężeniach MMP-1, aby wyjaśnić wpływ siły na proteolizę kolagenu przez MMP-1.

5. Reprezentatywne wyniki

Powyższy protokół opisuje nowatorskie zastosowanie pęset magnetycznych (Rycina 1) do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną. Kalibrację pęset dla kulek o rozmiarach 1 μm i 3 μm przeprowadzono, wykorzystując zarówno amplitudę obserwowanych fluktuacji Browna, jak i obliczenie częstotliwości odcięcia dla różnych pozycji magnesu (Rycina 2). W eksperymentach dotyczących proteolizy pod wpływem siły układ jest analogiczny, z tą różnicą, że DNA zastąpiono kolagenem (Ryciny 3, 4). Znormalizowaną liczbę pozostałych kulek można przedstawić jako funkcję czasu w celu wyznaczenia szybkości proteolizy (Rycina 5); proces ten można powtarzać dla różnych stężeń enzymu i różnych wartości sił.

Rysunek 1. Schemat procesu kalibracji pułapki magnetycznej (nie w skali). Dwa trwałe magnesy ziem rzadkich tworzą pole magnetyczne, które oddziałuje na koralik superparamagnetyczny. Przesuwanie magnesu w górę i w dół reguluje przyłożoną siłę. Obrazy koralików są rejestrowane przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu w jasnym polu, z analitycznym przejściem światła przez otwór między dwoma magnesami. Wstawka: Obraz uzyskany przy użyciu obiektywu powietrznego 40x. Ostre, okrągłe punkty odpowiadają koralikom przytwierdzonym do powierzchni szkiełka nakrywki. Obiekty poza ogniskowaniem to koraliki nieprzytwierdzone.

Rycina 2. Wykresy skalibrowanej siły w funkcji odległości magnesu od powierzchni próbki dla kulek o średnicy 1 μm (lewo) i 2,8 μm (prawo). Dane dopasowano do funkcji empirycznej , gdzie x oznacza odległość od magnesu. Dla kulek 1 μm wartości wynoszą a = 31,8, b = 5,61 oraz c = 4,39, a dla kulek 3 μm a = 140, b = 3,10 oraz c = 1,86. Wartości te są specyficzne dla naszego urządzenia i geometrii eksperymentalnej, a każde urządzenie powinno być kalibrowane indywidualnie. Słupki błędów dla każdego punktu reprezentują ~10% zmienność siły przyłożonej do poszczególnych kulek, wynikającą ze zmienności rozmiaru kulek. Przyłożona siła jest proporcjonalna do objętości kulek, a objętość kulek różni się o ~9% względem średniej (zgodnie ze specyfikacją producenta).

Rysunek 3. Układ testu proteolizy siłowej (Nie w skali). Model trymeryczny kolagenu jest przytwierdzony do powierzchni szkiełka nakrywki poprzez konjugację myc/anty-myc. Superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną są przyłączone do trymerów kolagenu za pomocą wiązania biotyna-streptawidyna. Aktywne MMP-1 przecina kolagen w czasie, powodując odrywanie się kuleczek od powierzchni i ich oddalanie się od płaszczyzny ogniskowania.

Rysunek 4. Schematyczny rysunek proteolizy w funkcji czasu. Rysunek przedstawia pole widzenia próbki w czasie zachodzenia proteolizy. Wraz z upływem czasu MMP-1 przecina kolagen, a kulek odrywają się i oddalają od płaszczyzny ogniskowania pod wpływem pola magnetycznego.

Rycina 5. Szybkość proteolizy zależy od przyłożonej siły¹⁶. Przedstawiono dane zebrane przy 1,0 pN (3 μM MMP-1; kolor czarny), 6,2 pN (3 μM MMP-1; kolor czerwony) i 13 pN (0,2 μM MMP-1; kolor magenta). Szybkości proteolizy (parametry dopasowania) wynoszą: 0,22 ± 0,02 min^-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min^-1 (6,2 pN) oraz 2,08 ± 0,18 min^-1 (13 pN). Frakcja kulek niepodlegających proteolizie w późnych punktach czasowych (> 15 minut) pozostaje w przybliżeniu stała i wynosi ~0,25 w różnych eksperymentach. Słupki błędów odpowiadają statystyce Poissona odzwierciedlającej liczbę obserwacji w każdym punkcie czasowym. Błąd w każdym punkcie czasowym dla n kulek wynosi n^1/2. Błąd frakcji przyczepionych kulek obliczono metodą propagacji błędów. W eksperymentach dla 1,0 pN i 6,2 pN zastosowano kuleczki o średnicy 1 μm, natomiast w eksperymentach dla 13 pN użyto kuleczek o średnicy 2,8 μm.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje nowe zastosowanie klasycznej techniki pojedynczych cząsteczek. Pęsety magnetyczne umożliwiają prowadzenie analiz pojedynczych cząsteczek o średniej i wysokiej przepustowości w sposób kosztowo efektywny. Jednakże, podobnie jak w przypadku wszystkich technik eksperymentalnych, istnieją pewne wyzwania i potencjalne pułapki.

Ograniczenia pęset magnetycznych

W porównaniu z pułapką optyczną rozdzielczość przestrzenna i czasowa aparatury MT jest nis...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko podstawowe nr 1,5 (22x22)	VWR	48366-067
Szkiełko podstawowe nr 1,5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
Ligaza DNA T4	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
Przeciwciało anty-digoksigeninowe	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Przeciwciało anty-myc	Invitrogen	46-0603
Albuminy surowicy bydlęcej	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidina	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidina	Invitrogen	658.01D
Octan p-aminofenylomurturyczny	Calbiochem	164610
Biotyna-maleimid	Sigma Aldrich	B1267
Oligonukleotyd znakowany biotyną	IDT DNA	Synteza na zamówienie
Oligonukleotyd znakowany digoksigeniną	IDT DNA	Synteza na zamówienie
Gen peptyd kolagenu	DNA 2.0	Synteza na zamówienie
cDNA MMP-1	Harvard Plasmid Database
Przesuwnik osi Z	Thorlabs	MTS50
Sterownik serwo do przesuwnika	Thorlabs	TDC001