Artykuł metodologiczny

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

DOI:

10.3791/3560

⸱

2 grudnia 2011

 , 
1Department of Physics, Syracuse University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę wykorzystania nanoporów ciała stałego do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda wykorzystuje zasadę impulsu rezystancyjnego, co pozwala na sondowanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczej cząsteczki. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek jest daleki od równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych układów syntetycznych nanoporów, umożliwiających ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu adsorpcji białek oraz stałej adsorpcji Langmuira.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanopory w stanie stałym zostały użyte do wykonania pomiarów na poziomie pojedynczej cząsteczki w celu zbadania lokalnej struktury i elastyczności kwasów nukleinowych 1-6, rozwoju białek 7 i powinowactwa do wiązania różnych ligandów 8. Dzięki sprzężeniu tych nanoporów z techniką impulsów rezystancyjnych 9-12, takie pomiary można wykonywać w wielu różnych warunkach i bez konieczności znakowania 3. W technice impulsów rezystancyjnych roztwór soli jonowej jest wprowadzany po obu stronach nanoporów. Dlatego jony są kierowane z jednej strony komory na drugą przez przyłożony potencjał transbłonowy, co skutkuje stałym prądem. Podział analitu na nanopory powoduje dobrze zdefiniowane odchylenie tego prądu, które można analizować w celu wyodrębnienia informacji o pojedynczej cząsteczce. Za pomocą tej techniki można monitorować adsorpcję pojedynczych białek do ścianek nanoporowych w szerokim zakresie warunków 13. Adsorpcja białek zyskuje na znaczeniu, ponieważ wraz ze zmniejszaniem się rozmiarów urządzeń mikroprzepływowych interakcja tych układów z pojedynczymi białkami staje się problemem. Protokół ten opisuje szybki test wiązania białek z warstwami azotkowymi, który można łatwo rozszerzyć na inne cienkie warstwy podatne na wiercenie nanoporowe lub na funkcjonalizowane powierzchnie azotkowe. Różnorodne białka mogą być badane w szerokim zakresie roztworów i warunków denaturacji. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do zbadania bardziej podstawowych problemów za pomocą spektroskopii nanoporowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja nanoporów w stanie stałym w membranach z azotku krzemu

  1. Doprowadzić FEI Tecnai F20 S/TEM do napięcia przyspieszenia 200 kV. W przypadku zastosowania innego S/TEM napięcie przyspieszenia powinno być większe lub równe 200 kV 9
  2. Załaduj siatkę okienkową z azotku krzemu SPI o grubości 20 nm do uchwytu próbki TEM i wyczyść plazmą tlenową przez 30 sekund, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z uchwytu.
  3. Załaduj próbkę do S/TEM i pozwól, aby próżnia opadła. Gdy S/TEM zostanie przepompowany do próżni, znajdź okno azotkowe w trybie TEM jasnego pola, szukając jasnego kwadratu na Ronchigramie. Upewnij się, że TEM jest prawidłowo wyrównany, a następnie wyrównaj i ustaw ostrość próbki.
  4. Przełącz S/TEM w tryb STEM. Użyj detektora HAADF (lub równoważnego), aby zobrazować sample i upewnij się, że jest prawidłowo wyrównany.
  5. Ustaw monochromator na niską wartość. Niższa wartość monochromatora pozwala na uzyskanie większego prądu elektronów dostępnych do wiercenia. Jeśli S/TEM nie ma monochromatora, zignoruj ten krok.
  6. Wybierz odpowiedni rozmiar plamki do wiercenia w nanoporach. Odpowiada to średnicy sondy elektronowej. Sonda 3 nm dobrze sprawdza się do wiercenia porów o średnicy 5 nm. Większa sonda (5 nm) będzie wiercić szybciej i tworzyć większe pory. Mniejsza sonda (1 nm) zajmie więcej czasu na wiercenie i utworzenie mniejszych porów.
  7. W razie potrzeby dostosuj wyrównania STEM.
  8. Skoncentruj membranę azotkową i ustaw ją w powiększeniu x1.3M. Precyzyjne ustawianie ostrości powinno odbywać się poprzez monitorowanie Ronchigramu.
  9. Jeśli próbka jest poruszana, poczekaj, aż próbka się ustabilizuje. Może to potrwać do godziny. Wyłącz wiązkę elektronów podczas oczekiwania, aby nie uszkodzić azotku.
  10. Umieść sondę elektronową na próbce i rozpocznij wiercenie.
  11. Okresowo sprawdzaj próbkę, skanując ją detektorem HAADF, zarówno w celu upewnienia się, że nanopory są wiercone (będą wyglądać jak ciemna plama), jak i w celu sprawdzenia, czy próbka nie jest poruszana. Jeśli próbka nieznacznie dryfuje, dostosuj położenie sondy elektronowej tak, aby znajdowała się nad nanoporami.
  12. Obserwuj Ronchigram, aby określić, kiedy uformowały się pory. Po ustawieniu ostrości warstwa azotkowa ma połyskujący wygląd. Zniknie, gdy utworzą się nanopory. Ustawienie Ronchigramu nieco nieostro pozwala dostrzec prążek Fresnela związanego z nanoporami.
  13. Zrób zdjęcie nanoporów za pomocą HAADF.
  14. Wykonaj profil intensywności obrazu nanoporowego. Średnicę nanoporów można oszacować na podstawie najciemniejszego obszaru profilu.
  15. Powiększenie nanoporów można przeprowadzić poprzez przesuwanie sondy elektronowej wzdłuż krawędzi porów.
  16. Gdy nanopory osiągną pożądaną średnicę, przełącz S/TEM w tryb TEM.
  17. Doprowadź monochromator do standardowych ustawień i zobrazuj nanopory za pomocą TEM jasnego pola, aby potwierdzić rozmiar (rys. 1).

