VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Podsumowanie

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy sprawności wzrokowej larw i niewielkich osobników dorosłych ryb, oparty na rejestracji ruchów gałek ocznych. Charakteryzuje się on pełną kontrolą nad właściwościami bodźców wzrokowych oraz analizą w czasie rzeczywistym, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań w takich dziedzinach jak rozwój i funkcje układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów neuronalnych oraz integracja sensoromotoryczna.

Streszczenie

Badania nad rozwojem i funkcją układu wzrokowego wymagają mierzalnych modeli behawioralnych sprawności wzrokowej, które są łatwe do wywołania, stabilne i proste w manipulacji. Odpowiedni model znaleziono w odpowiedzi optokinetycznej (OKR), która jest zachowaniem refleksowym występującym u wszystkich kręgowców ze względu na wysoką wartość selekcyjną. OKR obejmuje powolne ruchy śledzące bodziec, przeplatane szybkimi sakkadami resetującymi. Pomiar tego zachowania jest łatwo przeprowadzalny u larw danio pręgowanego dzięki jego wczesnemu i stabilnemu pojawieniu się (pełny rozwój po 96 godzinach od zapłodnienia (hpf)) oraz dzięki gruntownej wiedzy na temat genetyki danio pręgowanego, który od dziesięcioleci jest jednym z preferowanych organizmów modelowych w tej dziedzinie. Jednocześnie analiza podobnych mechanizmów u dorosłych ryb zyskała na znaczeniu, szczególnie w zastosowaniach farmakologicznych i toksykologicznych.

W niniejszym opracowaniu opisujemy VisioTracker, w pełni zautomatyzowany system wysokoprzepustowy do ilościowej analizy wydajności wizualnej. System opiera się na badaniach przeprowadzonych w grupie prof. Stephana Neuhaussa i został przeprojektowany przez firmę TSE Systems. Składa się on z urządzenia immobilizującego małe ryby, monitorowane przez wysokiej jakości kamerę wideo wyposażoną w obiektyw zoom o wysokiej rozdzielczości. Pojemnik z rybą jest otoczony bębnowym ekranem, na który można projektować generowane komputerowo wzory stymulujące. Ruchy gałek ocznych są rejestrowane i automatycznie analizowane w czasie rzeczywistym przez pakiet oprogramowania VisioTracker.

Analiza danych umożliwia natychmiastowe określenie takich parametrów jak czas trwania fazy wolnej i szybkiej, częstotliwość cyklu ruchowego, wzmocnienie fazy wolnej, ostrość wzroku oraz czułość kontrastowa.

Typowe wyniki pozwalają na przykład na szybką identyfikację mutantów układu wzrokowego, które nie wykazują wyraźnych zmian w morfologii typu dzikiego, lub na określenie ilościowych efektów działania środków farmakologicznych, toksycznych i mutagennych na sprawność układu wzrokowego.

Protokół

1. Hodowla ryb

Zarodki przechowywano i hodowano w standardowych warunkach (Brand 2002), a ich stopień rozwoju określano na podstawie liczby dni po zapłodnieniu (dpf). Do pomiarów wykorzystano osobniki dorosłe oraz larwy w 5. dniu po zapłodnieniu (5 dpf).

2. Procedura eksperymentalna

1. Przygotowanie instrumentu

Larwy: Larwy ryb zatopiono w 3% uprzednio ogrzanej (28°C) metylocelulozie, aby zapobiec ruchom ciała. Embriony umieszczono w urządzeniu VisioTracker stroną grzbietową do góry, przodem do ekranu projekcyjnego. Ryby dorosłe: Ryby krótko znieczulono w roztworze MS-222 o stężeniu 300 mg/l, umieszczono w urządzeniu unieruchamiającym, a następnie w VisioTrackerze. Przed rozpoczęciem pomiarów pozostawiono je na 1-2 min w celu dojścia do siebie.

