Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3520

⸱

25 lipca 2012

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Streszczenie

Generowanie i wykrywanie sił mechanicznych jest powszechnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośredni związek z przerzutowaniem nowotworów1, aterogenezą2 oraz gojeniem ran3. W każdym z tych przykładów komórki zarówno wywierają siłę na swoje otoczenie, jak i jednocześnie enzymatycznie przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wpływ sił na ECM stał się zatem obszarem znacznego zainteresowania ze względu na jego prawdopodobne znaczenie biologiczne i medyczne4-7.

Techniki pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapkowanie optyczne8, mikroskopia sił atomowych9 oraz pęsety magnetyczne10,11, pozwalają badaczom badać funkcję enzymów na poziomie molekularnym poprzez wywieranie sił na pojedyncze białka. Wśród tych technik pęsety magnetyczne (MT) wyróżniają się niskim kosztem i wysoką przepustowością. MT wywierają siły w zakresie ~1-100 pN i mogą zapewniać milisekundową rozdzielczość czasową, co czyni je odpowiednimi do badania mechanizmów enzymatycznych na poziomie pojedynczych cząsteczek12. W niniejszej pracy opisujemy wysoce równoległy test MT służący do badania wpływu siły na proteolizę pojedynczych cząsteczek białek. Przedstawiamy konkretny przykład proteolizy trymerycznego peptydu kolagenu przez metaloproteinazę macierzy 1 (MMP-1); jednak test ten można łatwo dostosować do badania innych substratów i proteaz.

Protokół

1. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Kolebki szklane (#1.5, 22x22 mm i 22x40 mm, VWR) są czyszczone za pomocą sonikacji.
    1. Umieść kolebki w niewielkim szklanym pojemniku, który pomieści kolebki i zmieści się w sonikatorze (patrz krok 2).
    2. Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut.
    3. Wylej izopropanol i przepłucz kolebki obfitymi ilościami wody dejonizowanej uzyskanej z urządzenia Barnsted MilliQ lub podobnego urządzenia. Napełnij pojemnik wodą i poddaj sonikacji przez 20 minut.
    4. Po sonikacji wysusz kolebki strumieniem filtrowanego, wolnego od kurzu powietrza. Używaj tylko kolebek, które wydają się czyste (tzn. bez smug).
    5. Delikatnie opal kolebki płomieniem przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego kurzu i wilgoci: przesuń kolebki przez płomień gazowy wytworzony palnikiem Bunsena, uważając, aby nie zdeformować kolebki pod wpływem nadmiernego ciepła. Ten krok usuwa pozostałe zanieczyszczenia powierzchniowe.
  2. Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej połącz dwie kolebki. Odetnij kawałek taśmy o długości ~3 cm i szerokości 0.3 cm. Przytwierdź taśmę do kolebki 22x40 mm, pozostawiając w środku kanał o szerokości 1.6 cm. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć kolebkę i upewnić się, że taśma prawidłowo przylega.

