SurgiLux: przygotowanie i demonstracja aktywowanej laserowo cienkiej powłoki chirurgicznego kleju na bazie chitosanu

Podsumowanie

Opisano proces wytwarzania nowego, elastycznego chirurgicznego kleju w formie cienkiej warstwy z zatwierdzonych przez FDA składników: chitosanu oraz zieleni indocyjaninowej. Zademonstrowano wiązanie tego kleju z tkanką kolagenową poprzez prosty proces aktywacji z użyciem niskomocnego lasera podczerwonego.

Streszczenie

Szwy to technologia sprzed 4 000 lat, która dzięki swojej wytrzymałości naprawczej (~100 KPa) pozostaje „złotym standardem” w zamykaniu ran. Jednak szwy mogą stanowić ognisko infekcji, a w wielu procedurach nie są w stanie zapewnić naprawy rany lub zakłócają funkcjonalną regenerację tkanki.¹ Jako alternatywy dla szwów w naprawie takich ran opracowano chirurgiczne kleje i spoiwa, takie jak te oparte na fibrynie i cyjanoakrylanach. Niemniej jednak obecne komercyjne kleje również mają istotne wady, począwszy od transferu wirusów i prionów oraz braku wytrzymałości naprawczej w przypadku klejów fibrynowych, aż po toksyczność tkankową i brak biokompatybilności w przypadku klejów opartych na cyjanoakrylanach. Ponadto obecnie dostępne kleje chirurgiczne mają zazwyczaj postać żelu i mogą charakteryzować się długim czasem utwardzania, co ogranicza ich zastosowanie.² Podobnie wykorzystanie laserów UV w celu ułatwienia mechanizmów sieciowania w „lutowniczych” preparatach białkowych lub albuminowych może prowadzić do uszkodzenia DNA, natomiast laserowe spawanie tkanek (LTW) predysponuje do uszkodzeń termicznych tkanek.³ Pomimo tych wad, kleje i LTW przejęły około 30% rynku zamykania ran, którego wartość szacuje się na ponad 5 miliardów USD rocznie, co jest znaczącym dowodem na zapotrzebowanie na technologie bezszwowe.⁴

W dążeniu do opracowania technologii bezszwowej wykorzystaliśmy chitosan jako biomateriał do stworzenia elastycznego, cienkiego filmu w postaci aktywnego laserowo kleju chirurgicznego o nazwie „SurgiLux”. Ten nowatorski bioklej wykorzystuje unikalną kombinację biomateriałów i fotoniki, które posiadają zatwierdzenie FDA i są z powodzeniem stosowane w różnych produktach i zastosowaniach biomedycznych. SurgiLux eliminuje wszystkie wady związane ze szwami oraz obecnymi klejami chirurgicznymi (patrz Tabela 1).

W niniejszej prezentacji opisujemy stosunkowo prosty protokół wytwarzania SurgiLux oraz demonstrujemy jego aktywację laserową i wytrzymałość spoiny tkankowej. Filmy SurgiLux przylegają do tkanki kolagenowej bez modyfikacji chemicznych, takich jak sieciowanie, a za pomocą naświetlania przy użyciu laserowego promieniowania podczerwonego o stosunkowo niskiej mocy (120 mW) zamiast światła UV. Filmy chitozanowe wykazują naturalne, lecz słabe przyciąganie adhezyjne do kolagenu (~3 KPa); aktywacja laserowa filmów SurgiLux na bazie chitozanu wzmacnia siłę tej adhezji poprzez oddziaływania łańcuchów polimerowych w wyniku przejściowej rozszerzalności cieplnej.⁵ Bez tego procesu „aktywacji” filmy SurgiLux są łatwo usuwalne.^6-9 SurgiLux został przetestowany zarówno in vitro, jak i in vivo na różnych tkankach, w tym na nerwach, jelitach, oponie twardej i rogówce. We wszystkich przypadkach wykazał dobrą biokompatybilność oraz pomijalne uszkodzenia termiczne w wyniku naświetlania.^6-10

Protokół

1. Przygotowanie roztworu SurgiLux

1. Przygotować 2% (v/v) roztwór kwasu octowego w wodzie dejonizowanej w czystym zlewce szklanym; w celu uniknięcia kontaminacji należy pracować w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Odważyć 0,02% (w/v) chromoforu, indocyjaniny zielonej (ICG), do sterylnej probówki Eppendorf; probówkę należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec przenikaniu światła.
3. Za pomocą czystej, jednorazowej pipety przenieść około 1 ml rozcieńczonego roztworu kwasu octowego do probówki w celu rozpuszczenia barwnika, delikatnie wstrząsnąć i pozostawić owiniętą w folii.
4. Przenieść rozpuszczony ICG do zlewki i dodać 2% (w/v) proszku chitozanu, a następnie wprowadzić sterylny mieszadło magnetyczne.
5. Przykryć zlewkę Parafilmem, a następnie owinąć folią aluminiową; zawartość mieszać z prędkością około 125 rpm przez 72 hr w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
6. Przenieść zawartość do czystych probówek do wirowania i wirować przy 15,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
7. Ostrożnie przenieść zielony roztwór SurgiLux do czystej zlewki szklanej, przykryć Parafilmem, a następnie owinąć folią aluminiową i przechowywać w lodówce przez 12 hr w celu zwiększenia lepkości roztworu.

