Multipleksowane pomiary proteolizy siły pojedynczej cząsteczki za pomocą pęsety magnetycznej

Summary

W tym artykule opisujemy użycie pęsety magnetycznej do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w wysoce równoległy sposób.

Abstract

Generowanie i wykrywanie sił mechanicznych jest wszechobecnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośrednie znaczenie dla przerzutów raka¹, miażdżycy2ⁱ gojenia się ran³. W każdym z tych przykładów komórki zarówno wywierają siłę na otoczenie, jak i jednocześnie enzymatycznie przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wpływ sił na ECM stał się zatem obszarem znacznego zainteresowania ze względu na jego prawdopodobne znaczenie biologiczne i medyczne^4-7.

Techniki pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapka optyczna⁸, mikroskopia sił atomowych⁹ i pęseta magnetyczna^10,11 pozwalają badaczom badać funkcję enzymów na poziomie molekularnym poprzez wywieranie sił na poszczególne białka. Spośród tych technik pęseta magnetyczna (MT) wyróżnia się niskim kosztem i wysoką przepustowością. MT wywiera siły w zakresie ~1-100 pN i może zapewnić milisekundową rozdzielczość czasową, cechy, które są dobrze dopasowane do badania mechanizmu enzymatycznego na poziomie^{pojedynczej cząsteczki 12}. Tutaj przedstawiamy wysoce zrównoleglany test MT w celu zbadania wpływu siły na proteolizę pojedynczych cząsteczek białka. Przedstawiamy konkretny przykład proteolizy trimerycznego peptydu kolagenowego przez metaloproteinazę macierzy 1 (MMP-1); Jednak test ten można łatwo dostosować do badania innych substratów i proteaz.

Protocol

1. Przygotowanie komory przepływowej

1. Szkiełka nakrywkowe (#1,5, 22x22 mm i 22x40 mm, VWR) są czyszczone za pomocą sonikacji.
   1. Dodaj szkiełka nakrywkowe do małego szklanego pojemnika, który może pomieścić szkiełka nakrywkowe i zmieścić się w soniku (patrz krok 2).
   2. Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w sonikatorze do kąpieli przez 20 minut.
   3. Wyrzucić izopropanol i przepłukać szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody dejonizowanej wytwarzanej przez urządzenie Barnsted MilliQ lub podobne urządzenie. Napełnij pojemnik wodą i sonikuj przez 20 minut.
   4. Po sonikacji wysuszyć szkiełka nakrywkowe w strumieniu przef....

Discussion

Protokół ten opisuje nowe zastosowanie klasycznej techniki pojedynczej cząsteczki. Pęseta magnetyczna umożliwia przeprowadzanie średnio- i wysokoprzepustowych testów pojedynczych cząsteczek w ekonomiczny sposób. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich technik eksperymentalnych, istnieją wyzwania i potencjalne pułapki.

Ograniczenia pęsety magnetycznej

W porównaniu z pułapką optyczną rozdzielczość przestrzenna i czasowa aparatu MT jest niska. Co więcej, siły generowa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkło z mikro pokrywą #1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Szkło z mikro pokrywą #1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
T4 Ligaza DNA	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anty-Digoxigenina	Roche Diagnostyka	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Przeciwciało anty-myc	Invitrogen	46-0603
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptawidyna	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin	Invitrogen	658.01D
Octan p-aminofenylortęci	Calbiochem	164610
Biotyna-maleimid	Sigma Aldrich	B1267
IDT	znakowane biotyną	Niestandardowa synteza
IDT znakowane	digoksygeniną Niestandardowa	synteza
peptydu kolagenowego	DNA 2.0	Niestandardowa synteza
MMP-1 cDNA	Harvard Plasmid Database
z-translator	Thorlabs	MTS50
Kontroler serwomechanizmu dla tłumacza	Thorlabs	TDC001