Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3560

⸱

2 grudnia 2011

 , 
1Department of Physics, Syracuse University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości reakcji adsorpcji białek pierwszego rzędu oraz stałej adsorpcji Langmuira.

Streszczenie

Nanopory w stanie stałym są wykorzystywane do pomiarów na poziomie pojedynczych cząsteczek w celu zbadania lokalnej struktury i elastyczności kwasów nukleinowych 1-6, rozwijania białek 7 oraz powinowactwa wiązania różnych ligandów 8. Dzięki połączeniu tych nanoporów z techniką impulsu rezystywnego 9-12, pomiary takie można przeprowadzać w szerokim zakresie warunków i bez konieczności znakowania 3. W technice impulsu rezystywnego po obu stronach nanoporu wprowadza się jonowy roztwór soli. W konsekwencji jony są przenoszone z jednej strony komory na drugą pod wpływem przyłożonego potencjału transmembranowego, co skutkuje powstaniem stałego prądu. Przenikanie analizowanej substancji do nanoporu powoduje wyraźne odchylenie tego prądu, które można analizować w celu uzyskania informacji o pojedynczych cząsteczkach. Z zastosowaniem tej techniki można monitorować adsorpcję pojedynczych białek na ściankach nanoporu w szerokim zakresie warunków 13. Adsorpcja białek zyskuje na znaczeniu, ponieważ wraz z miniaturyzacją urządzeń mikroprzepływowych interakcje tych systemów z pojedynczymi białkami stają się istotnym zagadnieniem. Niniejszy protokół opisuje szybki test wiązania białek do powłok azotkowych, który można łatwo rozszerzyć na inne cienkie warstwy nadające się do drążenia nanoporów lub na funkcjonalizowane powierzchnie azotkowe. Można badać różne białka w szerokim zakresie roztworów i warunków denaturujących. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do badania bardziej podstawowych problemów za pomocą spektroskopii nanoporowej.

Protokół

1. Wytwarzanie nanoporów w stanie stałym w membranach z azotku krzemu

  1. Ustaw napięcie przyspieszenia mikroskopu FEI Tecnai F20 S/TEM na 200 kV. W przypadku użycia innego S/TEM, napięcie przyspieszenia powinno być większe lub równe 200 kV 9
  2. Włóż siatkę z oknem z azotku krzemu SPI o grubości 20 nm do uchwytu próbek TEM i oczyść ją plazmą tlenową przez 30 sekund w celu usunięcia zanieczyszczeń z uchwytu.
  3. Wprowadź próbkę do S/TEM i poczekaj na uzyskanie próżni. Po wytworzeniu próżni w S/TEM zlokalizuj okno azotkowe w trybie TEM w polu jasnym, szukając jasnego kwadratu na ronchigramie. Upewnij się, że TEM jest odpowiednio ustawiony, a następnie przeprowadź wyrównanie i ustawienie ostrości próbki.
  4. Przełącz S/TEM w tryb STEM. Użyj detektora HAADF (lub równoważnego) do obrazowania próbki i upewnij się, że jest ona prawidłowo wyrównana.
  5. Ustaw monochromator na niską wartość. Niższa wartość monochromatora pozwala na uzyskanie wyższego natężenia prądu elektronów dostępnych do wiercenia. Jeśli S/TEM nie posiada monochromatora, pomiń ten krok.
  6. Wybierz odpowiednią wielkość plamki (spot size) do wiercenia nanopora. Odpowiada ona średnicy wiązki elektronowej. Sonda o średnicy 3 nm sprawdza się dobrze przy wierceniu porów o średnicy 5 nm. Większa sonda (5 nm) będzie wiercić szybciej i stworzy większy por. Mniejsza sonda (1 nm) będzie wymagać dłuższego czasu wiercenia i stworzy mniejszy por.
  7. W razie potrzeby skoryguj ustawienia STEM.
  8. Ustaw ostrość membrany azotkowej i zwiększ powiększenie do x1.3M. Precyzyjne ustawianie ostrości należy przeprowadzać, monitorując ronchigram.
  9. Jeśli występuje jakikolwiek ruch próbki, należy odczekać do jej stabilizacji. Może to potrwać do godziny. W czasie oczekiwania zablokuj wiązkę elektronową, aby nie uszkodzić azotku.
  10. Umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie.
  11. Okresowo sprawdzaj próbkę, skanując ją detektorem HAADF, zarówno aby upewnić się, że nanopor jest wiercony (będzie wyglądał jak ciemna plamka), jak i aby sprawdzić, czy próbka się nie przemieszcza. Jeśli próbka lekko dryfuje, skoryguj pozycję sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporem.
  12. Obserwuj ronchigram, aby zidentyfikować moment powstania poru. Gdy obraz jest ostry, błona azotkowa ma mieniący się wygląd. Zniknie on w momencie powstania nanopora. Lekkie rozostrzenie ronchigramu pozwala dostrzec prążki Fresnela związane z nanoporem.
  13. Wykonaj obraz nanopora za pomocą HAADF.
  14. Wykonaj profil intensywności obrazu nanopora. Średnicę nanopora można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu.
  15. Powiększenie nanopora można przeprowadzić, przesuwając sondę elektronową wzdłuż krawędzi poru.
  16. Gdy nanopor osiągnie pożądaną średnicę, przełącz S/TEM w tryb TEM.
  17. Przywróć monochromator do standardowego ustawienia i obrazuj nanopor w trybie TEM w polu jasnym, aby potwierdzić jego rozmiar (Rys. 1).