2. Generowanie wzorców stymulacji

Wzory bodźców składające się z pionowych czarno-białych kratownic sinusoidalnych obracających się wokół ryby zostały utworzone przy użyciu autorskiego pakietu oprogramowania. Mogły być one modulowane za pomocą tego oprogramowania pod kątem kształtu fali, kontrastu, intensywności, prędkości kątowej oraz częstotliwości przestrzennej. Wzory były rzutowane na ekran za pomocą cyfrowego projektora światła zawartego w systemie VisioTracker. Przybliżona odległość między okiem ryby a ekranem wynosiła 4,5 cm, a rozmiar projekcji na ekranie wynosił 360 deg w poziomie i 55 deg w pionie. W przypadku larw ryb kierunek stymulacji zmieniano z częstotliwością 0,33 Hz, aby zmniejszyć częstotliwość sakad. Ryby dorosłe stymulowano jednokierunkowo i brano pod uwagę tylko oko stymulowane w kierunku skroniowo-nosowym, ponieważ prędkość oka w kierunku nosowo-skroniowym jest zazwyczaj znacznie niższa i mniej stała (patrz: Mueller i Neuhauss, 2010).

3. Rejestracja ruchów gałek ocznych

Obraz głowy ryby w polu jasnym był przesyłany do kamery wideo w podczerwieni. Oświetlenie ryb podczerwienią realizowano od dołu. Kamera rejestrowała obrazy z częstotliwością odpowiednio 5 klatek/sekundę (larwy) lub 12,5 klatek/sekundę (dorosłe osobniki). Obrazy są automatycznie przetwarzane, korygowane i wygładzane pod kątem kształtu oka. Następnie orientacja oka w stosunku do osi poziomej była wyznaczana automatycznie, a prędkość ruchu oka obliczana przez autorski pakiet oprogramowania. Niewielkie ruchy ryb były automatycznie korygowane przez oprogramowanie. Cały proces rejestracji i analizy odbywał się w czasie rzeczywistym.

3. Przetwarzanie danych poeksperymentalnych

1. Surowe pomiary prędkości ruchu oczu zostały przefiltrowane pod kątem sakad w celu wyodrębnienia prędkości fazy wolnej.
2. Krzywe prędkości ruchu oczu po filtracji sakad zostały wygładzone za pomocą średniej kroczącej z oknem przesuwnym o szerokości 7 klatek.
3. Prędkość ruchu oczu została uśredniona dla klatek o identycznych warunkach stymulacji.
4. W przypadku larw ryb prędkość ruchu oczu została uśredniona dla obu oczu.

4. Reprezentatywne wyniki:

Aby ocenić możliwości systemu VisioTracker w odniesieniu do larw i dorosłych ryb, przeprowadzono doświadczenia z larwami zebrafish w 5 dpf oraz z dorosłymi osobnikami zebrafish.

W przypadku larw danio pręgowanego wybrano mutant bumper. U tego mutanta komórki nabłonka soczewki ulegają hiperproliferacji, co prowadzi do zmniejszenia rozmiaru soczewki i jej ektopowego położenia. Zmiany morfologiczne te przekładają się na znaczną redukcję czułości kontrastowej oraz ostrości wzroku (Schonthaler et al., 2010). Rycina 1 przedstawia różnicę w czułości kontrastowej mutantów bumper w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Mutanty bumper w coraz większym stopniu nie potrafią dostosować prędkości ruchu oka wraz ze spadkiem kontrastu bodźca. Analogicznie, przy zwiększeniu częstotliwości przestrzennej bodźca, tzn. zmniejszeniu szerokości pasków bodźca, mutanty bumper wykazują również obniżoną ostrość wzroku (Ryc. 2)

