Indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Podsumowanie

Opisujemy protokół wykorzystania białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) lub Matrigelu do selektywnego indukowania wzrostu dendrytów w pierwotnych neuronach współczulnych rozdzielonych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczurów perinatalnych.

Streszczenie

Kształt drzewka dendrytycznego determinuje całkowitą sumę sygnałów synaptycznych, jakie może odebrać neuron ^1-3, oraz wpływa na rodzaje i rozkład tych sygnałów ^4-6. Zmienione wzorce wzrostu i plastyczności dendrytów są powiązane z zaburzeniami funkcji neurobehawioralnych w modelach eksperymentalnych ⁷ i uważa się, że przyczyniają się do objawów klinicznych obserwowanych zarówno w zaburzeniach neurorozwojowych ^8-10, jak i w chorobach neurodegeneracyjnych ^11-13. Takie obserwacje podkreślają funkcjonalne znaczenie precyzyjnej regulacji morfologii dendrytów i sugerują, że zidentyfikowanie mechanizmów kontrolujących wzrost dendrytów nie tylko poszerzy wiedzę o tym, jak regulowana jest łączność neuronalna podczas prawidłowego rozwoju, ale może również dostarczyć informacji na temat nowych strategii terapeutycznych w różnych chorobach neurologicznych.

Badania mechanistyczne nad wzrostem dendrytów zostałyby znacznie ułatwione dzięki dostępności systemu modelowego, który pozwala na eksperymentalne przełączenie neuronów ze stanu, w którym nie rozwijają one dendrytów, do stanu, w którym tworzą one drzewo dendrytyczne porównywalne z tym u ich odpowiedników in vivo. Takim modelem są kultury pierwotne neuronów współczulnych wyizolowanych z zwojów szyjnych górnych (SCG) gryzoni perinatalnych. Hodowane w zdefiniowanym medium, w obecności serum i gliozy zwojowej, neurony współczulne rozwijają pojedynczy wypustek o charakterze aksonalnym, a ten stan unipolarny utrzymuje się w kulturze od kilku tygodni do kilku miesięcy ^14,15. Jednak dodanie do medium hodowlanego białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) ^16,17 lub Matrigelu ¹⁸ pobudza te neurony do wytworzenia wielu wypustek spełniających morfologiczne, biochemiczne i funkcjonalne kryteria dendrytów. Neurony współczulne wyizolowane z SCG gryzoni perinatalnych i hodowane w zdefiniowanych warunkach stanowią jednorodną populację neuronów ¹⁹, które reagują jednolicie na aktywność pro-dendrytyczną Matrigelu, BMP-7 oraz innych BMP z podrodzin decapentaplegic (dpp) i 60A ^17,18,20,21. Co istotne, indukowany przez Matrigel i BMP proces tworzenia dendrytów zachodzi bez zmian w przeżywalności komórek lub wzroście aksonów ^17,18.

W niniejszej pracy opisujemy sposób przygotowania dysocjowanych kultur neuronów współczulnych pochodzących z zwojów szyjnych gwiazdowatych (SCG) szczurów perinatalnych, tak aby były one podatne na selektywną aktywność promującą wzrost dendrytów Matrigelu lub BMP.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej (pożywka C2)

1. Do sterylnej, jednorazowej kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml dodać następujące składniki w podanej kolejności:

   Ilość	Składnik	Stężenie końcowe
   190 ml	DMEM (low glucose)	N/A
   10 ml	BSA wolna od kwasów tłuszczowych (20mg/ml w DMEM)	50 μg/ml
   2.8 ml	L-Glutamine	1.4 mM
   4 ml	insulin/transferrin/selenium(100x)	10 μg/ml insulin 5.5 μg/ml transferrin 38.7 nM selenium
   0.4 ml	NGF (125 μg/ml)	100 ng/ml
   200 ml	Ham F-12	N/A

