W niniejszej pracy opisujemy tanią, szybką, kontrolowaną i jednorodną procedurę fiksacji z użyciem 4% paraformaldehydu podawanego przez perfuzję układu naczyniowego: poprzez serce szczura, aby uzyskać jak najlepszą konserwację mózgu.
Artykuł metodologiczny
Perfuzyjna fiksacja całego organizmu gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem fiksacji jest szybkie i jednorodne utrwalenie tkanki w stanie zbliżonym do żywego organizmu. Choć bezpośrednie umieszczenie tkanki w utrwalaczu sprawdza się w przypadku małych fragmentów, większe preparaty, takie jak nienaruszony mózg, stanowią problem w przypadku fiksacji przez imersję, ponieważ utrwalacz nie dociera do wszystkich obszarów tkanki z tą samą prędkością 5,7. Często zmiany w odpowiedzi na hipoksję zaczynają się, zanim tkanka zostanie utrwalona 12. Przewagą bezpośredniej perfuzji utrwalacza przez układ krwionośny jest fakt, że substancja chemiczna może szybko dotrzeć do każdego zakątka organizmu, wykorzystując naturalną sieć naczyniową. Aby najskuteczniej wykorzystać układ krwionośny, należy zadbać o dostosowanie ciśnienia do wartości fizjologicznych 3. Należy zauważyć, że ciśnienia fizjologiczne zależą od wykorzystanego gatunku. Techniki fiksacji perfuzyjnej różnią się w zależności od utrwalanej tkanki oraz sposobu jej przetwarzania po fiksacji. W niniejszym filmie opisujemy niskokosztową, szybką, kontrolowaną i jednorodną procedurę fiksacji z użyciem 4% paraformaldehydu perfundowanego przez układ naczyniowy: przez serce szczura, aby uzyskać jak najlepsze utrwalenie mózgu do immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki (w porównaniu z systemami grawitacyjnymi) jest najskuteczniejsze wykorzystanie układu krwionośnego.
Protokół
1. Przygotowanie utrwalacza
(Patrz tabela Fiksatywy i bufory.)
2. Przygotowanie buforów perfuzyjnych
(Patrz tabela Utrwalacz i bufory.)
3. Przygotowanie aparatury i znieczulenia
- Używając kąpieli wodnej, podgrzej bufor perfuzyjny do 37 °C. Umieść zawór wylotowy w zlewce wypełnionej buforem. Napełnij strzykawkę 50 ml buforem i podłącz ją do drenu utrwalacza. Przepłucz dren wielokrotnie, wtłaczając i wycofując bufor.
- Oczyść linię buforem, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza z drenu. Dla sukcesu perfuzji kluczowe jest, aby w żadnej z linii nie było pęcherzyków powietrza.
- Zdejmij strzykawkę i podłącz pojemnik z 4% paraformaldehydem (w temperaturze pokojowej). Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza na końcu drenu, uciśnij go podczas wprowadzania do pojemnika w taki sposób, aby kropla buforu wystawała z końca i stykała się z powierzchnią cieczy w pojemniku.
- Zamknij port wylotowy (koniec z igłą). Przekręć zawór buforu (niebieski) do tej samej pozycji co zawór utrwalacza (biały). Pozwoli to na przepływ wyłącznie z linii buforu.
- Otwórz port wylotowy i powtórz kroki od A1 do A3 w celu napełnienia linii buforu. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza zamknij port wylotowy, zdejmij strzykawkę i podłącz pojemnik z buforem, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do drenu.
- Przetestuj szczelność systemu i zdolność do utrzymania ciśnienia, pompując gumową gruszkę manometru. Normalnie występuje pewien opór wynikający ze sprężenia powietrza w systemie.
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne w sposób umożliwiający łatwy dostęp. Napełnij igłę perfuzyjną buforem, aby wyeliminować możliwość wystąpienia pęcherzyków powietrza.
- Przed zabiegiem podaje się mieszaninę ketaminy i ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy oraz 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) drogą domięśniową (igła 27G i strzykawka 1 cc). W razie potrzeby w trakcie operacji podawane będą dodatkowe dawki środka znieczulającego, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.
4. Operacja perfuzji
- Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczny poziom znieczulenia, umieść je na płytkiej tacy wypełnionej kruszonym lodem. (Do określenia głębokości znieczulenia zastosuj metodę reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Zwierzę musi nie reagować przed kontynuacją procedury).
