Multipleksowane pomiary proteolizy siły pojedynczej cząsteczki za pomocą pęsety magnetycznej

Summary

W tym artykule opisujemy użycie pęsety magnetycznej do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w wysoce równoległy sposób.

Abstract

Generowanie i wykrywanie sił mechanicznych jest wszechobecnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośrednie znaczenie dla przerzutów raka¹, miażdżycy2ⁱ gojenia się ran³. W każdym z tych przykładów komórki zarówno wywierają siłę na otoczenie, jak i jednocześnie enzymatycznie przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wpływ sił na ECM stał się zatem obszarem znacznego zainteresowania ze względu na jego prawdopodobne znaczenie biologiczne i medyczne^4-7.

Techniki pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapka optyczna⁸, mikroskopia sił atomowych⁹ i pęseta magnetyczna^10,11 pozwalają badaczom badać funkcję enzymów na poziomie molekularnym poprzez wywieranie sił na poszczególne białka. Spośród tych technik pęseta magnetyczna (MT) wyróżnia się niskim kosztem i wysoką przepustowością. MT wywiera siły w zakresie ~1-100 pN i może zapewnić milisekundową rozdzielczość czasową, cechy, które są dobrze dopasowane do badania mechanizmu enzymatycznego na poziomie^{pojedynczej cząsteczki 12}. Tutaj przedstawiamy wysoce zrównoleglany test MT w celu zbadania wpływu siły na proteolizę pojedynczych cząsteczek białka. Przedstawiamy konkretny przykład proteolizy trimerycznego peptydu kolagenowego przez metaloproteinazę macierzy 1 (MMP-1); Jednak test ten można łatwo dostosować do badania innych substratów i proteaz.

Protocol

1. Przygotowanie komory przepływowej

1. Szkiełka nakrywkowe (#1,5, 22x22 mm i 22x40 mm, VWR) są czyszczone za pomocą sonikacji.
   1. Dodaj szkiełka nakrywkowe do małego szklanego pojemnika, który może pomieścić szkiełka nakrywkowe i zmieścić się w soniku (patrz krok 2).
   2. Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w sonikatorze do kąpieli przez 20 minut.
   3. Wyrzucić izopropanol i przepłukać szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody dejonizowanej wytwarzanej przez urządzenie Barnsted MilliQ lub podobne urządzenie. Napełnij pojemnik wodą i sonikuj przez 20 minut.
   4. Po sonikacji wysuszyć szkiełka nakrywkowe w strumieniu przefiltrowanego, wolnego od kurzu powietrza. Używaj tylko szkiełek nakrywkowych, które wydają się czyste (tj. bez smug).
   5. Delikatnie podpal szkiełka nakrywkowe przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego kurzu i wilgoci: przepuść szkiełka nakrywkowe przez płomień gazowy wytwarzany za pomocą palnika Bunsena, uważając, aby nie wypaczyć szkiełka nakrywkowego z powodu nadmiernego ciepła. Ten etap usuwa resztki zanieczyszczeń powierzchniowych.
2. Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej przymocuj ze sobą dwa szkiełka nakrywkowe. Przytnij taśmę na ~3 cm długości i 0,3 cm szerokości. Przymocuj taśmę na szkiełku nakrywkowym 22x40 mm, pozostawiając kanał o długości 1,6 cm pośrodku. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma prawidłowo przylega
.

