Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy wizualnej larw i małych dorosłych ryb na podstawie rejestracji ruchów gałek ocznych. Oferuje pełną kontrolę nad właściwościami bodźców wzrokowych i analizę w czasie rzeczywistym, umożliwiając wysokoprzepustowe badania w takich dziedzinach, jak rozwój i funkcjonowanie układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów nerwowych i integracja sensomotoryczna.
Badania nad rozwojem i funkcjonowaniem systemu wzrokowego wymagają wymiernych modeli behawioralnych wydajności wizualnej, które są łatwe do wywołania, solidne i łatwe do manipulowania. Odpowiedni model znaleziono w odpowiedzi optokinetycznej (OKR), odruchowym zachowaniu obecnym u wszystkich kręgowców ze względu na wysoką wartość selekcyjną. OKR polega na powolnych ruchach gałek ocznych podążających za bodźcem na przemian z szybko resetującymi się sakkadami. Pomiar tego zachowania jest łatwy do przeprowadzenia u larw danio pręgowanego, ze względu na jego wczesny i stabilny początek (w pełni rozwinięty po 96 godzinach od zapłodnienia (hpf)) oraz korzystanie z dogłębnej wiedzy na temat genetyki danio pręgowanego, od dziesięcioleci jednego z ulubionych organizmów modelowych w tej dziedzinie. Tymczasem analiza podobnych mechanizmów u dorosłych ryb zyskała na znaczeniu, szczególnie w zastosowaniach farmakologicznych i toksykologicznych.
Tutaj opisujemy VisioTracker, w pełni zautomatyzowany, wysokowydajny system do ilościowej analizy wydajności wizualnej. System oparty jest na badaniach przeprowadzonych w grupie prof. Stephana Neuhaussa i został przeprojektowany przez TSE Systems. Składa się z urządzenia unieruchamiającego małe rybki monitorowanego przez wysokiej jakości kamerę wideo wyposażoną w obiektyw zmiennoogniskowy o wysokiej rozdzielczości. Pojemnik na ryby jest otoczony ekranem bębna, na który można rzutować generowane komputerowo wzorce bodźców. Ruchy gałek ocznych są rejestrowane i automatycznie analizowane przez pakiet oprogramowania VisioTracker w czasie rzeczywistym.
Analiza danych umożliwia natychmiastowe rozpoznanie takich parametrów jak czas trwania fazy wolnej i szybkiej, częstotliwość cyklu ruchu, wzmocnienie fazy wolnej, ostrość widzenia i wrażliwość na kontrast.
Typowe wyniki pozwalają na przykład na szybką identyfikację mutantów układu wzrokowego, które nie wykazują widocznych zmian w morfologii typu dzikiego, lub określenie ilościowego wpływu czynników farmakologicznych lub toksycznych i mutagennych na wydajność systemu wzrokowego.
1. Hodowla ryb
Zarodki były trzymane i hodowane w standardowych warunkach (Brand 2002) i klasyfikowane zgodnie z rozwojem w ciągu kilku dni po zapłodnieniu (dpf). Do pomiarów wykorzystano dorosłe osobniki i larwy w temperaturze 5 dpf.
2. Procedura eksperymentalna
Larwy: Larwy ryb zostały zanurzone w 3% wstępnie podgrzanej (28°C) metylocelulozie, aby zapobiec ruchom ciała. Zarodki umieszczono grzbietową stroną do góry w VisioTrackerze, przodem do ekranu. Dorosłe ryby: Ryby zostały krótko znieczulone w 300 mg/l MS-222, umieszczone w urządzeniu unieruchamiającym i umieszczone w VisioTrackerze. Przed rozpoczęciem pomiarów pozostawiono je do odzyskania na 1-2 minuty.
Wzorce bodźców składające się z pionowych czarno-białych siatek sinusoidalnych obracających się wokół ryby zostały stworzone przy użyciu zastrzeżonego pakietu oprogramowania. Można je modulować za pomocą pakietu oprogramowania w zależności od kształtu fali, kontrastu, intensywności, prędkości kątowej i częstotliwości przestrzennej. Wzory były wyświetlane na ekranie za pomocą cyfrowego projektora świetlnego zawartego w VisioTrackerze. Przybliżona odległość między rybim okiem a ekranem wynosiła 4,5 cm, a rozmiar projekcji na ekranie wynosił 360 stopni w poziomie i 55 stopni w pionie. W przypadku larw ryb kierunek stymulacji zmieniono z częstotliwością 0,33 Hz w celu zmniejszenia częstotliwości sakkad. Dorosłe ryby były stymulowane jednokierunkowo i brano pod uwagę tylko oko stymulowane w kierunku skroniowo-nosowym, ponieważ prędkość oka z nosa do skroniowego jest ogólnie znacznie niższa i mniej stała (patrz Mueller i Neuhauss, 2010).
Obraz głowy ryby w jasnym polu został przesłany do kamery wideo na podczerwień. Oświetlenie ryb w podczerwieni odbywało się od dołu. Kamera rejestrowała obrazy z szybkością odpowiednio 5 klatek/sekundę (larwy) lub 12,5 klatki/sekundę (dorosłe). Obrazy są automatycznie przetwarzane, korygowane i wygładzane w celu uzyskania kształtu oczu. Orientacja oka w stosunku do osi poziomej była następnie określana automatycznie, a prędkość oka była obliczana przez autorski pakiet oprogramowania. Niewielkie ruchy ryb były automatycznie korygowane przez oprogramowanie. Wszystkie zapisy i analizy odbywały się w czasie rzeczywistym.