2. Zwilżanie nanoporu w stanie stałym

  1. Odgazuj wodę dejonizowaną zawierającą 1 M KCl i 10 mM fosforanu potasu, pH 7,4. Można to zrobić, poddając roztwory próżni i umieszczając je w myjce ultradźwiękowej przez 20 minut.
  2. Umieść chip z azotku krzemu zawierający nanopor w zlewce Pyrex o pojemności 10 ml. Należy uważać, aby nie uszkodzić okienka z azotku, ponieważ jest ono bardzo delikatne. Postaw zlewkę na płycie grzejnej w dygestorium i ustaw temperaturę na 100°C.
  3. Wyczyść chip z nanoporem za pomocą roztworu piranha, zachowując szczególną ostrożność. Najpierw za pomocą pipety szklanej dodaj do naczynia 3 ml kwasu siarkowego. Następnie ostrożnie dodaj 1 ml nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego, aby przygotować roztwór piranha14. Prosimy o zachowanie wszelkich środków ostrożności.
  4. Pozostaw chip z nanoporem w roztworze piranha na 10 minut.
  5. Usuń roztwór piranha ze zlewki za pomocą pipety szklanej. Umieść go w odpowiednim pojemniku do przechowywania.
  6. Napełnij zlewkę odgazowaną wodą dejonizowaną, używając czystej pipety szklanej. Opróżnij zlewkę z wody i powtórz tę czynność co najmniej 5 razy.
  7. Wyjmij chip z nanoporem za pomocą czystej pęsety i osusz go delikatnym ssaniem.
  8. Natychmiast zamknij chip z nanoporem w komorze (Rys. 2a, 2b). Chip można uszczelnić w komorze za pomocą uszczelek O-ring lub uszczelniacza silikonowego.
  9. Wypełnij komorę roztworem KCl.
  10. Podłącz elektrody Ag/AgCl do komory (Rys. 2b). Elektrody można wykonać, namaczając srebrny drut w wybielaczu przez noc.
  11. Przyłoż potencjał transbłonowy między elektrodami i monitoruj odpowiedź prądową, korzystając z wzmacniacza patch-clamp Axon 200B w trybie clamp napięciowego (voltage-clamp).
  12. Na podstawie pomiarów sporządź krzywą I/V (prądowo-napięciową). Krzywa I/V powinna być silnie liniowa przy zastosowaniu 1 M KCl (Rys. 3). Przewodność nanoporu powinna odpowiadać jego średnicy. Jeśli nanopór nie wykazuje liniowej krzywej I/V, przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanoporu nie jest stabilny (Rys. 4a), oznacza to, że nanopór nie został odpowiednio zwilżony i należy powtórzyć mycie roztworem piranha.

