Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Opracowaliśmy cytometr przepływowy wykorzystujący ultradźwięki indukowane laserem do wykrywania krążących komórek czerniaka jako wczesnego wskaźnika choroby przerzutowej.

Streszczenie

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które oddzieliły się od guza makroskopowego i rozprzestrzeniły poprzez układ krwionośny i limfatyczny, aby tworzyć przerzuty.^1,2,3CTCs są wskaźnikami choroby przerzutowej, a ich wykrywanie w próbkach krwi może być wykorzystywane do diagnostyki nowotworów oraz monitorowania stanu pacjenta′odpowiedź na terapię. Ponieważ CTC są rzadkie i stanowią około jednej komórki nowotworowej wśród miliardów prawidłowych komórek krwi u pacjentów z zaawansowanym rakiem, ich detekcja i zliczanie są trudnym zadaniem. Wykorzystujemy obecność pigmentu w większości komórek czerniaka do generowania fal fotoakustycznych, czyli indukowanych laserem fal ultradźwiękowych, w specjalnie zaprojektowanym cytometrze przepływowym do detekcji krążących komórek czerniaka (CMC).^4,5Proces ten polega na rozdzieleniu próbki krwi pełnej za pomocą wirowania w celu uzyskania warstwy białych krwinek. Jeśli CMC znajdują się we krwi pełnej, zostaną one oddzielone wraz z białymi krwinkami ze względu na podobną gęstość. Komórki te są resuspendowane w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wprowadzane do przepływomierza. Zamiast ciągłego przepływu zawiesiny komórek krwi, zastosowano przepływ dwufazowy, aby przechwycić te komórki do dalszych badań. W przepływie dwufazowym dwie niemieszalne ciecze w układzie mikrofluidycznym spotykają się w węźle i tworzą naprzemienne segmenty cieczy.^6,7Leukocyty zawieszone w PBS oraz powietrze tworzą mikrolitrowe segmenty (slugi), które są sekwencyjnie naświetlane światłem laserowym. Dodatek surfaktantu do fazy ciekłej umożliwia jednorodne formowanie się segmentów, a użytkownik może tworzyć segmenty o różnych rozmiarach poprzez zmianę szybkości przepływu obu faz. Segmenty powietrza oraz segmenty PBS z leukocytami nie zawierają absorbentów światła, a zatem nie generują fal fotoakustycznych. Natomiast segmenty leukocytów zawierające choćby pojedyncze CMCs absorbują światło laserowe i generują wysokoczęstotliwościowe fale akustyczne. Segmenty te, generujące fale fotoakustyczne, są wyodrębniane i zbierane do barwienia cytochemicznego w celu weryfikacji obecności CMCs.

Protokół

1. Przygotowanie próbek krwi

1. Pobrać około 10 mL krwi pełnej od pacjenta z nowotworem w IV stadium do dwóch probówek próżniowych o pojemności 5 mL.
2. Wirówki probówki przez dziesięć minut przy 3000 obrotach na minutę (rpm).
3. Próbka krwi rozdzieli się na trzy różne warstwy: dolna warstwa składa się z erytrocytów, warstwa środkowa, nazywana również warstwą buffy coat, zawiera leukocyty i komórki czerniaka, a górna warstwa zawiera osocze i płytki krwi. Usunąć jak największą ilość osocza, uważając, aby nie naruszyć warstwy buffy coat.
4. Do dwóch probówek Wintrobe o pojemności 1 mL nalać 250 μL odczynnika Histopaque 1077.
5. Za pomocą 9-calowej pipety Pasteura pobrać pozostałe osocze, całą warstwę buffy coat oraz górną warstwę erytrocytów, upewniając się, że pobrana objętość wynosi < 500 μL.
6. Nanieść roztwór na warstwę Histopaque i wirować probówki Wintrobe umieszczone w 15 mL probówkach stożkowych przez 10 minut przy 3000 rpm.
7. Krew ponownie się rozdzieli, lecz tym razem erytrocyty zostaną oddzielone przez Histopaque, co umożliwi łatwe wyodrębnienie warstwy buffy coat. Za pomocą 9-calowej pipety Pasteura pobrać całą warstwę buffy coat i przenieść ją do probówki typu Eppendorf o pojemności 2 mL.
8. Zawiesić warstwę buffy coat w 1,5 mL PBS z dodatkiem 2% v/v Tween 20.