2. Delikatnie wymieszać przez zamieszanie kolby i rozdzielić po 10 ml do sterylnych probówek z nakrętką typu snap cap o rozmiarze 17 x 100.
3. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Ważne uwagi:
   • Odpowiednio rozmrozić NGF bezpośrednio przed użyciem.
   • Przed rozdzielaniem roztworu stokowego NGF należy pokryć wewnętrzne ścianki plastikowej pipety serologicznej do hodowli tkanek białkiem, aby zminimalizować przyleganie NGF do plastiku. Najprostszym sposobem jest kilkukrotne pipetowanie mieszaniny DMEM zawierającej BSA. Przespłukać probówkę z NGF kilkukrotnie mieszaniną DMEM.
   • F-12 należy dodawać na końcu, ponieważ wolna cysteina może destabilizować wiązania dwusiarczkowe w insulinie.
   • Nie mrozić w objętościach przekraczających 10 ml, ponieważ mogą powstać kryształy CaPO₄.
   • Nie poddawać pożywki C2 cyklom zamrażania i rozmrażania więcej niż 2 razy.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

1. Ustalono, że w niniejszym protokole spójne wyniki dają wyłącznie wysokiej jakości niemieckie szkiełka podstawowe (zalecany dostawca i numer katalogowy znajdują się w Tabeli 1).
2. Do szklanych butelek na próbki o pojemności 300 ml z wkładkami do nakrętek z politetrafluoroetylenu (PTFE lub Teflon) (Fisher nr kat. 09-911-765) wlać 75-100 ml 70% kwasu azotowego.
3. Używając rękawiczek, wkładać pojedynczo szkiełka podstawowe do roztworu kwasu azotowego. Dodać tyle szkiełek, aby na dnie naczynia utworzyła się warstwa o grubości nie więcej niż 2-3 szkiełka.
4. Delikatnie wstrząsać naczyniami ze szkiełkami przez 6-8 godzin w temperaturze pokojowej na wytrząsace orbitalnym ustawionym na prędkość nieprzekraczającą 185 rpm.
5. Pracując pod wyciągiem, ostrożnie zlać kwas i zutylizować go zgodnie z lokalnymi przepisami. Jednokrotnie przepłukać szkiełka ultra czystą wodą klasy do hodowli tkankowej, a następnie dodać do naczynia 75-100 ml wody. Jeśli woda stanie się mętna, szkiełka można płukać wielokrotnie. Delikatnie wstrząsać w temperaturze pokojowej przez noc na wytrząsace orbitalnym ustawionym na prędkość nieprzekraczającą 185 rpm.
6. Powtarzać powyższą sekwencję z użyciem kwasu azotowego i wody klasy do hodowli tkankowej codziennie przez łącznie 3 dni.
7. Zlać ostatnią porcję wody klasy do hodowli tkankowej i dodać tyle acetonu, aby ledwo przykryć szkiełka.
8. Zlać aceton i zutylizować go w odpowiedni sposób.
9. Przenieść szkiełka do szklanej szalki Petriego o średnicy 150 mm. Dodać tyle acetonu, aby ledwo przykryć szkiełka. Upewnić się, że szkiełka w szalce znajdują się w jednej warstwie.
10. Pozostawić aceton do odparowania przez noc pod wyciągiem.
11. Wypalić szkiełka w suszarce w temperaturze 180 °C przez 1,5 godziny w celu sterylizacji.

3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do hodowli

1. Dzień przed sekcją, przy użyciu sterylnej techniki, do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek należy dodać 1 szkiełko nakrywki (przygotowane zgodnie z powyższym opisem). Do każdego dołka należy dodać 200 μl sterylnego roztworu poli-D-lizyny (100 mg/ml w 0,5 M buforze Tris, pH 8) i przechowywać płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
2. W dniu sekcji, a najlepiej przed jej rozpoczęciem, należy odessać roztwór poli-D-lizyny z każdego dołka i przemyć każdy dołek 5 razy sterylną wodą jakości do hodowli tkanek.
3. Do każdego dołka należy dodać 200 μl DMEM o niskiej zawartości glukozy i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Około 1 godziny przed wysianiem komórek należy usunąć DMEM o niskiej zawartości glukozy i dodać 250 μl pożywki C2 na dołek. Płytki należy przechowywać w 37 °C pod kątem 5% CO₂ aż do momentu wysiewania komórek.