Zależność wydajności wizualnej dorosłych danio pręgowanych od warunków środowiskowych zbadano poprzez poddanie ryb działaniu różnych stężeń alkoholu w wodzie w zbiorniku przez 30 minut, a następnie pomiar odpowiedzi optokinetycznej w zmiennych warunkach stymulacji. Dorosłe danio pręgowane wykazują wyraźny spadek czułości kontrastowej przy utrzymywaniu ich w rosnących stężeniach alkoholu (Rys. 3). Podobny, zależny od dawki spadek całkowitej prędkości oka w szerokim zakresie częstotliwości przestrzennych można było zaobserwować, gdy ryby były poddawane działaniu rosnących stężeń alkoholu (Rys. 4). Ponadto traktowanie alkoholem w sposób zależny od dawki obniża sprawność okulomotoryczną w bardziej wymagających zadaniach, co zilustrowano zwiększonymi prędkościami stymulacji (Rys. 5).

Rycina 1. Prędkość ruchu oka larwy danio pręgowanego zależy od kontrastu bodźca. Przeanalizowano 10 mutantów bumper oraz 10 rodzeństwa typu dzikiego w 5 dpf przy różnych warunkach kontrastu pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka ± 1 SEM.

Rysunek 2. Prędkość ruchu oka larw danio pręgowanego zależy od częstotliwości przestrzennej. 10 mutantów bumper oraz 10 rodzeństwa typu dzikiego poddano działaniu bodźców o różnej szerokości pasów w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) i przeanalizowano zgodnie z opisem. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka ± 1 SEM.

Rycina 3. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależny od stężenia alkoholu spadek czułości kontrastowej. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano w różnych warunkach kontrastu pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu gałek ocznych w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb w grupie (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).

Rycina 4. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależną od stężenia alkoholu redukcję całkowitego ruchu oka w szerokim zakresie szerokości pasów bodźca. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano w warunkach różnej szerokości pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).

Rysunek 5. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależną od stężenia alkoholu redukcję całkowitego ruchu oka w szerokim zakresie prędkości bodźca. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano przy różnych prędkościach bodźców. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).

Dyskusja

Znaczenie OKR w badaniach nad funkcją wzrokową jest od dawna uznawane w społeczności naukowej (Easter & Nicola 1996, 1997), a próby rzeczywistej kwantyfikacji tego paradygmatu rozpoczęły się ponad dekadę temu. Easter i Nicola (1996) opracowali system z zmotoryzowanymi, obracającymi się bębnami w paski, w którym zapis wideo ruchów gałki ocznej analizowano ręcznie. System ten był obarczony wadą w postaci braku unieruchomienia zarodka ryby, co wymagało częstego ręcznego repozycjonowania, a wykrywanie ruchów śledzących oczu było możliwe jedynie z dużym trudem. Krokiem naprzód było zastosowanie wideo-projektowanego bębna w paski, co umożliwiło prezentację bardziej zróżnicowanych bodźców generowanych komputerowo (Roeser & Baier, 2003; Rinner et al., 2005a).

Większościowo ręczna analiza nagrań wideo klatka po klatce okazała się niezwykle pracochłonna i w pewnym stopniu obciążona błędem obserwatora (Beck et al., 2004). Zaproponowano zautomatyzowaną analizę w czasie rzeczywistym, aby umożliwić wykorzystanie mechanizmów uczenia opartego na sprzężeniu zwrotnym z zachowaniem (Major et al., 2004). Zastosowanie oświetlenia podczerwonego oraz stymulacji rotacyjnej z kontrolowaną częstotliwością zostało zapoczątkowane przez Beck et al. (2004). Jednak system tam opisany był stosowany wyłącznie w przypadku larw, a analiza była przeprowadzana w trybie off-line. Co więcej, VisioTracker zapewnia pełną kontrolę nad bodźcami, w tym możliwość ich zmiany w trakcie eksperymentu, co pozwala na większą elastyczność i spontaniczny wpływ na przebieg doświadczenia. Ponadto cyfrowe tworzenie bodźców wykorzystywane przez VisioTracker rozwiązało wspomniane wcześniej problemy z przyspieszeniem masy bezwładnej prążkowanego bębna stymulującego (Beck et al., 2004).