2. Konstrukcja komory przepływowej

1. Przygotować cylinder akrylowy o średnicy zewnętrznej 20 mm, średnicy wewnętrznej 17 mm i wysokości 8 mm. Wywiercić w boku cylindra trzy otwory o średnicy 5 mm, rozmieszczone pod kątem 90 stopni względem siebie. Odciąć trzy odcinki rurki polimerowej (średnica wewnętrzna 1,6 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) i umieścić je w wywierconych otworach.
2. Naciągnąć Parafilm na dno pierścienia akrylowego, aby zapewnić szczelność wodną. Parafilm wraz z pierścieniem akrylowym tworzy płytką nieckę, która będzie pomieścić roztwór akryloamidu służący do uformowania komory przepływowej.
3. Przeciągnąć drut o średnicy 1,6 mm przez przeciwległe odcinki rurek, upewniając się, że w środku pierścienia widoczny jest tylko drut. Trzeci odcinek rurki wypełnić drutem o średnicy 1,6 mm i ustawić rurkę w odległości 1 mm od zawieszonego drutu. Druty te zapobiegają przedostawaniu się akryloamidu do wnętrza rurek. Po zestaleniu akryloamidu druty zostaną usunięte, pozostawiając cylindryczny kanał przepływowy oraz miejsce na umieszczenie światłowodu skupionego na ścieżce przepływu.
4. Do małego zlewki dodać 5 mL przygotowanego akryloamidu [20 g akryloamidu (Sigma Aldrich), 0,7 g bisakryloamidu (Sigma Aldrich), 100 mL wody destylowanej]. Odważyć 0,02 g persiarczanu amonu (Sigma) i dodać go do zlewki. Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przez 3 minuty. Do zlewki dodać 20 μL tetrametyloetylenodiaminy (Fisher Scientific). Szybko wlać mieszaninę do pierścienia akrylowego, wypełniając go do pełna. Po kilku sekundach roztwór zgeliuje, tworząc formę komory przepływowej. Ostrożnie wyciągnąć druty, dbając o to, aby nie naruszyć żelu akryloamidowego. Komora przepływowa jest gotowa do użycia.

3. Układ do fotoakustycznej flowmetrii

1. Połącz akustycznie piezoelektryczny przetwornik akustyczny z polifluorku winylidenu (Panametrics) z komorą przepływową, stosując żel ultradźwiękowy bezpośrednio nad ścieżką przepływu.
2. Za pomocą kabla Bayonet Neill-Concelman (BNC) podłącz przetwornik do wejścia odbiornika szerokopasmowego RITEC Broadband Receiver-640A (filtr dolnoprzepustowy: wyłączony, filtr górnoprzepustowy: 1 MHz, impedancja wejściowa: 50 Ohms, wzmocnienie: 35 dB). Wyjście filtra podłącz do oscyloskopu (Tektronix TDS 2024B). W celu wyzwolenia oscyloskopu, w pobliżu przetwornika umieszczono fotodiodę (Thorlabs), która jest podłączona do oscyloskopu za pomocą kabla BNC.
3. Do jednego ramienia komory przepływowej przymocowano łącznik T (Small Parts). Do pozostałych odgałęzień łącznika podłączono dwie pompy strzykawkowe (Braintree Scientific). Jedna strzykawka zawiera powietrze, a druga zawiesinę komórkową przygotowaną w części 1. Ustaw prędkość przepływu na 100 μL/minute.
4. Wysuń cienką rurkę komory przepływowej, aż utworzy się niewielka kieszeń powietrzna, a następnie w tym szczelinie umieść rdzeniowe włókno optyczne o średnicy 1 mm i aperturze numerycznej 0,37. Wypełnij kieszeń wodą, aby zredukować sygnały z interfejsu i zwiększyć ilość światła laserowego docierającego do ścieżki przepływu. Ze względu na aperturę numeryczną włókna optycznego i krótką odległość do ścieżki przepływu, laser będzie naświetlać tylko jeden segment próbki w danym czasie, co zapewni, że próbka znajdująca się bezpośrednio przed laserem jest tą samą próbką, która generuje sygnały fotoakustyczne. Energia lasera powinna wynosić około 28 mJ/cm² przy rozmiarze plamki 7 mm².
5. Włącz obie pompy strzykawkowe. Gdy dwie niemieszające się ciecze dotrą do złącza T, zostaną one podzielone na jednorodne segmenty i przepłyną obok przetwornika.
6. Naświetlaj przepływającą próbkę nanosekundowym laserem impulsowym, aby wygenerować fale fotoakustyczne w komórkach czerniaka. Ponieważ melanina jest szerokopasmowym absorberem optycznym, można zastosować dowolną długość fali lasera z zakresu widzialnego.
7. Jeśli na oscyloskopie pojawi się sygnał w momencie, gdy segment znajduje się nad przetwornikiem, oznacza to, że segment zawiera czerniaka i należy go śledzić w układzie aż do momentu wpłynięcia do fiolki zbiorczej.