2. Zwilżanie nanoporów ciała stałego

  1. Odgazowywanie wody dejonizowanej zawierającej 1 M KCl, 10 mM fosforanu potasu, pH 7,4. Można to zrobić, umieszczając roztwory w próżni i umieszczając je w sonikatorze kąpielowym na 20 minut.
  2. Umieścić nanopory zawierające wiórki z azotku krzemu w zlewce Pyrex o pojemności 10 ml. Uważaj, aby nie rozbić okienka azotkowego, ponieważ jest ono bardzo delikatne. Umieścić zlewkę na płycie grzejnej w dygestoriach i ustawić na 100°C.
  3. Wyczyść chip nanoporowy roztworem piranii, zachowując szczególną ostrożność. Najpierw dodaj 3 ml kwasu siarkowego do pojemnika za pomocą szklanej pipety. Następnie ostrożnie dodaj 1 ml nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego, aby uzyskać roztwór piranii14. Prosimy o podjęcie wszelkich środków ostrożności.
  4. Pozwól chipowi nanoporowemu zanurzyć się w roztworze piranii przez 10 minut.
  5. Usunąć roztwór piranii ze zlewki za pomocą szklanej pipety. Umieść go w odpowiednim pojemniku do przechowywania.
  6. Napełnij zlewkę odgazowaną, zdejonizowaną wodą za pomocą czystej szklanej pipety. Opróżnij zlewkę z wodą i powtórz czynność co najmniej 5 razy.
  7. Usuń chip nanoporowy za pomocą czystej pęsety i wysusz go przez lekkie odsysanie
  8. Natychmiast uszczelnij chip nanoporowy w komorze (rys. 2a, 2b). Chip może być zabezpieczony w komorze za pomocą O-ringów lub uszczelniacza silikonowego.
  9. Napełnij komorę roztworem KCl
  10. Podłącz elektrody Ag/AgCl do komory (rys. 2b). Elektrody można wykonać przez namoczenie srebrnego drutu w wybielaczu przez noc.
  11. Zastosuj potencjał transbłonowy na elektrodach i monitoruj odpowiedź prądową za pomocą wzmacniacza patch-clamp Axon 200B w trybie cęgów napięciowych.
  12. Na podstawie pomiarów skonstruuj krzywą I/V (prąd-napięcie). Krzywa I/V powinna być wysoce liniowa w przypadku stosowania 1 M KCl (rys. 3). Przewodność nanoporów powinna odpowiadać jego średnicy. Jeśli nanopory nie wykazują liniowej krzywej I/V, przewodność jest zbyt niska lub prąd otwarty nanopora nie jest stabilny (rys. 4a), oznacza to, że nanopory nie są odpowiednio zwilżone i płukanie piranii należy powtórzyć.