3. Posteksperymentalne przetwarzanie danych
4. Reprezentatywne wyniki:
Aby ocenić możliwości VisioTrackera dla larw i dorosłych ryb, przeprowadzono eksperymenty na larwach danio pręgowanego przy 5 dpf i dorosłych danio pręgowanych.
Dla larw Danio pręgowanego wybrano mutanta zderzaka. W tym mutancie komórki nabłonka soczewki ulegają hiperproliferacji, co prowadzi do zmniejszenia rozmiaru soczewki i ektopowej lokalizacji soczewki. Te zmiany morfologiczne znajdują odzwierciedlenie w znacznym zmniejszeniu wrażliwości na kontrast i ostrości wzroku (Schonthaler i wsp., 2010). Rysunek 1 pokazuje różnicę we wrażliwości na kontrast mutantów zderzaków w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Mutanty zderzakowe coraz częściej nie dostosowują prędkości gałki ocznej wraz ze spadkiem kontrastu bodźca. Analogicznie, gdy zwiększa się częstotliwość przestrzenna bodźca, tj. zmniejsza się szerokość paska bodźca, mutanty zderzakowe również wykazują obniżoną ostrość widzenia (ryc. 2)
Zależność wizualnych dorosłych ryb danio pręgowanego od warunków środowiskowych została zbadana poprzez poddanie ryb działaniu różnych stężeń alkoholu w wodzie w zbiorniku przez 30 minut, a następnie zmierzenie reakcji optokinetycznej w różnych warunkach bodźca. Dorosłe danio pręgowane wykazują wyraźne zmniejszenie wrażliwości na kontrast, gdy są utrzymywane w rosnącym stężeniu alkoholu (ryc. 3). Podobne, zależne od dawki zmniejszenie ogólnej prędkości gałki ocznej w szerokim zakresie częstotliwości przestrzennych można było zaobserwować, gdy ryby były traktowane zwiększonym stężeniem alkoholu (ryc. 4). Leczenie alkoholizmem w zależności od dawki ponadto zmniejsza sprawność okoruchową przy bardziej wymagających zadaniach, czego przykładem jest zwiększona szybkość bodźca (ryc. 5).
Rysunek 1. Prędkość gałki rachunkowej larw danio pręgowanego zależy od kontrastu bodźca. 10 mutantów zderzaków i 10 rodzeństwa typu dzikiego analizowano przy 5 dpf w różnych warunkach kontrastu pasków bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość gałki ocznej ± 1 SEM.
Rysunek 2. Prędkość oczu larw danio pręgowanego zależy od częstotliwości przestrzennej. 10 mutantów zderzaków i 10 rodzeństwa typu dzikiego poddano różnym szerokościom pasków bodźcowych przy 5 dpf i przeanalizowano zgodnie z opisem. Wykres przedstawia średnią prędkość gałki ocznej ± 1 SEM.
Rysunek 3. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależne od stężenia alkoholu zmniejszenie wrażliwości na kontrast. Dorosłe rybki danio pręgowanego utrzymywano w różnych stężeniach alkoholu, jak wskazano, przez 30 minut i analizowano w różnych warunkach kontrastu paska bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość skroniowo-nosową oka ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).
Rysunek 4. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależne od stężenia alkoholu zmniejszenie ogólnego ruchu gałek ocznych w szerokim zakresie szerokości pasków bodźców. Dorosłe rybki danio pręgowanego utrzymywano w różnych stężeniach alkoholu, jak wskazano, przez 30 minut i analizowano w różnych warunkach szerokości pasa bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość skroniowo-nosową oka ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).
Rysunek 5. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależne od stężenia alkoholu zmniejszenie ogólnego ruchu gałek ocznych w szerokim zakresie prędkości bodźca. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano w różnych stężeniach alkoholu, jak wskazano, przez 30 minut i analizowano w różnych warunkach prędkości bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość skroniowo-nosową oka ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).
Oliver D.R. Schnaedelbach i Holger D. Russig są pracownikami firmy TSE Systems GmbH, która produkuje wizualny system śledzenia wydajności wykorzystany w tym artykule. Produkcja tego artykułu była sponsorowana przez TSE Systems GmbH. Stephan C.F. Neuhuass jest pracownikiem Uniwersytetu w Zurychu, który otrzymuje wynagrodzenie od TSE Systems za każdy sprzedany system.
VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy wizualnej larw i małych dorosłych ryb na podstawie rejestracji ruchów gałek ocznych. Oferuje pełną kontrolę nad właściwościami bodźców wzrokowych i analizę w czasie rzeczywistym, umożliwiając wysokoprzepustowe badania w takich dziedzinach, jak rozwój i funkcjonowanie układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów nerwowych i integracja sensomotoryczna.
KPM był wspierany przez EU FP7 (RETICIRC).
| Metyloceluloza | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm | Corning | 430165 | |
| Pipeta do surowicy | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