4. Immunocytochemia

1. Przenieś zebrane próbki do wirówki Cytospin 4 (Thermo Scientific) w celu ich unieruchomienia na szkiełkach przedmiotowych. Umieść szkiełka w lejkach cytologicznych (Shandon EZ Single Cytofunnel z brązową kartą filtrującą Thermo Scientific), a następnie załaduj je do wirówki Cytospin 4. Do każdego lejka wlej 100 μL 1% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma) w PBS, a następnie wiruj przy 600 rpm przez 3 minuty, aby wspomóc przyleganie zebranych komórek do szkiełek.
2. Po wirowaniu dodaj próbki komórek do lejków cytologicznych, a następnie wiruj przy 600 rpm przez 3 minuty. Następnie spryskaj szkiełka utrwalaczem na bazie etanolu.
3. Przemyj szkiełka w PBS dwukrotnie przez 10 minut.
4. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, inkubuj każde szkiełko z mieszaniną 10 μL surowicy koziej (Sigma) i 90 μL PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Po inkubacji zlej ciecz ze szkiełek i inkubuj je z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Każde szkiełko powinno zawierać 1% przeciwciał MART-1 otrzymanych u królika, 1% przeciwciał CD-45 otrzymanych u myszy, 10% surowicy koziej i 89% PBS.
6. Po inkubacji przemyj szkiełka w PBS trzykrotnie przez 10 minut.
7. Następnie szkiełka inkubuje się w roztworze przeciwciał wtórnych, do których przyłączone są fluorofory. Mieszanina zawiera 0,05% kozich przeciwciał anty-króliczych, 0,05% kozich przeciwciał anty-mysich, 0,1% surowicy koziej i 99% PBS. Szkiełka inkubuje się w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Po inkubacji zlej ciecz ze szkiełek i przemyj je w PBS trzykrotnie przez 5 minut.
9. Aby zabarwić jądra komórkowe, inkubuj komórki z 0,1 μg/mL DAPI (Invitrogen) przez 1 minutę. Następnie zlej ciecz ze szkiełek i przemyj je w PBS.
10. Nałóż szkiełko zakrywywe na próbkę komórek, używając 20 μL medium montażowego na bazie żywicy na każde szkiełko. Uszczelnij szkiełko zakrywywe bezbarwnym lakierem do paznokci, aby zakonserwować preparat. Szkiełka są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1.  Przedstawiono tutaj kształty fal fotoakustycznych z białych krwinek oraz komórek czerniaka. Białe krwinki, nie posiadając naturalnej pigmentacji, nie generują fal fotoakustycznych i objawiają się jako płaska linia szumu elektronicznego (po lewej). Pigmentowane komórki czerniaka generują wyraźną falę fotoakustyczną (po prawej).

Rysunek 2.  Po barwieniu immunocytochemicznym w hodowanych komórkach czerniaka widoczne są sygnały DAPI w kolorze niebieskim, natomiast MART1 jest zaznaczony na zielono.

Rysunek 3.  Nałożone na siebie obrazy dla DAPI i MART1, analogicznie do Rysunku 2, z CD45 jako wskaźnikiem leukocytów; rysunek przedstawia komórki czerniaka wśród kilku białych krwinek.

Dyskusja

Wykrywanie CTC jest nadal dziedziną wymagającą intensywnych badań, z bardzo niewielką liczbą zastosowań klinicznych ze względu na trudny problem izolacji rzadkich komórek nowotworowych. Oceniane są wiele innych technik wykrywania CTC, w tym RT-PCR, mikroprzepływowe wychwytywanie komórek, wychwytywanie immunomagnetyczne oraz inne metody^8-12. Jednak fotoakustyczna detekcja CMC wydaje się obiecująca, ponieważ jest bezmarkerowa i zapewnia szybki oraz dokładny sposób wychwytywania małych cząsteczek absorbujących światło.

Opisany protokół izolacji białych krwinek jest wysoce wydajny, niemniej w próbce występuje niewielka liczba czerwonych krwinek. Te zanieczyszczające komórki również absorbują światło laserowe, lecz w znacznie mniejszym stopniu. Aby upewnić się, że erytrocyty nie zakłócają działania naszego systemu detekcji czerniaka, do systemu wprowadzono próbki od pięciu zdrowych pacjentów; żadna z nich nie wygenerowała sygnału, co wskazuje, że czerwone krwinki występują w stężeniach na tyle niskich, że można je pominąć.

Przeprowadzono serię badań stężeń z wykorzystaniem hodowlanych komórek czerniaka, a fotoakustyczny system przepływowy okazał się czuły do poziomu 1 cell/μL (dane niepublikowane). Badania te są w toku i wkrótce obejmą próby z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów onkologicznych.

Ta technika fotoakustyczna jest również oceniana pod kątem zastosowania w niepigmentowanych CTC, takich jak w raku piersi i prostaty, poprzez przyłączanie egzogennych chromoforów. Przeprowadziliśmy wstępne badania z wykorzystaniem nanocząsteczek złota na komórkach nowotworowych13. Testy te wykazały, że nanocząsteczki mogą zapewnić niezbędną absorpcję optyczną do generowania fal fotoakustycznych. Pozostałym wyzwaniem technicznym jest selektywne przyłączanie takich cząsteczek do komórek nowotworowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	ABCD1234