- Wykonaj boczne cięcie o długości 5-6 cm przez skórę i ścianę brzucha tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek tępych wykonaj niewielkie nacięcie w przeponie. Położenie i nacisk palca mogą ułatwić przecięcie przepony.
- Kontynuuj nacięcie przepony wzdłuż całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.
- Umieść zakrzywione nożyczki tępe wzdłuż jednej strony żeber, ostrożnie odsuwając płuca, i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Wykonaj analogiczne cięcie po stronie przeciwległej.
- Podnosząc mostek, ostrożnie odetnij wszelkie tkanki łączące go z sercem. Zaciśnij końcówkę mostka za pomocą hemostatu i odsuń hemostat w stronę głowy. Przy prawidłowym wykonaniu grasica unosi się wraz z mostkiem, odsłaniając głównymi naczynia krwionośne.
- Za pomocą nożyczek irydowych wykonaj niewielkie nacięcie w tylnej części lewej komory.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
- Przećpijt przez naciętą komorę do aorty wstępującej tępo zakończoną lub oliwkową igłę perfuzyjną o rozmiarze 15G. Końcówka powinna być widoczna przez ścianę aorty i nie może sięgać łuku aorty, w miejscu rozgałęzienia tętnic ramiennych i szyjnych.
- Użyj kleszczyków hemostatycznych do zaciśnięcia serca, co unieruchomi igłę i zapobiegnie wyciekom. W razie potrzeby można użyć zmodyfikowanych kleszczyków hemostatycznych do zaciśnięcia aorty wokół końcówki igły (kleszczyki te pozostają na miejscu aż do rozpoczęcia sekcji, lecz dla przejrzystości zostaną pominięte na dalszych ilustracjach).
- Na koniec, za pomocą nożyczek irydowych, wykonaj nacięcie prawego przedsionka zwierzęcia, tworząc jak największy otwór wyjścia, tak aby nie uszkodzić aorty zstępującej. W tym momencie zwierzę jest gotowe do perfuzji.
5. Perfuzja
- Otwórz i podłącz port wylotowy do podstawy igły, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
- Szybko i równomiernie napompuj gruszkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg. Utrzymuj to ciśnienie przez cały okres infuzji buforu. Uruchom stoper.
- Wyreguluj kąt nachylenia igły. Kąt igły ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia maksymalnego szybkości przepływu (zwróć uwagę na zmianę przepływu podczas regulacji kąta).
- Przełącz zawór buforu (niebieski), gdy bufor będzie prawie zużyty (200 ml). Płyn powinien być przejrzysty. Przejrzystość wątroby jest wskaźnikiem prawidłowej perfuzji. Na tym etapie wątroba powinna być przejrzysta. Odnotuj czas w dokumentacji.
- Drżenia związane z utrwalaniem powinny pojawić się w ciągu kilku sekund; należy to uznać za rzeczywisty czas utrwalenia. Odnotuj czas w dokumentacji.
- Ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mm Hg 2, aby utrzymać stałą szybkość przepływu.
- Zamknij zawór wylotowy, gdy utrwalacz będzie prawie zużyty. Odnotuj czas zakończenia w dokumentacji.
- Na tym etapie szczur powinien być sztywny.
- Zużyta paraformaldehyd musi zostać zebrana i przechowywana do utylizacji zgodnie z przepisami Twojej instytucji.
6. Disekcja 4,11
- Odetnij głowę za pomocą nożyczek.
- Wykonaj cięcie w linii środkowej wzdłuż powłok od szyi do nosa i odsłoń czaszkę.
- Odetnij pozostałe mięśnie szyi, aby odsłonić podstawę czaszki; usuń wszelkie resztki mięśni za pomocą nożyczek lub kleszczy kostnych.
- Wprowadź ostrze nożyczek do tęczówek do foramen magnum po jednej stronie, ostrożnie przesuwając nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki.
- Następnie wykonaj cięcie sięgające do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki. Wykonaj analogiczne cięcie po stronie przeciwległej. Użyj kleszczy kostnych, aby usunąć fragmenty czaszki wokół móżdżku.
- Ostrożnie przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, prowadząc końcówkę od grzbietowego dystalnego tylnego rogu do dystalnej krawędzi czołowej czaszki, lekko unosząc ostrze podczas cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz czynność po drugiej stronie.
- Za pomocą kleszczy kostnych oddziel powierzchnię grzbietową czaszki od mózgu. Przytnij również boki czaszki, używając kleszczy kostnych.
- Za pomocą szpatułki przetnij cebulki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu.