4. Disekcja i izolacja zwoju szyjnego górnego

1. Dysocjowane hodowle neuronów współczulnych są zazwyczaj przygotowywane poprzez dysocjację zwojów szyjnych górnych (SCG) pobranych od prenatalnych szczątek szczurzych (dni embrionalne 19-21), ponieważ zawierają one mniej komórek glejowych. Jednak ten sam protokół można z sukcesem zastosować u szczurzyąt wczesnopostnatalnych (w wieku 1 do 3 dni) lub perinatalnych myszy.
2. Eutanazję ciężarnej szczurzycy przeprowadza się poprzez inhalację CO₂. Należy ogolić brzuch i przemyć skórę 70% etanolem. Rogi macicy należy usunąć w warunkach sterylnych i umieścić w sterylnym naczyniu Petriego o średnicy 150 mm. Podczas sekcji należy unikać uszkodzenia jelit lub innych narządów wewnętrznych matki.
3. Naczynie Petriego z płodami należy umieścić na tacy z lodem w celu znieczulenia embrionów. Embriony należy wyciąć z rogu macicy i błon owodniowych. Aby przeprowadzić eutanazję płodów, należy przeciąć rdzeń kręgowy każdego szczurzątka wzdłuż linii środkowej poniżej barku. Powoduje to również przerwanie żyły głównej dolnej, co ogranicza krwawienie z tętnicy szyjnej podczas sekcji SCG. Po uwolnieniu z rogu macicy embriony należy umieścić w sterylnym medium Leibovitz's L-15 (lub jakimkolwiek medium buforowanym powietrzem) uzupełnionym o penicylinę i streptomycynę.
4. Embriony należy ułożyć na plecach w naczyniu Petriego o średnicy 150 mm wypełnionym w połowie Sylgardem. Używając sterylnych igieł 20 G, należy przypiąć klatkę piersiową i głowę, delikatnie wyprostowując kark, co ułatwia sekcję SCG.
5. Należy wykonać nacięcie w linii środkowej wzdłuż szyi na poziomie obojczyków, aby odsłonić ślinianki podżuchwowe. Gruczoły należy usunąć za pomocą precyzyjnej pęsety (Dumont nr 4 lub nr 5), aby odsłonić warstwę mięśniową.
6. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy przeciąć mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowaty w pobliżu obojczyka. Następnie należy delikatnie unieść i naciąć mięsień obręczowo-gnykowy obok tchawicy. Mięsień ten jest bardzo cienki, dlatego należy unikać zbyt głębokiego cięcia, aby nie przerwać leżącej pod nim tętnicy szyjnej i SCG. Po usunięciu tych warstw mięśniowych tętnica szyjna i nerw błędny powinny być wyraźnie widoczne.
7. SCG znajduje się tuż poniżej rozwidlenia tętnicy szyjnej. Używając precyzyjnej pęsety (nr 4 lub nr 5), należy przeprowadzić tępe rozdzielenie tkanek po obu stronach tętnicy szyjnej, aby odsłonić zwoj. Używając dwóch precyzyjnych pęset, należy chwycić tętnicę szyjną odpowiednio powyżej i poniżej końców rostralnego i kaudalnego SCG, aby usunąć odcinek tętnicy szyjnej leżący nad SCG oraz sam SCG. Prawdopodobnie w tym kroku zostanie również usunięty zwoj węzłowy, który na tym etapie rozwoju znajduje się obok SCG. Zwoje węzłowe można zidentyfikować po okrągłym kształcie i dużym nerwie błędnym z nich odchodzącym. Znajduje się on wzdłuż jednej z gałęzi tętnicy szyjnej. W przeciwieństwie do niego, SCG ma kształt migdała i leży bezpośrednio pod rozwidleniem tętnicy szyjnej. Wyciętą tkankę należy umieścić w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm zawierającym medium L-15 i antybiotyki. Należy pobrać SCG od wszystkich szczurząt przed przejściem do kolejnych kroków.