Unieruchomienie larw za pomocą metylocelulozy nie zakłóca w znacznym stopniu ruchów gałek ocznych i nie wywiera żadnego długofalowego wpływu na dobrostan danio pręgowanych. Larwy ryb były z powodzeniem utrzymywane w zatopieniu w metylocelulozie przez kilka dni, aż do momentu, gdy podaż tlenu przez skórę stawała się niewystarczająca w stosunku do zapotrzebowania rosnącego wraz z wiekiem (Qian et al., 2005).

Metoda unieruchamiania dorosłych ryb jest równie łagodna dla zwierzęcia. Krótki czas trwania eksperymentu, w połączeniu z możliwością szybkiej wymiany zwierzęcia testowego na inne, dodatkowo wpływa na pozytywne aspekty dobrostanu zwierząt w tym systemie. Ponieważ skrzela są stale przepłukiwane wodą, wygodne jest dodawanie do wody dowolnej wybranej substancji chemicznej w celu zbadania jej wpływu na ruchy gałek ocznych i sprawność wzrokową. Podobnie można przeprowadzić eksperyment z wymywaniem (wash-out) bez konieczności manipulowania zwierzęciem pomiędzy badaniami.

Szum pikseli w obrazie wideo został zminimalizowany za pomocą algorytmów wygładzania w autorskim oprogramowaniu VisioTracker, co umożliwiło bardzo precyzyjne pomiary pozycji oka i prędkości kątowej. Ponadto, w celu ułatwienia analizy statystycznej, oprogramowanie odfiltrowało ruchy sakadowe, które występują ze stałą prędkością i nie wnoszą wkładu do tezy eksperymentalnej. Uśrednienie krzywych prędkości z 7 klatek wideo ułatwiło późniejszą analizę.

VisioTracker otwiera nowy wymiar dla wielu zróżnicowanych obszarów badawczych. System ten oraz jego poprzednicy zostały już z sukcesem wykorzystane do kwantyfikacji sprawności wzrokowej u larw danio pręgowanego, z wykorzystaniem parametrów takich jak ostrość wzroku, czułość kontrastowa i adaptacja do światła (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), do analizy funkcjonalnej fotoreceptorów czopkowych po manipulacji elementami kaskady transdukcji wzrokowej (np. Rinner et al., 2005b, Renninger et al., 2011) oraz do analizy wad wzroku u mutantowych larw danio pręgowanego (np. Schonthaler et al., 2005, 2008; Bahadori et al., 2006). Współzależność między dojrzewaniem morfologicznym a funkcjonalnym systemu wzrokowego była badana za pomocą pomiarów OKR, co wykazało, że ostrość wzroku na etapach larwalnych jest ograniczona głównie, choć nie całkowicie, przez rozmieszczenie fotoreceptorów (Haug et al., 2010).

Urządzenie VisioTracker jest równie odpowiednie do analizy funkcji wzrokowych u dorosłych danio pręgowanych oraz innych gatunków ryb o podobnych rozmiarach (Mueller i Neuhauss (2010), niniejszy raport).

Możliwe jest również wykorzystanie tego systemu w obszarach badawczych takich jak toksykologia czy farmakologia, w których badane substancje mogą być dodawane do przepływu wody otaczającego skrzela dorosłych ryb. Ponadto wszechstronność systemu VisioTracker umożliwia przeprowadzenie bardziej szczegółowych analiz, na przykład ontogenezy funkcji wzrokowej, funkcjonowania i rozwoju obwodów neuronalnych lub kontroli sensorimotorycznej (patrz przegląd w Huang & Neuhauss, 2008).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M0387
Metanosulfonian etylu 3-aminobenzojanu (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
Szkiełko do hodowli komórkowej 35 mm	Corning	430165
Pipeta surowiczka	Greiner Bio-One	612 361
VisioTracker	TSE Systems	302060