3. Monitorowanie adsorpcji białek

  1. Niezwykle ważne jest przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych z membraną jednonanoporową lub równoległym układem nanoporów (patrz poniżej) w celu monitorowania prądu w warunkach buforowych bez próbki białka. Zalecamy następujące dwa kroki: (i) użycie buforu o wysokim poziomie czystości (czystość > 99,9%; poziom chromatograficzny) oraz (ii) użycie buforu, którego oddziaływanie z nanoporem w stanie stałym nie powoduje zdarzeń jednokanałowych. Ponadto zalecamy uzyskanie próbki białka o wysokiej czystości przy użyciu standardowych procedur chemii białek. Czystość próbki białka należy sprawdzić za pomocą analizy żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowego dodecylu sodu (SDS-PAGE) i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości 15.
  2. Dodać oczyszczoną próbkę białka, które ma być badane, do uziemionej kąpieli w komorze. Odczekać, aż próbka rozprowadzi się przez cały czas kąpieli. Typowe stężenia białka, które można zmierzyć, mieszczą się w zakresie od 7,15-21 do μM.
  3. Zastosuj polaryzację napięcia potencjału transbłonowego o polaryzacji przeciwnej do całkowitego ładunku badanego białka. Na przykład BSA ma efektywny ładunek ujemny netto przy pH 7,4, dlatego należy zastosować dodatnie odchylenie napięcia. Przyłożone napięcie tworzy gradient potencjału we wnętrzu nanoporów, a białka o przeciwnych ładunkach będą napędzane przez przeciwne siły. Tylko polaryzacja napięcia, która kieruje białka do nanoporów, stworzy mierzalne sygnały.
  4. Przyłożony potencjał o wielkości 200 mV powinien być wystarczająco duży, aby można było zaobserwować większość analitów białkowych. Zdarzenia pojawią się jako przejściowe odchylenia prądu od linii bazowej (rys. 4b). Jeśli nie zaobserwuje się żadnego sygnału, zwiększ stężenie białka w komorze. Wyższe napięcia poprawiają stosunek sygnału do szumu. Nanopory azotkowe mogą wytrzymać kilka woltów.
  5. Adsorpcje białek pojawią się jako długotrwałe zmiany w prądzie podstawowym nanoporów (ryc. 4c).

4. Możliwości funkcjonalizacji nanoporów

Istnieje kilka metod stosowania grup funkcyjnych do azotku krzemu 22,23. Większość folii azotkowych ma cienką warstwę tlenku na zewnątrz, a narażenie na ozon może w razie potrzeby utworzyć dodatkową warstwę tlenku. Na takich warstwach można stosować różne organozylany i samodzielnie je montować. Szczególnie interesujący jest aminozlan, który sam się organizuje i może być dalej modyfikowany (tj. kwas karboksylowy i aldehydy), co pozwala na kontrolę szeregu powierzchni organicznych. Po przemyciu nanoporów piranią i zabezpieczeniu w komorze, amina może być dodana bezpośrednio do kąpieli komorowej z elektrolitem pomocniczym o sile 0,5 M TBACl (tetrabutyloamon) i bezwodnym MeOH (metanolem) stosowanym jako rozpuszczalnik. Tworzenie monowarstw można monitorować poprzez zastosowanie polaryzacji napięcia 400 mV i pomiar spadku prądu 23.