8. Używając precyzyjnej pęsety, należy delikatnie oddzielić SCG od tętnicy szyjnej i wszelkich innych tkanek usuniętych podczas sekcji (w szczególności od nerwu błędnego i zwoju węzłowego). Za pomocą precyzyjnej pęsety należy usunąć torebkę ze zwojów. Znacznie redukuje to liczbę komórek nieneuronalnych w hodowli. Zwoje należy przenieść do innego sterylnego naczynia o średnicy 35 mm zawierającego medium L-15.
9. Aby zdysocjować SCG, należy usunąć medium L-15 i zastąpić je 2 ml kolagenazy (stężenie końcowe 1 mg/ml)/dispazy (stężenie końcowe 5 mg/ml) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez jonów wapnia i magnezu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
10. SCG należy przenieść do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i uzupełnić objętość do 10 ml medium L-15 z dodatkiem BSA (stężenie końcowe 1-2 mg/ml). Wirować przy 200 X g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć jeszcze raz medium L-15 z dodatkiem BSA.
11. Po drugim przemyciu należy usunąć całe medium L-15 i resuspendować zwoje w ~2 ml medium C2. Komórki należy triturgetować za pomocą wypalanej pipety o zgiętym końcu, upewniając się, że pipeta jest pokryta BSA/L15 przed triturgetacją, aby zminimalizować przywieranie komórek do szkła. Triturgetować delikatnie 3-4 razy. Pozostawić duże grudki na około 1 minutę i przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml. Do pozostałych SCG dodać więcej medium C2 i ponownie triturgetować. Po opadnięciu grudek przenieść zawiesinę komórkową z drugiej triturgetacji do tej zebranej po pierwszej. Powtarzać ten proces kilka razy, aż zwoje zostaną w większości zdysocjowane. Wszelkie pozostałe grudki należy odrzucić po czwartej triturgetacji.
12. W przypadku komórek zdysocjowanych z jednego miotu szczurząt (zazwyczaj 12-16 osobników), całkowitą objętość medium w zawiesinie komórkowej należy zwiększyć do 8-10 ml poprzez dodanie dodatkowego medium C2. Delikatnie resuspendować komórki za pomocą pipety i pobrać niewielką alikwot w celu oznaczenia gęstości komórek. Dostosować objętość zawiesiny komórkowej tak, aby uzyskać 2-krotną gęstość komórek pożądaną w hodowli, a następnie, dbając o utrzymanie komórek w zawiesinie, nanieść 250 µl zawiesiny komórkowej na każdą studnią. Dla badań morfometrycznych wzrostu dendrytów zazwyczaj wysiewamy komórki o niskiej gęstości (~5 x 10⁴ komórek na studnię) na płytkach 24-dołkowych.
13. W naszym laboratorium hodowle SCG inkubujemy w szklanych deskryptorach, a nie bezpośrednio w inkubatorze CO₂. Robimy to, ponieważ neurony współczulne hodowane w medium bezsurowiczym lepiej rozwijają się przy nieco wyższym stężeniu CO₂ (około 6,5%). Ponadto nie stosujemy antybiotyków w naszych mediach, ponieważ hamują one wzrost neurytów, a utrzymywanie hodowli w deskryptorach wydaje się minimalizować rozprzestrzenianie się kontaminacji, jeśli ta wystąpi w części hodowli. Korzystając z tego systemu, rutynowo utrzymujemy hodowle SCG do 8 tygodni. Po wysianiu hodowle SCG umieszcza się na porcelanowej płycie deskryptora w szklanych deskryptorach z wodą sterylną na dnie. Przed zamknięciem deskryptora i umieszczeniem go w inkubatorze ustawionym na 35,5 °C, wstrzykuje się do niego około 120 ml CO₂.