3. Monitorowanie adsorpcji białek

  1. Kluczowe jest przeprowadzenie eksperymentów kontrolnych z membraną z pojedynczym nanoporem lub równoległą macierzą nanoporów (patrz poniżej), aby monitorować prąd w warunkach buforowych bez próbki białka. Zalecamy podjęcie dwóch następujących kroków: (i) zastosowanie buforu o wysokim stopniu czystości (czystość > 99,9%; stopień chromatograficzny) oraz (ii) zastosowanie buforu, którego oddziaływanie z nanoporem w stanie stałym nie generuje zdarzeń jednokanałowych. Dodatkowo zalecamy uzyskanie wysokiej czystości próbki białka przy użyciu standardowych procedur chemii białek. Czystość próbki białka należy sprawdzić za pomocą analizy żelowej z użyciem dodku sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) oraz wysokorozdzielczej spektrometrii mas 15.
  2. Do uziemionej kąpieli w komorze należy dodać oczyszczoną próbkę badanego białka. Należy odczekać czas niezbędny do dyfuzji próbki w całej kąpieli. Typowe stężenia białek, które można mierzyć, mieszczą się w zakresie od kilkunastu nM do μM 7,15-21.
  3. Należy przyłożyć potencjał napięcia przezbłonowego o polaryzacji przeciwnej do ładunku całkowitego badanego białka. Na przykład BSA posiada efektywny ładunek netto ujemny przy pH 7,4, w związku z czym należy przyłożyć dodatnie napięcie. Przyłożone napięcie tworzy gradient potencjału wewnątrz nanoporu, a białka o przeciwnych ładunkach będą napędzane przez przeciwstawne siły. Tylko polaryzacje napięcia, które wprowadzają białka do nanoporu, będą generować mierzalne sygnały.
  4. Przyłożony potencjał o wartości 200 mV powinien być wystarczający do zaobserwowania większości analitów białkowych. Zdarzenia będą pojawiać się jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej (Rys. 4b). Jeśli sygnał nie zostanie zaobserwowany, należy zwiększyć stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu. Nanopory azotkowe mogą wytrzymać napięcie rzędu kilku woltów.
  5. Adsorpcja białek będzie objawiać się jako długotrwałe zmiany prądu bazowego nanoporu (Rys. 4c).

4. Możliwości funkcjonalizacji nanoporów

Istnieje kilka metod wprowadzania grup funkcyjnych do azotku krzemu 22,23. Większość filmów azotkowych posiada cienką warstwę tlenku na powierzchni, a ekspozycja na ozon może stworzyć dodatkową warstwę tlenku, jeśli jest to konieczne. Można stosować różne organosilany, które ulegają samoorganizacji na takich warstwach. Szczególne zainteresowanie budzi aminosilan, który samoorganizuje się i może być dalej modyfikowany (np. kwasem karboksylowym i aldehydami), co pozwala na badanie szeregu powierzchni organicznych. Po przemyciu nanoporu roztworem piranhy i umocowaniu go w komorze, aminę można dodać bezpośrednio do kąpieli w komorze z elektrolitem wspomagającym 0,5 M TBACl (tetrabutylochlorek amonu), używając bezwodnego MeOH (metanolu) jako rozpuszczalnika. Formowanie monowarstwy można monitorować poprzez przyłożenie napięcia polaryzującego 400 mV i pomiar spadku natężenia prądu 23.

5. Wyznaczanie pozornej stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu oraz stałej adsorpcji Langmuira przy użyciu równoległych macierzy nanoporów

5.1 Pozorne stałe szybkości reakcji pierwszego rzędu dla absorpcji i desorpcji

Podkreślamy, że pozytywnym aspektem tej metodologii jest możliwość obserwacji pojedynczych adsorpcji na poziomie pojedynczej cząsteczki. Pomiary adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej w skali pojedynczej cząsteczki można przeskalować poprzez zastosowanie równoległych matryc nanoporów w stanie stałym. Matryca nanoporów jest niezbędna ze względu na konieczność przebadania wielu porów w celu uzyskania wiarygodnych statystyk. W tym celu zastosowanie matrycy nanoporów umożliwiłoby monitorowanie pojedynczych adsorpcji, a także pomiar wielu zdarzeń do dalszej analizy. Matrycę nanoporów w azotku krzemu można utworzyć zgodnie z powyższym protokołem, po prostu wiercąc wiele otworów w próbce. Każdy nanopor powinien mieć podobny rozmiar. Odpowiednie powinny być matryce nanoporów o wymiarach 6x6 lub 7x7. Po dodaniu anality białkowego do komory prąd będzie spadać wykładniczo zgodnie z następującym wzorem:

It = I∞ - (I∞ - I0)exp(-k't)

Tutaj It oznacza prąd w czasie eksperymentalnym t. I0 to pierwotny prąd przepływający przez macierz nanoporów. I∞ oznacza prąd na poziomie nasycenia (tj. w nieskończoności). k' to pozorna stała szybkości reakcji pierwszego rzędu, którą można wyznaczyć z dopasowania krzywej eksperymentalnej. Wyższą wartość k' można interpretować jako szybszą szybkość adsorpcji. Stosunek I∞/I0, nazywany również znormalizowanym prądem nasycenia, jest liczbą bezwymiarową z zakresu od 0 do 1. Parametr ten stanowi miarę stopnia zajęcia przez zaadsorbowane anality białkowe. Zatem każdemu odrębnemu warunkowi eksperymentalnemu powinny być przypisane dwa konkretne parametry wyjściowe: I∞/I0 oraz k'.