5. Wyznaczanie pozornej stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu i stałej adsorpcji Langmuira za pomocą równoległych układów nanoporowych

5.1 Pozorne stałe szybkości reakcji pierwszego rzędu dla absorpcji i desorpcji

Podkreślamy, że pozytywnym aspektem tej metodologii jest możliwość obserwacji indywidualnych adsorpcji na poziomie pojedynczej cząsteczki. Pomiary adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej w pojedynczych cząsteczkach można zwiększyć poprzez zastosowanie równoległych układów nanoporów w stanie stałym. Równoległy układ nanoporów jest konieczny ze względu na konieczność oznaczenia wielu porów w celu uzyskania wiarygodnych statystyk. W tym celu zastosowanie matrycy nanoporowej umożliwiłoby monitorowanie poszczególnych adsorpcji, a także pomiar wielu zdarzeń w celu dalszej analizy. Szereg nanoporów w azotku krzemu może zostać utworzony przez powyższy protokół po prostu przez wywiercenie wielu otworów w próbce. Każdy nanopor powinien mieć podobną wielkość. Układy nanoporów 6x6 lub 7x7 powinny być wystarczające. Po dodaniu analitu białkowego do komory, prąd zanika w sposób wykładniczy z następującym wyrażeniem:

It = I∞ - (I∞ - I0)exp(-k't)

Tutaj It, oznacza prąd w czasie eksperymentalnym t. I0 to pierwotny prąd przepływający przez układ nanoporowy. I∞ oznacza prąd na poziomie nasycenia (tj. nieskończoność). k' jest pozorną stałą szybkości reakcji pierwszego rzędu, którą można wyznaczyć na podstawie dopasowania krzywej doświadczalnej. Większe k' można interpretować jako szybszy współczynnik adsorpcji. Stosunek I∞/I0, zwany również znormalizowanym prądem nasycenia, jest liczbą bezwymiarową z zakresu od 0 do 1. Ten parametr jest miarą zajętości przez zaadsorbowane anality białkowe. W związku z tym każdy odrębny warunek doświadczalny powinien być powiązany z dwoma określonymi parametrami wyjściowymi I∞/I0 i k'.

Należy zauważyć, że na pozorne stałe szybkości adsorpcji pierwszego rzędu i znormalizowane prądy wpływa efektywny czas spędzony przez białka w nanoporach. Czas ten jest zależny od stężenia analitów białkowych w masowej fazie wodnej 24. W związku z tym należy wprowadzić dodatkową korektę tych liczb w oparciu o efektywny czas spędzony przez białka we wnętrzu nanoporów. Sugerujemy mierzenie częstotliwości zdarzeń szybkich (translokacyjnych) i mnożenie jej przez średni czas przebywania takich zdarzeń. Da to średni czas spędzania białek we wnętrzu nanoporów w jednostce czasu.

Stała szybkości desorpcji może być również wyznaczona za pomocą równoległego układu nanoporów. Gdy tylko poziom prądu osiągnie nasycenie (I∞), napięcie powinno zostać odwrócone, aby żadne białka nie były już uwięzione w nanoporach. Desorpcji poszczególnych białek będzie towarzyszyła zmiana zarejestrowanego prądu w kierunku większych wartości. Stała szybkości zostanie następnie wyodrębniona ze wzrostu bieżącego poziomu.

5.2 Stała adsorpcji Langmuira

Absorpcja analitów białkowych na nieorganiczne powierzchnie nanoporów zależy od stężenia białka w fazie wodnej. Zjawisko to zaobserwowano już na poziomie pojedynczej cząsteczki 13. Jeśli θ reprezentuje znormalizowany prąd nasycenia (I∞ / I0), to typowe równanie izotermy Langmuira jest określone następującym wyrażeniem:

figure-protocol-1

gdzie C to stężenie białka w fazie wodnej. α jest stałą adsorpcji Langmuira. Stała ta wzrasta wraz ze wzrostem energii wiązania adsorpcji i wraz ze spadkiem temperatury. Zbieranie punktów danych θ będzie wykorzystywać pomiary za pomocą równoległych tablic przeprowadzone przy różnych stężeniach białka w fazie wodnej. Dane powinny być analizowane w połączeniu z innymi technikami w celu sprawdzenia wielkości dopasowanej stałej adsorpcji Langmuira. Ponadto, symulacje pełnej atomistycznej dynamiki molekularnej 25,26 mogą być również wykorzystane do pomocy w interpretacji uzyskanych danych eksperymentalnych.