5. Karmienie i utrzymanie kultur

1. Kultury są zazwyczaj zasilane 3 razy w tygodniu, przy czym pierwsza wymiana pożywki odbywa się 24 godziny po wysiewaniu. Za pomocą sterylnej pipety z zakrzywioną końcówką należy delikatnie odessać około połowy pożywki z każdej studni. Następnie, używając czystej sterylnej pipety z zakrzywioną końcówką, należy zastąpić usuniętą objętość pożywki świeżym medium C2.
2. W celu wyeliminowania komórek nieneuronalnych z kultury do pożywki zazwyczaj dodaje się środek antymitotyczny cytosynę-D-arabinofuranozyd (ARA-C, stężenie końcowe 1-2 μM) podczas pierwszej wymiany pożywki (np. 24 godziny po wysiewaniu) na okres 48 godzin. Takie stężenie ARA-C jest zazwyczaj wystarczające do usunięcia wszystkich komórek nieneuronalnych. Jeśli wymagane jest dodatkowe zastosowanie ARA-C, zaleca się wykonywanie tego zabiegu co drugie karmienie, aby zminimalizować toksyczny wpływ na neurony.

6. Indukowanie wzrostu dendrytów za pomocą Matrigelu lub BMP-7

1. Aby indukować wzrost dendrytyczny, do kultur dodaje się Matrigel lub BMP-7 po wyeliminowaniu komórek nieneuronalnych i znacznym obniżeniu poziomu ARA-C w kulturach. Zazwyczaj Matrigel lub BMP-7 dodajemy do pożywki w 5. dniu in vitro, jednak wzrost dendrytyczny może zostać zaindukowany przez Matrigel lub BMP-7 dodane w dowolnym punkcie czasowym in vitro. Matrigel lub BMP-7 dodaje się do pożywki C2, a kultury dokarmia zgodnie z powyższym opisem.
2. Wzrost dendrytyczny indukowany przez Matrigel i BMP jest zależny od czasu i stężenia. Aby uzyskać maksymalny efekt, Matrigel dodaje się do C2 w stężeniu końcowym 50-75 μg/ml; BMP-7 dodaje się do pożywki C2 w stężeniu końcowym 50 ng/ml. Zauważono, że stężenia Matrigelu powyżej 100 μg/ml lub stężenia BMP-7 powyżej 100 ng/ml powodują toksyczność neuronalną. Wyrostki dendrytyczne (określane na podstawie kryteriów morfologicznych) stają się widoczne około 48 godzin po pierwszej ekspozycji na Matrigel lub BMP-7 w maksymalnie skutecznych stężeniach. Aby indukować intensywny wzrost dendrytyczny, kultury dokarmia się pożywką zawierającą BMP-7 przy każdym karmieniu. Analogiczne wyniki uzyskano stosując BMP 2, 4, 5 i 6 w porównywalnych stężeniach ^20,21.