- Delikatnie oddziel mózg od głowy, odcinając za pomocą nożyczek do tęczówek wszelkie fragmenty opony twardej, które nadal łączą mózg z czaszką.
- Wyjmij mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem zawierającym ciecz o objętości co najmniej 10x większej niż objętość samego mózgu. Od czasu do czasu delikatnie potrząśnij fiolką.
7. Postutrwalanie i przechowywanie
- Pozostawić mózg w utrwalaczu na 24 godziny w temperaturze 4 °C, okazjonalnie delikatnie mieszając w sposób wirowy.
- Po 24 godzinach wypłukać mózg w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, wymieniając medium 3 razy i za każdym razem delikatnie mieszając w sposób wirowy.
- Mózgi można następnie przechowywać w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym lub w HBHS z azotkiem sodu w temperaturze 4 °C.
8. Reprezentatywne wyniki
Wstępnym wskaźnikiem powodzenia perfuzji jest przejaśnienie kończyn, takich jak nos, uszy i łapy, oraz organów wewnętrznych, takich jak grasica i wątroba (IHC World). Makroskopowa ocena mózgu wykazuje naczynia krwionośne pozbawione krwi (wygląd od białego do bladożółtego). Będzie to widoczne również w przekrojach tkankowych przeznaczonych do barwienia i immunohistochemii. Ostatecznym wskaźnikiem wyniku perfuzji jest stan ultrastruktury w tkance.1,6,7,8
| Przygotowanie utrwalacza: |
| Przygotowanie roztworu stokowego 8% paraformaldehydu |
|
| Przygotowanie 0,2 M buforu fosforanowego sodu, pH 7,4 |
|
| Przygotowanie 4% utrwalacza na bazie paraformaldehydu |
|
| Przygotowanie buforów do perfuzji i przechowywania: |
| Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), pH 7,4 |
|
| Roztwór Hanksa buforowany HEPES (HBHS) z azotkiem sodu, pH 7,4 |
|
Tabela 1. Przygotowanie utrwalacza i buforów.
Rysunek 1. Aparatura do perfuzji z opisanymi elementami.
Rysunek 2. Przygotowanie aparatu do perfuzji I. Należy zacząć od linii z utrwalaczem. Usunąć pęcherzyki powietrza z drenów i wypełnić je buforem, gwałtownie wtłaczając i odsysając bufor do strzykawki i przez linię. Zamknąć zawór przy igle. Umieścić linię z utrwalaczem w butelce z utrwalaczem, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
Rycina 3. Przygotowanie aparatu do perfuzji II. 1. Otwórz zawór przy igle. 2. Przekręć zawór buforu (niebieski) do pozycji umożliwiającej przepływ. 3. Usunij pęcherzyki powietrza z drenu i wypełnij go buforem, szybko wypychając i zasysając bufor za pomocą strzykawki. 4. Zamknij zawór przy igle. Umieść dren w butelce z buforem. Sprawdź szczelność systemu, pompując gruszkę manometru i obserwując wskaźnik. Aparat jest teraz gotowy do procedury perfuzji.
Rycina 4. Aparatura do perfuzji w pozycji do podawania buforu.
Rycina 5. Operacja perfuzji I. a) Wykonaj nacięcie boczne przez powłoki skórne i ścianę brzucha. b) Wykonaj nacięcie przepony i przetnij ją w poprzek, odsłaniając serce. Wykonaj równoległe nacięcia po obu stronach żeber aż do obojczyka. c) Zaciśnij końcówkę mostka kleszczykami hemostatycznymi i odciągnij kleszczyki w stronę głowy.
Rysunek 6. Operacja perfuzyjna II. a) Przełożyć igłę perfuzyjną przez przeciętą komorę do aorty wstępującej. b) Zabezpieczyć igłę perfuzyjną, używając jednego zestawu kleszczyków hemostatycznych do zaklemowania serca. Drugi zestaw zmodyfikowanych kleszczyków hemostatycznych można wykorzystać do zaklemowania aorty wokół końcówki igły, aby zapobiec wyciekowi. Za pomocą nożyczek irydowych wykonać niewielkie nacięcie w tylnej części lewej komory.
Rycina 7. Perfuzja buforem. Należy ścisnąć gruszkę manometru, aby wytworzyć ciśnienie w przewodzie. Otwórz zawór (1) i podłącz go do nasady igły. Kluczowe jest upewnienie się, że do układu nie dostały się pęcherzyki powietrza. Należy napompować gruszkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg i utrzymywać tę wartość przez cały czas infuzji buforu.