2. Konfiguracja i kalibracja pęsety magnetycznej

1. Pęseta magnetyczna została ustawiona przy użyciu trwałych magnesów ziem rzadkich, jak opisano wcześniej^10,12. Aluminiowy wspornik w kształcie litery L został skonstruowany z otworkiem o średnicy 1 mm i zamontowany na pionowym tłumaczu Z (Thorlabs) w celu modulacji wysokości pęsety. Dwa trwałe magnesy ziem rzadkich zostały przymocowane do wspornika po obu stronach otworu, aby utworzyć pułapkę magnetyczną (ilustracja 1).
2. Przygotowanie DNA: Do kalibracji pęsety magnetycznej użyto DNA z faga lambda znakowanego na końcach 5' i 3' biotyną i digoksygeniną (IDT DNA, San Diego, CA).
   1. Zmieszać 50 μl λ-DNA o stężeniu 4 nM z 2 μl oligonukleotydu sprzężonego z biotyną o stężeniu 40 nM i ogrzewać w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Następnie powoli schładzaj w temperaturze pokojowej przez ponad 1 godzinę.
   2. Dodaj ligazę DNA zgodnie ze specyfikacją producenta i podwiązuj w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
   3. Dodać 2 μl oligonukleotydu sprzężonego z digoksygeniną o długości 400 nM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
   4. Dodać 1,5 μl 10 mM ATP i kontynuować ligację oligonukleotydu sprzężonego z digoksygeniną do λ-DNA przez 3 godziny.
   5. Usunąć nadmiar oligonukleotydów i ligazy DNA za pomocą filtrów spinowych 100 kDa (Microcon Ultracell YM-100). Całkowita 1000-krotna wymiana buforu w buforze TE jest wystarczająca do usunięcia nadmiaru oligonukleukleotydów. Uwaga: Ważne jest, aby nie używać prędkości wirowania >500xG, ponieważ doprowadzi to do ścinania DNA.
   6. Zbadaj próbkę DNA za pomocą elektroforezy na 0,7% żelu agarozowym, aby upewnić się, że DNA nie jest denaturowane ani ścinane.
   7. Zmierz stężenie DNA. Zaleca się stosowanie spektrometru UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific), ponieważ dostępna objętość próbki może być bardzo mała.
3. Przygotować komory przepływowe zgodnie z opisem w sekcji 1.
4. W celu przyłączenia DNA do komórki przepływowej dodać przeciwciało anty-digoksygeniny (owcze IgG; 1 μg ^mL-1; Roche Bioscience, Manheim, Niemcy) i pozostawić do przylegania do szklanej powierzchni przez 15 minut.
5. Pasywować powierzchnię komórki przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu sklejaniu się DNA, dodając 2 mg ^mL-1 BSA, 0,1% Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
6. Powtórz krok 2.5.
7. Dodać 50 pM funkcjonalnego λ-DNA i pozostawić do przyczepienia do szkiełka nakrywkowego na 15 minut.
8. Zmyj nadmiar DNA za pomocą 1x PBS.
9. Dodaj kulki superparamagnetyczne pokryte streptawidyną (kulki 1 μm = 2 μg ^mL-1; kulki 2,8 μm = 20 μg ^mL-1) i pozwól im przyczepić się do unieruchomionego DNA przez 15 minut.
10. Zmyj nadmiar koralików za pomocą 1x PBS.
11. Kalibracja pęsety magnetycznej
    1. Przesuń magnesy trwałe do pozycji oddalonej od powierzchni próbki (>15 mm).
    2. Umieść przygotowaną komorę przepływową w mikroskopie.
    3. Przesuń magnesy trwałe na miejsce nad komorą przepływową.
    4. Wybierz płaszczyznę ogniskową kulek funkcjonalizowanych λ-DNA, skupiając się na kulkach z dala od obu powierzchni szkła. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowa to taka, w której pożądane koraliki mają jasny środek.
    5. Nagraj film przedstawiający ruch ściegu z częstotliwością odświeżania 80 Hz lub większą przez 500 klatek.
    6. Przesuń magnes bliżej powierzchni próbki. W przypadku odległości większych niż 5 mm należy poruszać się w krokach co 1 mm. W przypadku odległości od 1 do 5 mm należy poruszać się w krokach co 0,5 mm. W przypadku odległości mniejszych niż 1 mm poruszaj się w krokach co 0,25 mm.
    7. Powtórz kroki 2.11.5 i 2.11.6 dla każdej nowej pozycji magnesu.
    8. Dla każdego zestawu danych śledź środek ściegów za pomocą dopasowania gaussowskiego 2D.
    9. Oblicz siłę za pomocą fluktuacji Browna za pomocą:
    
    
    gdzie k_BT jest energią cieplną Boltzmanna, L jest długością λ-DNA, a 2> jest wariancją położenia środka ciężkości.
    
    10. Potwierdź dokładność sił, sprawdzając obliczenie siły za pomocą widma mocy dopasowania Lorentza, aby znaleźć częstotliwość staczania. Przyłożona siła jest powiązana z częstotliwością staczania się za pomocą zależności:
    
    
    Gdzie ƒ₀ to częstotliwość staczania, a to promień stopki, a μ to lepkość płynu¹²,
    

3. Przyłączanie peptydu kolagenowego do komórek przepływowych

Aby dostarczyć konkretnego przykładu zastosowania naszej metodologii, opisujemy ostatnie prace w naszym laboratorium, które charakteryzują proteolizę peptydu modelowego kolagenu trimerycznego. Przewidujemy, że to ogólne podejście może być szeroko stosowane do innych białek i polinukleotydów.