2. Konfiguracja i kalibracja pęset magnetycznych

  1. Pęsety magnetyczne skonfigurowano przy użyciu trwałych magnesów ziemioprzemagnesowych zgodnie z wcześniejszym opisem10,12. Zbudowano aluminiowy wspornik w kształcie litery L z otworem o średnicy 1 mm i zamontowano go na pionowym translokatorze osi z (Thorlabs), aby regulować wysokość pęset. Dwa trwałe magnesy ziemioprzemagnesowane przymocowano do wspornika po obu stronach otworu, aby stworzyć pułapkę magnetyczną (Rycina 1).
  2. Przygotowanie DNA: do kalibracji pęset magnetycznych wykorzystano DNA faga lambda znakowane na końcach 5' i 3' biotyną oraz digoksigeniną (IDT DNA, San Diego, CA).
    1. Wymieszać 50 μL 4 nM λ-DNA z 2 μL 40 nM oligonukleotydu sprzężonego z biotyną i ogrzewać w 60 °C przez 10 minut. Następnie powoli chłodzić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Dodać ligazę DNA zgodnie ze specyfikacją producenta i przeprowadzić ligację w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    3. Dodać 2 μL 400 nM oligonukleotydu sprzężonego z digoksigeniną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
    4. Dodać 1,5 μL 10 mM ATP i kontynuować ligację oligonukleotydu sprzężonego z digoksigeniną do λ-DNA przez 3 godziny.
    5. Usunąć nadmiar oligonukleotydów i ligazę DNA za pomocą filtrów wirowych 100 kDa (Microcon Ultracell YM-100). W celu usunięcia nadmiaru oligosów wystarczająca jest łącznie 1000-krotna wymiana buforu na bufor TE. Uwaga: ważne jest, aby nie stosować prędkości wirowania >500xG, ponieważ doprowadzi to do pękania DNA.
    6. Przebadać próbkę DNA za pomocą elektroforezy na 0,7% żelu agarozy, aby upewnić się, że DNA nie uległo denaturacji ani pękaniu.
    7. Zmierzyć stężenie DNA. Zaleca się użycie spektrometru UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific), ponieważ dostępna objętość próbki może być bardzo mała.
  3. Przygotować komory przepływowe zgodnie z opisem w sekcji 1.
  4. W celu przytwierdzenia DNA do komory przepływowej dodać przeciwciało anty-digoksigeninowe (owcza IgG; 1 μg mL-1; Roche Bioscience, Manheim, Niemcy) i pozwolić mu przyprzylgnąć do szklanej powierzchni przez 15 minut.
  5. Spasywować powierzchnię komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu DNA, dodając 2 mg mL-1 BSA, 0,1% Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  6. Powtórzyć krok 2.5.
  7. Dodać 50 pM funkcjonalizowanego λ-DNA i pozwolić mu przytwierdzić się do szkiełka nakrywki przez 15 minut.
  8. Wypłukać nadmiar DNA za pomocą 1x PBS.
  9. Dodać superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną (kuleczki 1 μm = 2 μg mL-1; kuleczki 2,8 μm = 20 μg mL-1) i pozwolić im przytwierdzić się do unieruchomionego DNA przez 15 minut.
  10. Wypłukać nadmiar kuleczek za pomocą 1x PBS.
  11. Kalibracja pęset magnetycznych
    1. Przesunąć trwałe magnesy w pozycję oddaloną od powierzchni próbki (>15 mm).
    2. Umieścić przygotowaną komorę przepływową w mikroskopie.
    3. Przesunąć trwałe magnesy w pozycję nad komorą przepływową.
    4. Wybrać płaszczyznę ogniskową kuleczek funkcjonalizowanych λ-DNA, ustawiając ostrość na kuleczkach z dala od obu szklanych powierzchni. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowa to taka, w której pożądane kuleczki mają jasne centrum.
    5. Nagrać wideo ruchu kuleczek z częstotliwością 80 Hz lub większą przez 500 klatek.
    6. Przesunąć magnes bliżej powierzchni próbki. Dla odległości powyżej 5 mm przesuwać w przyrostach 1 mm. Dla odległości między 1 a 5 mm przesuwać w przyrostach 0,5 mm. Dla odległości mniejszych niż 1 mm przesuwać w przyrostach 0,25 mm.
    7. Powtórzyć kroki 2.11.5 i 2.11.6 dla każdej nowej pozycji magnesu.
    8. Dla każdego zestawu danych śledzić centrum kuleczek za pomocą dopasowania gaussowskiego 2D.
    9. Obliczyć siłę poprzez fluktuacje Browna, korzystając z wzoru:

    Wzór równowagi sił F=kBT*L/⟨x²⟩; mechanika statystyczna, fluktuacje termiczne.
    gdzie kBT to termiczna energia Boltzmanna, L to długość λ-DNA, a 2> to wariancja pozycji centroidu.
    1. Potwierdzić dokładność sił, sprawdzając obliczenia siły poprzez dopasowanie lorentzowskie widma mocy w celu znalezienia częstotliwości odcięcia. Przyłożona siła jest powiązana z częstotliwością odcięcia zależnością:

    Równanie dynamiki płynów, wzór F = 12π²μaf₀L, związane z analizą oporu przepływu.
    gdzie ƒ0 to częstotliwość odcięcia, a to promień kuleczki, a μ to lepkość cieczy12.