Należy zauważyć, że pozorne stałe szybkości adsorpcji pierwszego rzędu oraz znormalizowane natężenia prądu są zależne od efektywnego czasu przebywania białek w nanoporach. Czas ten zależy od stężenia analizowanych białek w objętościowej fazie wodnej 24. W związku z tym konieczne jest wprowadzenie dodatkowej korekty tych wartości w oparciu o efektywny czas przebywania białek wewnątrz nanoporu. Sugerujemy pomiar częstotliwości szybkich zdarzeń (translokacji) i pomnożenie go przez średni czas przebywania podczas takich zdarzeń. Pozwoli to wyznaczyć średni czas przebywania białek wewnątrz nanoporu w jednostce czasu.

Stałą szybkości desorpcji można wyznaczyć również przy użyciu równoległego układu nanoporów. Gdy poziom prądu osiągnie nasycenie (I∞), należy odwrócić polaryzację napięcia, aby zapobiec dalszemu uwięzieniu białek w nanoporach. Desorpcja pojedynczych białek będzie objawiać się zmianą rejestrowanego prądu w kierunku wartości wyższych. Stałą szybkości można będzie następnie wyznaczyć na podstawie wzrostu poziomu prądu.

5.2 Stała adsorpcji Langmuira

Absorpcja analitów białkowych na nieorganicznych powierzchniach nanoporów zależy od stężenia białka w fazie wodnej. Zjawisko to zostało już zaobserwowane na poziomie pojedynczych cząsteczek 13. Jeśli θ reprezentuje znormalizowany prąd nasycenia (I∞ / I0), to typowe równanie izotermy Langmuira jest opisane następującym wyrażeniem:

Równanie izotermy Langmuira θ=αC/(1+αC); analiza adsorpcji; wzór w badaniu naukowym.

gdzie C to stężenie białka w fazie wodnej. α to stała adsorpcji Langmuira. Stała ta rośnie wraz ze wzrostem energii wiązania podczas adsorpcji oraz wraz ze spadkiem temperatury. Zebranie punktów danych θ będzie wymagało przeprowadzenia pomiarów z wykorzystaniem równoległych układów przy różnych stężeniach białka w fazie wodnej. Dane należy analizować w połączeniu z innymi technikami, aby zweryfikować wartość dopasowanej stałej adsorpcji Langmuira. Ponadto do interpretacji uzyskanych danych eksperymentalnych można wykorzystać pełnoatomowe symulacje dynamiki molekularnej 25,26.

6. Reprezentatywne wyniki

Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą następujące. Prąd otwartego poru powinien być wysoce stabilny, co pokazano na Ryc. 4a. Charakterystyki I/V nanoporu powinny być wysoce liniowe w 1 M KCl, 10 fosforanu potasu, pH 7,4, co przedstawiono na Ryc. 2. Nachylenie dopasowania liniowego do krzywej I/V pozwoli wyznaczyć przewodność jednostkową nanoporu. Przewodność jest bezpośrednio powiązana z średnicą nanoporu i powinna odpowiadać równaniu: Równanie statycznej równowagi G≈(πd²/4l)σ; wzór na nośność; analiza naprężeń mechanicznych., gdzie G to przewodność nanoporu, d to jego średnica, l to jego długość, a σ to przewodność roztworu w komorze 14. Wartość ta powinna być zgodna z dokładnością do 30%. Jeśli jest ona zbyt mała, prawdopodobnie por nie został zwilżony. Po dodaniu białka powinny wystąpić szybkie zdarzenia, jak pokazano na Ryc. 4b. Adsorpcja białka objawia się jako długotrwały spadek prądu, co przedstawiono na Ryc. 4c. Niektóre białka są wysoce labilne i ulegają transformacji strukturalnej wewnątrz poru. W takim przypadku długotrwałemu spadkowi napięcia towarzyszyć będą szybkie fluktuacje.

Nanocząsteczka na obrazie TEM; skala 10 nm; analiza mikroskopowa; badania nad nauką o materiałach.
Rycina 1. Nanopor w stanie stałym wykonany przy użyciu Tecnai F20 S/TEM. Por został wywiercony w trybie STEM do średnicy 20 nm. Obraz wykonano w trybie TEM w polu jasnym. Warstwa azotku miała grubość 30 nm.