6. Reprezentatywne wyniki

Typowe wyniki dla nanoporów w stanie stałym będą następujące. Prąd w otwartych porach powinien być bardzo stabilny, jak pokazano na rys. 4a. Charakterystyka I/V nanoporów powinna być wysoce liniowa w 1 M KCl, 10 fosforanie potasu, pH 7,4, jak pokazano na rys. 2. Nachylenie dopasowania liniowego do krzywej I/V zapewni jednostkową przewodność nanoporów. Przewodność ma bezpośredni związek ze średnicą nanoporów i powinna pasować do równania: figure-protocol-2, gdzie G jest przewodnością nanoporów, d jest jego średnicą, l jest jego długością, a σ jest przewodnością roztworu w komorze 14. Ta wartość powinna być zgodna z dokładnością do 30%. Jeśli jest zbyt mały, twoje pory prawdopodobnie nie są zwilżone. Po dodaniu białka powinny nastąpić gwałtowne zdarzenia, jak widać na ryc. 4b. Adsorpcja białek to długożyciowy spadek prądu, jak pokazano na rys. 4c. Niektóre białka są bardzo labilne i ulegają przemianom strukturalnym we wnętrzu porów. W takim przypadku długotrwałemu spadkowi napięcia będą towarzyszyć gwałtowne wahania.

figure-protocol-3
Rysunek 1. Nanopory półprzewodnikowe wytworzone przy użyciu Tecnai F20 S/TEM. Pory zostały wywiercone w trybie STEM do średnicy 20 nm. Zdjęcie zostało wykonane w trybie TEM jasnego pola. Azotek miał grubość 30 nm.

figure-protocol-4
Rysunek 2. Komora służąca do przechowywania pojedynczego nanopora w stanie stałym w pomiarach impulsów rezystancyjnych. A) Komora i chip krzemowy z wolnostojącym oknem azotkowym (siatka TEM). Nanopory są wiercone w azotku przed załadowaniem. Czerwone O-ringi służą do tworzenia dobrego uszczelnienia wokół chipa, który oddziela dwie kąpiele roztworu jonowego. B) Schemat komory przedstawiający rozmieszczenie kąpieli roztworowych i elektrod w stosunku do nanoporów.

figure-protocol-5
Rysunek 3. Typowe ścieżki I/V dla nanoporów w stanie stałym o różnych średnicach. Jednokanałowe ślady elektryczne pobrano w 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopory wywiercono w azotku krzemu o grubości 30 nm. Należy pamiętać, że grubość azotku wpłynie na przewodność jednostkową nanoporów.