3. Mocowanie peptydów kolagenowych do komór przepływowych

Aby przedstawić konkretny przykład zastosowania naszej metodologii, opisujemy niedawne prace w naszym laboratorium, które charakteryzują proteolizę trymerycznego peptydowego modelu kolagenu. Przewidujemy, że to ogólne podejście może znaleźć szerokie zastosowanie w przypadku innych białek i polinukleotydów.

  1. Modelowy peptyd kolagenowy składa się z N-terminalny znacznik 6x His do oczyszczania, po którym następuje 5x myc znacznik, (GPP)10 Aby wymusić formowanie potrójnej helisy, zastosowano reszty 772-786 kolagenu α1 (GPQGIAGQRGVVGL), które tworzą miejsce rozpoznawania MMP-1, sekwencję foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) oraz C-terminalny KKCK w celu ułatwienia znakowania biotyną-maleimidem. Foldon pochodzi z białka fibrytyny bakteriofaga T4 i stabilizuje trimery modelu kolagenu po połączeniu z końcem N- lub Ckoniec13,14.
  2. Peptyd kolagenowy oraz białka MMP-1 wyekspresowano i oczyszczono zgodnie z wcześniejszym opisem4,15.
  3. Dodaj przeciwciałomyc (15 μg ml-1) do komórki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić przeciwciałom anty-myc do przytwierdzenia do powierzchni komórki przepływowej.
  4. Pasywuj komórkę przepływową za pomocą 5 mg/ml, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek.-1 BSA w ten sam sposób, jak opisano w kroku 2.5.
  5. Dodaj 150 pM peptydu kolagenowego i pozwól mu przyłączyć się do przeciwciała za pomocą myc inkubować przez 45 minut.
  6. Wypłukać nadmiar kolagenu, używając buforu PBS.
  7. Dodaj superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną (1 μm kuleczki 2 μg ml-1i 2.8 μm koraliki = 20 μg ml-1) i pozostawić je na 45 minut w celu przywiązania do cząsteczek kolagenu. 1 μm kuleczki należy rozcieńczyć do pożądanego stężenia w PBS. 3 μm Kuleczki należy oddzielić od roztworu za pomocą silnych magnesów, a następnie ponownie rozpuścić w PBS. Proces ten należy powtórzyć 3 razy. Zauważyliśmy, że krok ten jest niezbędny do uzyskania 3 μm kuleczki do wiązania z unieruchomionym na powierzchni peptydem kolagenowym.

4. Analiza wymuszonej proteolizy

  1. Po zmontowaniu komórki przepływowej z peptydem kolagenowym i kuleczkami magnetycznymi, obrazuj komórkę w pułapce magnetycznej przy niskiej sile, około 1 pN. Z naszego doświadczenia wynika, że subpopulacja kuleczek czasami słabo przylega do powierzchni w sposób niespecyficzny. Przyłożenie niewielkiej siły zapewnia uwolnienie tych kuleczek.
  2. Dodaj aktywowany enzym do komórki przepływowej. W tym przypadku MMP-1 został uprzednio aktywowany poprzez dodanie 3,5 mM APMA (octan 4-aminofenylowego rtęciowego) i inkubowany w 37 °C przez 3 godziny. Aktywację zweryfikowano za pomocą SDS-PAGE.
  3. Natychmiast po ponownym wprowadzeniu komórki przepływowej do aparatu pęsety magnetycznej, zarejestruj wideo obejmujące kilka pól widzenia, co zazwyczaj pozwala uzyskać kilkaset przyczepionych kuleczek. Będzie to czas t = 0.
  4. Powtarzaj proces rejestrowania kilku pól widzenia (powracając do tego samego pola widzenia) w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie kuleczki się odczepią lub aż proteoliza nie będzie już zauważalna.
  5. Analiza danych kinetycznych
    1. Policz kuleczki w różnych polach widzenia w różnych punktach czasowych i oblicz ich średnią. Znormalizuj liczbę kuleczek, dzieląc średnią liczbę kuleczek w każdym punkcie czasowym przez liczbę kuleczek w t = 0. Zapewnia to możliwość porównania szybkości proteolizy z różnych eksperymentów, ponieważ absolutna liczba kuleczek będzie różnić się od doświadczenia do doświadczenia.
    2. Przedstaw ten stosunek jako funkcję czasu. W tym przypadku dopasowaliśmy go do funkcji wykładniczego zaniku z dodatkiem stałej.