1. Peptyd modelu kolagenu składa się z N-końcowego 6x His-tag do oczyszczania, a następnie 5x znacznika myc, (GPP)₁₀ w celu wymuszenia tworzenia potrójnej helisy, reszt kolagenu α1 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), które tworzą miejsce rozpoznawania MMP-1, sekwencji foldonowej (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) oraz C-końcowego KKCK w celu ułatwienia znakowania biotyną-maleimidem. Foldon pochodzi z fibrytyny białka T4-faga i stabilizuje trimery modelu kolagenu po fuzji na końcu N lub C ^13,14.
2. Peptyd kolagenowy i białka MMP-1 uległy ekspresji i oczyszczeniu w sposób opisany wcześniej^4,15.
3. Dodać anty-myc (15 μg ^mL-1) do komory przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić anty-myc przyczepienie się do powierzchni komory przepływowej.
4. Pasywować komórkę przepływową, aby zapobiec niespecyficznemu przyłączaniu białek za pomocą 5 mg ^mL-1 BSA w taki sam sposób, jak opisano w kroku 2.5.
5. Dodaj 150 pM peptydu kolagenowego i pozwól mu przyłączyć się do przeciwciała za pomocą znacznika myc przez 45 minut.
6. Zmyj nadmiar kolagenu za pomocą buforu PBS.
7. Dodaj kulki superparamagnetyczne pokryte streptawidyną (kulki 1 μm = 2 μg ^mL-1i kulki 2,8 μm = 20 μg ^mL-1) i pozwól im przyłączyć się do cząsteczek kolagenu przez 45 minut. Kulki o wielkości 1 μm należy rozcieńczyć do pożądanego stężenia w PBS. Kulki o wielkości 3 μm należy oddzielić od roztworu za pomocą silnych magnesów, a następnie rozpuścić w PBS. Ten proces należy powtórzyć 3 razy. Zauważyliśmy, że ten krok jest niezbędny, aby kulki 3 μm związały się z unieruchomionym powierzchniowo peptydem kolagenowym.

4. Test proteolizy Force

1. Po zmontowaniu komórki przepływowej z peptydem kolagenowym i kulkami magnetycznymi, zobrazuj komórkę przepływową w pułapce magnetycznej pod niską, ~ 1 pN siłą. Z naszego doświadczenia wynika, że subpopulacja koralików jest czasami słabo przylegająca do powierzchni w niespecyficzny sposób. Zastosowanie niewielkiej siły zapewnia, że te koraliki zostaną uwolnione.
2. Dodaj aktywowany enzym do komórki przepływowej. W tym przypadku MMP-1 wstępnie aktywowano przez dodanie 3,5 mM APMA (octan 4-aminofenylomertęci) i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Aktywacja została zweryfikowana za pomocą SDS-PAGE.
3. Gdy tylko komórka przepływowa zostanie ponownie wprowadzona do pęsety magnetycznej, nagraj film obejmujący kilka pól widzenia, zwykle uzyskując kilkaset dołączonych koralików. Będzie to t = 0.
4. Powtórz ten sam proces rejestrowania kilku pól widzenia (wracając do tego samego pola widzenia) w regularnych punktach czasowych, aż wszystkie koraliki oderwą się lub nie będzie można dostrzec dalszej proteolizy.
5. Analiza danych kinetycznych
   1. Policz koraliki w różnych polach view w różnych punktach czasowych i uśrednij je. Znormalizuj liczbę koralików, dzieląc średnią liczbę koralików w każdym punkcie czasowym przez liczbę koralików przy t = 0. Gwarantuje to, że możemy porównać tempo proteolizy z różnych eksperymentów, ponieważ bezwzględna liczba kulek będzie się różnić w zależności od eksperymentu.
   2. Wykreśl stosunek w funkcji czasu. W tym przypadku dopasowaliśmy go do rozkładu wykładniczego plus stała.
   
   
   gdzie ƒ(t) jest stosunkiem dołączonych koralików (lub cząsteczek kolagenu nieproteolizowanych), t to czas, a to ułamek koralików połączonych linką kolagenową, b to stała szybkości rozpadu, a c to frakcja koralików, które są przyczepione niespecyficznie.
   
   3. Ten sam eksperyment powtarza się przy różnych stężeniach MMP-1 w celu wyjaśnienia wpływu siły na proteolizę kolagenu przez MMP-1.

5. Reprezentatywne wyniki

Powyższy protokół opisuje nowatorskie zastosowanie pęsety magnetycznej (Rysunek 1) do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną. Skalibrowaliśmy pęsetę dla kulek 1 μm i 3 μm, wykorzystując zarówno wielkość obserwowanych fluktuacji Browna, jak i obliczenie częstotliwości staczania się przy różnych pozycjach magnesu (rysunek 2). W eksperymentach z proteolizą sił układ jest podobny, z wyjątkiem tego, że DNA jest zastępowane kolagenem (ryc. 3, 4). Znormalizowaną liczbę pozostałych kulek można wykreślić jako funkcję czasu, aby znaleźć tempo proteolizy (ryc. 5), a proces ten można powtórzyć dla różnych stężeń i sił enzymów.