7. Analiza immunocytochemiczna wzrostu dendrytów indukowanego przez BMP-7

1. Po osiągnięciu pożądanego stopnia arboryzacji dendrytycznej hodowle utrwala się za pomocą 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym. Najlepsze utrwalenie uzyskuje się poprzez zastąpienie połowy medium w dołku 4% paraformaldehydem i powtarzanie tego kroku 3–5 razy w ciągu 10–15 minut.
2. Płucze się hodowle, zastępując połowę 4% paraformaldehydu solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) i powtarzając ten krok trzy razy w ciągu 10–15 minut.
3. Należy usunąć cały PBS i dodać do każdego dołka 200 μl 0,1% Triton X-100 w PBS na 5 minut w temperaturze pokojowej w celu permeabilizacji komórek.
4. Roztwór Triton usuwa się poprzez aspirację, a następnie dodaje 200 μl na dołek roztworu buforu blokującego (PBS uzupełniony o 3–5% BSA i 1% surowicy koziej). Inkubuje się przez 20–30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Należy usunąć bufor blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko białku MAP2 (microtubule-associated protein-2), rozcieńczone w buforze blokującym w stosunku 1:2000 – 1:5000. Hodowle inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
6. Roztwór przeciwciała pierwszorzędowego należy usunąć, a hodowle przemyć PBS trzy razy w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej.
7. Hodowle inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w PBS uzupełnionym o 1% BSA przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności.
8. Roztwór przeciwciała drugorzędowego należy usunąć, a hodowle przemyć PBS trzy razy w ciągu 10–15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
9. Kryszalki montuje się na szkiełkach przedmiotowych stroną z komórkami do dołu, w kropli wodnego medium montażowego o pH odpowiednim dla fluorochromu sprzężonego z przeciwciałem drugorzędowym. Szkiełka pozostawia się w temperaturze pokojowej przez noc do wyschnięcia medium montażowego. Szkiełka przechowuje się w 4 °C do momentu obrazowania.
10. Przed obrazowaniem należy pozwolić szkiełkom wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej. Obrazy fluorescencyjne wykonuje się przy użyciu mikroskopu fazowego przystosowanego do epifluorescencji. Zazwyczaj całe drzewo dendrytyczne pojedynczego neuronu można uchwycić za pomocą obiektywu 20X i odpowiednich filtrów.

8. Reprezentatywne wyniki

Neurony współczulne wyizolowane z zwojów szyjnych gwiazdowatych (SCG) szczurów perinatalnych, hodowane bez udziału surowicy oraz glejowych komórek zwojowych, nie wykazują zdolności do wydłużania wypustek immunoreaktywnych z MAP2 (Rycina 1), lecz zazwyczaj wysyłają tylko jeden wypustek aksonalny ^14,15Ekspozycja na BMP-7 (Rycina 1) lub Matrigel indukuje tworzenie licznych wypustek, które spełniają morfologiczne, biochemiczne i funkcjonalne kryteria dendrytyczne ^17,18Aktywność Matrigelu lub BMP-7 w stymulowaniu wzrostu dendrytów jest zależna od stężenia oraz czasu. ^17,18,20Maksymalny wzrost dendrytyczny obserwuje się przy zastosowaniu stężeń Matrigelu od 50 do 75 μg/ml lub BMP-7 w zakresie od 30 do 100 ng/ml, a efekty połowiczne zazwyczaj obserwuje się przy stężeniach BMP-7 wynoszących ok. 2 ng/ml. Jednakże znaczące zmiany w wzroście dendrytów można wykryć przy stężeniach BMP-7 tak niskich jak 300 pg/ml. Odpowiedź dendrytyczna na Matrigel lub BMP-7 jest stosunkowo powolna, przy czym <50% neuronów wytworzyło drugi wypust w ciągu 24 godzin po ekspozycji na którykolwiek z czynników promujących wzrost dendrytów. Jednak w ciągu 3 dni od początkowej ekspozycji na BMP-7 niemal wszystkie neurony zareagowały na maksymalnie skuteczne stężenia Matrigelu lub BMP-7. Liczba dendrytów na neuron nadal wzrasta przy ciągłej ekspozycji na BMP-7, przy czym większość zmian zachodzi w ciągu pierwszych 10 dni leczenia. Po 4 tygodniach neurony traktowane BMP-7 posiadają zazwyczaj 6–8 dendryty głównych, które wykazują wtórne, trzeciorzędowe, a nawet czwartorzędowe rozgałęzienia dendrytyczne. ¹⁷Wzrost ten w obrębie drzewienia dendrytycznego następuje przy braku jakichkolwiek istotnych zmian w wzroście aksonalnym, a porównywalne odpowiedzi dendrytyczne można wywołać, stosując podobne stężenia BMP 2, 4, 5 lub 6. ^20,21Wzrost dendrytów można również wywołać poprzez kokultywację neuronów współczulnych z endogennymi glejowymi komórkami zwojowymi. ^15,22; jednakże w tych warunkach odpowiedź dendrytyczna jest znacznie wolniejsza.