    Wzór na zanik wykładniczy, f(t)=ae^(-bt)+c, stosowany w modelowaniu matematycznym i analizie.
    gdzie ƒ(t) to stosunek kuleczek przyczepionych (lub nieproteolizowanych cząsteczek kolagenu), t to czas, a to frakcja kuleczek przyczepionych za pomocą wiązania kolagenowego, b to stała szybkości zaniku, a c to frakcja kuleczek przyczepionych niespecyficznie.
    1. Ten sam eksperyment powtórz przy różnych wartościach siły i stężeniach MMP-1, aby wyjaśnić wpływ siły na proteolizę kolagenu przez MMP-1.

5. Reprezentatywne wyniki

Powyższy protokół opisuje nowatorskie zastosowanie pęset magnetycznych (Rysunek 1) do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną. Kalibrację pęset dla kulek o średnicach 1 μm i 3 μm przeprowadzono, wykorzystując zarówno amplitudę obserwowanych fluktuacji Browna, jak i obliczenie częstotliwości spadkowej (roll-off frequency) dla różnych pozycji magnesu (Rysunek 2). W eksperymentach z proteolizy pod wpływem siły układ jest analogiczny, z wyjątkiem zastąpienia DNA kolagenem (Rysunki 3, 4). Znormalizowaną liczbę pozostałych kulek można przedstawić jako funkcję czasu, aby wyznaczyć szybkość proteolizy (Rysunek 5); proces ten można powtarzać dla różnych stężeń enzymu i różnych sił.

Schemat pęsety magnetycznej, DNA lambda rozciągnięte siłą, powierzchnia pokryta BSA, układ eksperymentalny.
Rycina 1. Schemat procesu kalibracji pułapki magnetycznej (nie w skali). Dwa stałe magnesy ziem rzadkich wytwarzają pole magnetyczne, które oddziałuje na superparamagnetyczną kuleczkę. Przesuwanie magnesu w górę i w dół reguluje przyłożoną siłę. Obrazy kuleczek są rejestrowane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu w jasnym polu, przy czym światło przechodzi przez otwór między dwoma magnesami. Wstawka: Obraz wykonany obiektywem powietrznym 40x. Ostre, okrągłe punkty odpowiadają kuleczkom przytwierdzonym do powierzchni szkiełka podstawowego. Obiekty poza ogniskowaniem to kuleczki oderwane od powierzchni.

Wykres siła-odległość, wpływ pola magnetycznego na cząstki o rozmiarach 1,0 µm i 2,8 µm; wynik analizy danych.
Rysunek 2. Wykresy skalibrowanej siły w funkcji odległości magnesu od powierzchni próbki dla kulek o średnicach 1 μm (lewo) i 2,8 μm (prawo). Dane dopasowano do funkcji empirycznej Równanie równowagi statycznej; siła=a/(x^2+bx+c); wzór z fizyki; analiza matematyczna., gdzie x oznacza odległość od magnesu. Dla kulek 1 μm a = 31,8, b= 5,61 oraz c = 4,39, a dla kulek 3 μm a = 140, b = 3,10 oraz c = 1,86. Wartości te są charakterystyczne dla naszego konkretnego urządzenia i geometrii eksperymentalnej; każde urządzenie powinno być kalibrowane indywidualnie. Słupki błędów dla każdego punktu reprezentują ~10% zmienności siły przyłożonej do poszczególnych kulek, wynikającą ze zmienności ich rozmiaru. Przyłożona siła jest proporcjonalna do objętości kulek, a objętość kulek różni się o ~9% względem średniej (zgodnie ze specyfikacją producenta).

Macierz nanoprętów magnetycznych, równowaga statyczna, schemat, wyrównane dipole w zewnętrznym polu magnetycznym.
Rysunek 3. Układ testu proteolizy wymuszonej siłowo (Nie w skali). Model trimeru kolagenu jest przytwierdzony do powierzchni szkiełka podstawowego za pomocą konjugacji myc/anty-myc. Superparamagnetyczne koraliki pokryte streptawidyną są przyłączone do trimerów kolagenu poprzez wiązanie biotyna-streptawidyna. Aktywne MMP-1 przecina kolagen w czasie, co powoduje odrywanie się koralików od powierzchni i ich przemieszczanie się poza płaszczyznę ogniskowania.