Rysunek 1. Schemat procesu kalibracji pułapki magnetycznej (nie w skali). Dwa trwałe magnesy ziem rzadkich wytwarzają pole magnetyczne, które przyciąga koralik superparamagnetyczny. Przesunięcie magnesu w górę iw dół dostosowuje przyłożoną siłę. Koraliki są obrazowane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu jasnego pola, a światło przechodzi przez otwór między dwoma magnesami. Wstawka: Zdjęcie zrobione obiektywem pneumatycznym 40x. Ostre, okrągłe plamki odpowiadają koralikom przymocowanym do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Nieostre obiekty to odłączone koraliki.

Rysunek 2. Wykresy skalibrowanej siły w funkcji odległości magnesu od powierzchni próbki dla kulek 1 μm (po lewej) i 2,8 μm (po prawej). Dane dopasowano do funkcji empirycznej , gdzie x jest odległością od magnesu. A = 31,8, B = 5,61 i C = 4,39 dla kulek 1 μm oraz A = 140, b = 3,10 i C = 1,86 dla kulek 3 μm. Wartości te są specyficzne dla naszego konkretnego instrumentu i geometrii eksperymentalnej, a każdy instrument powinien być kalibrowany indywidualnie. Słupki błędów w każdym punkcie reprezentują ~10% zmienności przyłożonej siły na podstawie ściegu do ściegu, ze względu na zmienność rozmiaru ściegu. Przyłożona siła jest proporcjonalna do objętości koralików, a objętość ściegu zmienia się o ~9% powyżej średniej (zgodnie ze specyfikacją producenta).

Rysunek 3. Wymuś ustawienie testu proteolizy (bez skali). Trimer modelu kolagenowego jest przymocowany do powierzchni szkiełka nakrywkowego za pomocą koniugacji myc/anty-myc. Pokryte streptawidyną kulki superparamagnetyczne są połączone z trymerami kolagenu za pomocą połączenia biotyna-streptawidyna. Aktywowany MMP-1 z czasem przecina kolagen, powodując odklejanie się kulek od powierzchni i odsuwanie się od płaszczyzny ogniskowej.

Rysunek 4. Schematyczny rysunek proteolizy w funkcji czasu. Rysunek przedstawia przykładowe pole widzenia w czasie, gdy zachodzi proteoliza. Z biegiem czasu MMP-1 przecina kolagen, a kulki odrywają się i odsuwają od płaszczyzny ogniskowej pod wpływem pola magnetycznego.

Rysunek 5. Szybkość proteolizy zależy od przyłożonej siły¹⁶. Przedstawiono dane zebrane przy 1,0 pN (3 μM MMP-1; ), 6,2 pN (3 μM MMP-1; czerwony) i 13 pN (0,2 μM MMP-1; purpurowy). Szybkość proteolizy (parametry dopasowania) wynosi: 0,22 ± 0,02 ^min-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 ^min-1 (6,2 pN) i 2,08 ± 0,18 ^min-1 (13 pN). Frakcja kulek nieproteolizowanych w długich punktach czasowych (> 15 minut) pozostaje w przybliżeniu stała na poziomie ~0,25 w różnych eksperymentach. Słupki błędów odpowiadają statystykom Poissona odzwierciedlającym liczbę obserwacji w każdym punkcie czasowym. Błąd w każdym punkcie czasowym dla n koralików wynosi n^1/2. Błąd we frakcji dołączonych koralików obliczono przez propagację błędu.1 μm kulki użyto do eksperymentów 1,0 pN i 6,2 pN, a kulki 2,8 μm użyto do 13 eksperymentów pN.

Discussion

Protokół ten opisuje nowe zastosowanie klasycznej techniki pojedynczej cząsteczki. Pęseta magnetyczna umożliwia przeprowadzanie średnio- i wysokoprzepustowych testów pojedynczych cząsteczek w ekonomiczny sposób. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich technik eksperymentalnych, istnieją wyzwania i potencjalne pułapki.

Ograniczenia pęsety magnetycznej

W porównaniu z pułapką optyczną rozdzielczość przestrzenna i czasowa aparatu MT jest niska. Co więcej, siły generowa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkło z mikro pokrywą #1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Szkło z mikro pokrywą #1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
T4 Ligaza DNA	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anty-Digoxigenina	Roche Diagnostyka	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Przeciwciało anty-myc	Invitrogen	46-0603
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptawidyna	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin	Invitrogen	658.01D
Octan p-aminofenylortęci	Calbiochem	164610
Biotyna-maleimid	Sigma Aldrich	B1267
IDT	znakowane biotyną	Niestandardowa synteza
IDT znakowane	digoksygeniną Niestandardowa	synteza
peptydu kolagenowego	DNA 2.0	Niestandardowa synteza
MMP-1 cDNA	Harvard Plasmid Database
z-translator	Thorlabs	MTS50
Kontroler serwomechanizmu dla tłumacza	Thorlabs	TDC001