Rysunek 1. BMP-7 stymuluje wzrost dendrytyczny w hodowlach neuronów współczulnychKomórki nieneuronalne usunięto z kultur SCG poprzez zastosowanie leku przeciwmitotycznego przez 48 h, począwszy od 2. dnia. in vitroRozpoczynając od 5. dnia in vitrokultury traktowano odpowiednio podłożem kontrolnym (A) lub podłożem uzupełnionym o BMP-7 w stężeniu 50 ng/ml (B). W 11. dniu in vitro (po 5 dniach traktowania BMP) w kulturach przeprowadzono immunohistochemiczne barwienie z użyciem przeciwciała monoklonalnego (mAb) przeciwko MAP2, białku występującym głównie w dendrytach i somatach neuronalnych. Jak pokazują reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne, neurony hodowane w warunkach kontrolnych nie posiadają dendrytych, co potwierdza brak immunoposzytywnych procesów MAP-2 (A); w przeciwieństwie do nich, neurony poddane działaniu BMP-7 (B) zazwyczaj posiadają kilka zwężających się, immunoposzytywnych dla MAP-2 dendrytów.

Dyskusja

Zalety tego modelu obejmują: (a) hodowle składają się z jednorodnej populacji neuronów współczulnych pozbawionej innych typów komórek ^17,23; (b) wymagania neuronów współczulnych w zakresie czynników wzrostu są dobrze określone, co umożliwia stosowanie zdefiniowanych pożywek, a różnorodne rodzaje zdefiniowanych pożywek i podłoży sprawdzają się w hodowli i utrzymaniu neuronów współczulnych ²³; (c) neurony w tych hodowlach reagują jednolicie na aktywność promującą powstawanie dendrytów Matrigelu, BMP-7...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe	Bellco Glass	1943-10012	Szkiełko nakrywkowe okrągłe 12 mm, grubość nr 1, szkło niemieckie
Pipety z zakrzywioną końcówką	Bellco Glass	1273-50003
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	P0899-100MG	Roztwór stokowy 1 mg/ml
Woda destylowana	GIBCO, by Life Technologies	15230
Precyzyjne pęsety Dumont nr 4 i 5	Fine Science Tools	11252-30 11241-30
igły 20 G	BD Biosciences	305176
Leibovitz’pożywka L-15	Invitrogen	11415
Kolagenaza	Worthington Biochemical	4176	1 mg/ml
Dyspaza	Grupa Roche	04942078001	5 mg/ml
Hank’zrównoważony roztwór soli (bez Ca, Mg)	Invitrogen	14185-052
DMEM o niskiej zawartości glukozy	Invitrogen	11885
L-glutamina	Invitrogen	25030	20 mM
Insulina/Transferyna/Selen	Invitrogen	51500-056	100X
BSA wolne od kwasów tłuszczowych	Calbiochem	126609
NGF	Harlan Laboratories	5017
pożywka Ham F-12 (F-12)	Invitrogen	11765
Cytarabina	Sigma-Aldrich	C1768
Matrigel	BD Biosciences	356234	Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania
BMP-7	R&R&D Systems	345-BP BMP7-07H	Białka BMP 4, 5 i 6 działają równie skutecznie jak BMP-7 i czasami są łatwiejsze do nabycia w handlu.
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Przeciwciało mysie przeciwko szczurzemu białku MAP2	Sternberger Monoclonals Inc.	SMI52	1/5000
Alexa Fluor 546 przeciwciało kozie antymysie	Invitrogen	A11003	1/10000
Media montażowe	Sondy molekularne, Life Technologies	P7481