2. Odlewanie błon SurgiLux

1. Za pomocą sterylnej strzykawki nalać 8 ml schłodzonego roztworu SurgiLux do czystej szalki Petriego o średnicy 95 mm, a następnie delikatnie przechylić szalkę, aby zapewnić całkowite pokrycie jej powierzchni roztworem. Zmiana stosunku objętości roztworu do powierzchni odlewu pozwala na kontrolę grubości filmu, patrz Rysunek 1.
2. Usunąć widoczne pęcherzyki powietrza z roztworu za pomocą końcówki sterylnej igły. Przykryć szalkę folią aluminiową i umieścić w lodówce w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków o rozmiarach mikronowych.
3. Po 20 min ostrożnie wyjąć szalkę Petriego z lodówki, umieścić ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przykryć folią aluminiową i pozostawić roztwór do odparowania na 3 tygodnie.
4. Po całkowitym odparowaniu naciąć krawędzie przezroczystego zielonego filmu SurgiLux w szalce Petriego i delikatnie „odkleić” film od powierzchni szalki.
5. Film SurgiLux powinien być elastyczny i łatwy do manipulowania bez rozrywania lub łamania.
6. Przechowywać okrągłe filmy SurgiLux w szalce Petriego zawiniętej w folię aluminiową w suchych warunkach do momentu użycia.

3. Aktywacja laserowa folii adhezyjnych SurgiLux

1. Aby zademonstrować proces aktywacji laserowej, użyjemy fragmentu tkanki bydlęcej, np. steka, dociętego do rozmiaru 15 mm szerokości i 20 mm długości. Przetnij tkankę w linii prostej za pomocą skalpela nr 10, aby uzyskać 2 kawałki o wymiarach 15 na 10 mm.
2. Zbliż dwa fragmenty tkanki tak, aby ich krawędzie się stykały, ale nie nakładały na siebie, a następnie za pomocą patyczka higienicznego lub gazy delikatnie wchłoń nadmiar płynu.
3. Następnie wytnij fragment folii SurgiLux o wymiarach 7 x 9 mm i ostrożnie ułóż folię wzdłuż przeciętej tkanki; następnie delikatnie dociśnij ją suchym patyczkiem higienicznym.
4. Folie SurgiLux są aktywowane za pomocą podczerwonego lasera diodowego przy ustawieniu 120 mW. Ponieważ jest to laser klasy IIIB, należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa, w tym zapewnienie wszystkim osobom obecnym odpowiednich okularów ochronnych.
5. Zaczynając od rogu, naświetl folię SurgiLux laserem podczerwonym ustawionym na 120 mW z średnicą plamki wiązki 1 mm. Przesuwaj plamkę wiązki po zielonej folii z prędkością około 1 mm na sekundę. Powtórz proces naświetlania jeszcze dwa razy.

4. Wytrzymałość naprawy

1. Koniec tkanki należy starannie zamocować w uchwytach urządzenia do badań wytrzymałości na rozciąganie. W tym doświadczeniu wykorzystano system Instron Mini55 z ogniwem obciążeniowym 50 Newton. Maksymalne obciążenie, wytrzymałość na rozciąganie oraz wydłużenie przy zerwaniu obliczono przy użyciu oprogramowania komputerowego Bluehill (USA). Wyznaczono średnie z co najmniej 10 próbek (n = 10).
2. Należy usunąć luz, a następnie rozdzielać fragmenty tkanki z prędkością 1 mm na sekundę, aż do całkowitego rozdzielenia dwóch kawałków tkanki połączonych paskiem SurgiLux.

Wyniki

Wirowanie prowadzi do otrzymania przezroczystego zielonego roztworu, którego lepkość wzrasta po przechowywaniu w temperaturze 4-6 °C. Po odstawieniu na 3 tygodnie zielony roztwór przekształca się w przezroczystą zieloną błonę SurgiLux o grubości około 20 mikronów, która, jak pokazano na filmie, jest łatwo elastyczna.

Po naświetleniu laserem folia SurgiLux wiąże się z tkanką. Można to zaobserwować na krawędziach folii, gdzie tkanka zdaje się kurczyć podczas przechodzenia wiązki lasera nad folią...

Dyskusja

Chitozan może być dostępny w różnych zakresach masy cząsteczkowej i z różnym stopniem deacetylacji (DDA). Zróżnicowanie czystości chitozanu może prowadzić do obecności cząstek w roztworze SurgiLux; w celu ich usunięcia stosuje się wirowanie, co powinno doprowadzić do uzyskania przejrzystego zielonego roztworu. Jednak jako dodatkowy lub alternatywny etap przygotowania można zastosować również filtrację. Podobnie jak w przypadku każdego procesu przetwarzania materiałów, różnice takie jak DDA i masa cząsteczkowa chitozanu m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chitosan	Sigma-Aldrich	448877
Zieleń indocyjaninowa	Sigma-Aldrich	I2633	Znana również jako Cardiogreen
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	320099
Podczerwony laser diodowy z dostarczaniem światłowodowym (808 nm, 120 mW, rdzeń wiązki 200 μm)	CNI Lasers	Fc-808	System zmienny o mocy do 5 W
Okulary ochronne do laserów	CNI Lasers	LS-G
Aparat do badań rozciągania	Instron Pty Ltd	5542	Czujnik siły 50 N