Schemat procesu dyfuzji z rozprzestrzenianiem się cząsteczek w czasie w odstępach od t0 do tf.
Rysunek 4. Schematyczny rysunek proteolizy w funkcji czasu. Rysunek przedstawia pole widzenia próbki w czasie, w którym zachodzi proteoliza. Z czasem MMP-1 przecina kolagen, a kuleczki odrywają się i oddalają od płaszczyzny ogniskowania pod wpływem pola magnetycznego.

wykres szybkości degradacji kolagenu; słupki błędów; czas w minutach; analiza kinetyczna stabilności kolagenu
Rysunek 5. Szybkości proteolizy zależą od przyłożonej siły16. Przedstawiono dane zebrane dla 1,0 pN (3 μM MMP-1; czarny), 6,2 pN (3 μM MMP-1; czerwony) oraz 13 pN (0,2 μM MMP-1; magenta). Szybkości proteolizy (parametry dopasowania) wynoszą: 0,22 ± 0,02 min-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min-1 (6,2 pN) oraz 2,08 ± 0,18 min-1 (13 pN). Frakcja kulek niepoddanych proteolizie w późnych punktach czasowych (> 15 minut) pozostaje w przybliżeniu stała na poziomie ~0,25 w różnych eksperymentach. Słupki błędów odpowiadają statystyce Poissona odzwierciedlającej liczbę obserwacji w każdym punkcie czasowym. Błąd w każdym punkcie czasowym dla n kulek wynosi n1/2. Błąd frakcji przyłączonych kulek obliczono metodą propagacji błędów. W eksperymentach dla 1,0 pN i 6,2 pN zastosowano kulek o średnicy 1 μm, a w eksperymentach dla 13 pN zastosowano kulek o średnicy 2,8 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje nowe zastosowanie klasycznej techniki pojedynczych cząsteczek. Pincety magnetyczne umożliwiają prowadzenie analiz pojedynczych cząsteczek o średniej i wysokiej przepustowości w sposób kosztowo efektywny. Jednakże, jak w przypadku wszystkich technik eksperymentalnych, istnieją wyzwania i potencjalne problemy.

Ograniczenia pęset magnetycznych

W porównaniu z pułapką optyczną rozdzielczość przestrzenna i czasowa aparatury MT jest niska. Co więcej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface (A.R.D.), National Institutes of Health w ramach programu NIH Director's New Innovator Award 1-DP2-OD007078 (A.R.D.), William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (A.S.A.) oraz Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (J.C.). Autorzy dziękują Jamesowi Spudichowi za udostępnienie sprzętu mikroskopowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe nr 1,5 (22x22)VWR48366-067
Kryszka szkiełkowa nr 1,5 (22x40)VWR48393-048
DNA lambdaInvitrogen25250-010
Ligaza DNA T4Invitrogen15224-041
Microcon Ultracel YM-100Millipore42413
Przeciwciało anty-digoksigeninaRoche Diagnostics11-333-089-001
Tween 20SigmaP9416-100ML
Przeciw-myc PrzeciwciałoInvitrogen46-0603
Seryjny albuminy wołowejSigmaB4287-5G
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen658.01D
Dynabeads MyOne T1 StreptavidinInvitrogen658.01D
Octan p-aminofenylortęciCalbiochem164610
Biotyna-maleimidSigma AldrichB1267
Oligonukleotyd znakowany biotynąDNA firmy IDTSynteza na zamówienie
Oligo znakowane digoksigeninąDNA marki IDTSynteza na zamówienie
Gen peptydu kolagenuDNA 2.0Synteza na zamówienie
cDNA MMP-1Harvardzka Baza Danych Plazmidów
tłumacz zThorlabsMTS50
Sterownik serwo dla tłumaczaThorlabsTDC001

Bibliografia

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
  3. Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
  4. Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
  5. Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
  6. Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
  7. Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
  10. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  11. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
  13. Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
  14. Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
  15. Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
  16. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  17. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  18. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
  19. Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
  20. Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
  21. Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
  22. del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
  23. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

peptyd kolagenowymetaloproteinaza macierzy 1odczepianie kulekprzygotowanie komory przepływowejkinetyka enzymatycznarozszczepianie białekanaliza biofizyczna
Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.