Schemat układu siatki TEM i o-ringu dla eksperymentu pomiaru roztworu z opisanymi elementami.
Rycina 2. Komora służąca do umieszczenia pojedynczego nanoporu w stanie stałym w pomiarach impulsu rezystywnego. A) Komora i chip krzemowy z wolnostojącym oknem azotkowym (siatka TEM). Nanopor jest wiercony w azotku przed załadowaniem. Czerwone o-ringi są używane do zapewnienia szczelnego zamknięcia wokół chipu, który oddziela dwie kąpiele roztworu jonowego. B) Schemat komory przedstawiający rozmieszczenie kąpieli z roztworami i elektrod względem nanoporu.

Wykres prądowo-napięciowy; charakterystyka nanomateriału; analiza rezystancji elektrycznej; wykres liniowy.
Rysunek 3. Typowe przebiegi I/V dla nanoporów w stanie stałym o różnych średnicach. Jednokanałowe przebiegi elektryczne zarejestrowano w 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8.5. Nanopory wykonano w azotku krzemu o grubości 30 nm. Należy zauważyć, że grubość azotku wpływa na przewodność jednostkową nanoporu.

Wykresy aktywności kanałów jonowych: prezentacja natężenia prądu (pA) w funkcji czasu (10s) w trzech warunkach eksperymentalnych.
Rysunek 4. Pomiarowe zapisy prądu pojedynczego kanału i detekcja adsorpcji białka. A) Zapis elektryczny pojedynczego kanału przedstawiający prąd otwarcia nanoporu o średnicy 10 nm. B) Odchylenia prądu reprezentują wnikanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do wnętrza nanoporu. C) Adsorpcja BSA na powierzchni azotku. Wszystkie zapisy pochodzą z tego samego nanoporu w 1 M KCl, 10 mM fosforanie potasu, pH 7.4. Zastosowany potencjał przezbłonowy wynosił +40 mV, a BSA dodano do kąpieli w komorze uziemionej w stężeniu 120 nM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spontaniczna adsorpcja białek na powierzchniach w stanie stałym 27-29 ma fundamentalne znaczenie w wielu obszarach, takich jak zastosowania biochipów oraz projektowanie nowej klasy funkcjonalnych biomateriałów hybrydowych. Wcześniejsze badania wykazały, że białka zaadsorbowane na powierzchniach w stanie stałym nie wykazują mobilności bocznej ani znaczących szybkości desorpcji, w związku z czym adsorpcję białek uznaje się ogólnie za proces nieodwracalny i nieswoisty 30-32. Przyjmuje się, że adsorpcja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Grazulowi (Cornell University), Andre Marzialiemu (The University of British Columbia at Vancouver) oraz Vincentowi Tabard-Cossie (The University of Ottawa) za udzielone porady. Niniejsza praca została sfinansowana częściowo z grantów przyznanych przez amerykańską National Science Foundation (DMR-0706517 i DMR-1006332) oraz National Institutes of Health (R01-GM088403). Wiercenie nanoporów zostało przeprowadzone w Electron Microscopy Facility w Cornell Center for Materials Research (CCMR) przy wsparciu programu National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Centers (MRSEC) (DMR 0520404). Przygotowanie membran z azotku krzemu odbyło się w Cornell NanoScale Facility, członku National Nanotechnology Infrastructure Network, który jest wspierany przez National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tecnai F20 S/TEMFEIS/TEM wymaga napięcia przyspieszającego ≥200kV i źródła emisji polowej.
Okienko z membrany azotku krzemu o grubości 20 nm do TEMSPI Supplies4163SN-BA
Wzmacniacz patch-clamp Axon Axopatch 200BMolecular Devices
Axon Digidata 1440AMolecular Devices
Oprogramowanie pCLAMP 10Molecular DevicesOprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych
Kwas siarkowyFisher ScientificA300
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325
Silikonowe pierścienie O-ringMcMaster-Carr003 S70Alternatywnie można użyć PDMS
Drut srebrnySigma-Aldrich348759Do elektrod
SPC Technology, pin stykowy D-subNewark Inc9K4978Do elektrod
Chlorek potasuSigma-AldrichP9541
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-AldrichP2222
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP5379
PDMSDow CorningZestaw elastomeru Sylgard 184. Do wykonania komory.
Uszczelniacz Kwik-CastWorld Precision Instruments, Inc.KWIK-CASTSzybko utwardzalny uszczelniacz silikonowy
Płyta grzewczaFisher Scientific
Klatka Faradaya

Bibliografia

  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika impulsu rezystancyjnegodetekcja pojedynczych cząsteczekwiercenie nanoporówmembrana azotkowablokada prądu jonowegowzmacniacz patch-clamptest wiązania białekpotencjał błonowy
Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.