figure-protocol-6
Rysunek 4. Pomiar jednokanałowych śladów prądowych i detekcja adsorpcji białek. A) Jednokanałowy ślad elektryczny pokazujący otwarty prąd nanoporowy o średnicy 10 nm. B) Odchylenia prądu reprezentują podział albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do wnętrza nanopora. C) Adsorpcja BSA na powierzchni azotku. Wszystkie ślady pochodzą z tych samych nanoporów w 1 M KCl, 10 mM fosforanu potasu, pH 7,4. Zastosowany potencjał transbłonowy wynosił +40 mV, a do uziemionej kąpieli komorowej dodano BSA o stężeniu 120 nM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontaniczna adsorpcja białek na powierzchniach w stanie stałym 27-29 ma fundamentalne znaczenie w wielu obszarach, takich jak zastosowania biochipów i projektowanie nowej klasy funkcjonalnych biomateriałów hybrydowych. Wcześniejsze badania wykazały, że białka zaadsorbowane na powierzchniach ciała stałego nie wykazują ruchliwości bocznej ani znaczących szybkości desorpcji, a zatem adsorpcja białek jest ogólnie uważana za proces nieodwracalny i niespecyficzny 30-32. Uważa się, że adsorpcja białek na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Grazulowi (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia w Vancouver) i Vincentowi Tabard-Cossa (The University of Ottawa) za ich rady. Praca ta jest częściowo finansowana z grantów amerykańskiej Narodowej Fundacji Nauki (DMR-0706517 i DMR-1006332) oraz National Institutes of Health (R01-GM088403). Wiercenie nanoporowe zostało przeprowadzone w Zakładzie Mikroskopii Elektronowej Cornell Center for Materials Research (CCMR) przy wsparciu programu National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Centers (DMR 0520404). Przygotowanie membran z azotku krzemu przeprowadzono w Cornell NanoScale Facility, będącym członkiem National Nanotechnology Infrastructure Network, który jest wspierany przez National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tecnai F20 S/TEMFEIS/TEM wymaga napięcia przyspieszenia ≥ 200kV i źródło emisji w terenie.
Okno membrany z azotku krzemu o grubości 20 nm do materiałów eksploatacyjnych TEMSPI4163SN-BA
Wzmacniacz patch-clamp Axon Axopatch 200Bmolekularne
Urządzenia molekularneAxon Digidata 1440A
pCLAMP 10UrządzeniaOprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych
KwassiarkowyNadtlenek wodoru Fisher ScientificA300
Fisher ScientificH325
silikonowe O-ringiMcMaster-Carr003 S70Alternatywnie użyj
srebrnego drutuSigma-Aldrich348759Do elektrod
Technologia SPC, styk D sub, pinNewark Inc9K4978Do elektrod
chlorek potasuSigma-AldrichP9541
fosforan potasu dwuzasadowySigma-AldrichP2222
fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP5379
PDMSDow CorningSylgar 184 Zestaw elastomerów. Do wykonania komory.
Kwik-CastSealant World Precision Instruments, Inc.KWIK-CASTSzybko działająca silikonowa
płyta grzejnaKlatka
Urządzenia Oprogramowanie molekularne PDMS Faradaya Fisher Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).
  4. Branton, D. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).
  5. Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).
  6. Peng, H., Ling, X. S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).
  7. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).
  8. Zhao, Q. Detecting SNPs using a synthetic nanopore. Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).
  9. Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).
  10. Sexton, L. T. Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor. J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).
  11. Martin, C. R., Siwy, Z. S. Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores. Science. 317, 331-332 (2007).
  12. Sexton, L. T. An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing. J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface. J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).
  14. Selvin, P. R., Ha, T. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  15. Han, A. Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores. Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).
  16. Han, A. Sensing protein molecules using nanofabricated pores. Appl. Phys. Lett. 88, (2006).
  17. Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore. Appl. Phys. Lett. 91, (2007).
  18. Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis. Nano. Lett. , (2010).
  19. Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. Data analysis of translocation events in nanopore experiments. Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).
  20. Oukhaled, A. Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force. ACS. Nano.. , (2011).
  21. Yusko, E. C. Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls. Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).
  22. Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).
  23. Wanunu, M., Meller, A. Chemically modified solid-state nanopores. Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).
  24. Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore. Biophys. J. 85, 897-910 (2003).
  25. Aksimentiev, A. Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore. Nanoscale. 2, 468-483 (2010).
  26. Timp, W. Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life. IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).
  27. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry. J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).
  28. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes. J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).
  29. Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces. Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).
  30. Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy. Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).
  31. Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events. J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).
  32. Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin. Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).
  33. Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips. Scanning. 21, 394-397 (1999).
  34. Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures. Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).
  35. Giannoulis, C. S., Desai, T. A. Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films. J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).
  36. Gustavsson, J. Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications. J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).
  37. Shirshov, Y. M. Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface. Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).
  38. Chen, P. Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores. Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).
  39. Siwy, Z. Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).
  40. Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore. Anal. Chem. , (2009).
  41. Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).
  42. Bezrukov, S. M. Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport. J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Solid State NanoporesProtein AdsorptionResistive Pulse TechniqueSingle Molecule DetectionNanopore DrillingNitride MembraneIonic Current BlockadePatch Clamp AmplifierProtein Binding AssayTransmembrane Potential

Powiązane artykuły