Rycina 8. Perfuzja utrwalaczem. Gdy bufor jest prawie na wyczerpaniu (200 ml), należy przełączyć zawór buforu (1), aby umożliwić przepływ utrwalacza. Ciśnienie można stopniowo zwiększać do maksymalnie 130 mm Hg.
Rysunek 9. Sekcja I. a) usunięcie głowy za pomocą nożyczek. b) wykonanie nacięcia skóry wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa i odsłonięcie czaszki. c) odcięcie pozostałych mięśni szyi w celu odsłonięcia podstawy czaszki. Należy trzymać głowę tak, aby otwór wielki w powierzchni czaszki (foramen magnum) był dostępny. Ostrym końcem nożyczek irydologicznych należy ostrożnie wprowadzić narzędzie do otworu wielkiego i wykonać cięcie. Tę samą czynność należy powtórzyć po stronie przeciwległej. Za pomocą kuretażu kostnego (rongeurs) należy usunąć fragmenty czaszki wokół móżdżku.
Rysunek 10. Sekcja II. a) ostrożnie przesuń nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki. Podczas cięcia lekko unieś końcówkę nożyczek, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz tę czynność po przeciwnej stronie. Użyj kleszczy kostnych, aby oddzielić czaszkę od mózgu. b) ilustracja z usuniętą czaszką i odsłoniętym mózgiem. c) za pomocą szpatułki przetnij cebulki węchowe i połączenia nerwowe w najbardziej przedniej części mózgu. Ostrożnie prowadź końcówkę szpatułki wzdłuż dolnej powierzchni mózgu, aby przeciąć połączenia i ułatwić jego usunięcie. Wyjmij mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem.
Dyskusja
Dodatkowe uwagi dla powodzenia zabiegu chirurgicznego:
- Po przebiciu przepony należy działać szybko, ponieważ hipoksja i hiperkapnia zainicjują nieodwracalne zmiany fizjologiczne, które mogą zakłócić późniejszą analizę.
- Po wprowadzeniu i zaciśnięciu igły w miejscu wkłucia, ciśnienie resztkowe wypchnie krew do podstawy igły (tzw. flashback). W przypadku większych zwierząt może dojść do gwałtownego wyrzutu krwi. Kluczowe jest, aby krew dotarła przynajmniej do podstawy igły, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, które stanowiłyby przeszkodę w pełnej perfuzji. Jeśli u podstawy igły nie pojawi się krew, należy ją wyjąć i ponownie napełnić buforem, podłączając ją do portu wyjściowego zestawu do perfuzji. Po przepłukaniu końcówki buforem igłę można ponownie wprowadzić do serca.
- Prawidłowe umieszczenie igły w aorcie jest krytyczne; nie powinna ona sięgać aż do łuku aorty.
- W przypadku przeprowadzania wielu perfuzji nie ma potrzeby każdorazowego ustawiania wszystkiego od początku. Użytkownik musi zapewnić odpowiednią objętość buforu i utrwalacza w każdej butelce (200 ml na zwierzę/roztwór). Butelki można w razie potrzeby uzupełnić. Najważniejszym aspektem jest przepłukanie linii perfuzyjnej biegnącej od zestawu do zwierzęcia (zawór wyjściowy). Po zakończeniu perfuzji w linii tej znajduje się 4% paraformaldehyd. Należy wyjąć rurkę z butelki z buforem i użyć strzykawki 50 ml wypełnionej wodą, aby wypłukać utrwalacz. Należy upewnić się, że zawór wyjściowy znajduje się w zlewce na odpady w celu prawidłowej utylizacji paraformaldehydu. Czynność tę należy powtórzyć trzykrotnie. Następnie należy ponownie napełnić linię buforem, stosując metodę opisaną w punkcie 2.3.
- Ta metoda utrwalania jest wysoce adaptowalna, z możliwością zmiany zarówno buforu, jak i utrwalacza na inne substancje utrwalające (np. te stosowane w EM) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
- System jest również często wykorzystywany do pobierania żywej tkanki. W tym procesie stosuje się podawanie wyłącznie buforu (butelka z buforem, wciąż podłączona do całego systemu, zostaje umieszczona w pojemniku z lodem, a butelka z utrwalaczem pozostaje pusta, ale zamknięta). Zapewnia to perfuzję zimnym buforem przy optymalnym ciśnieniu. System ten można zaadaptować do infuzji barwników utrwalających, dodając barwnik bezpośrednio do buforu (jeśli ilość nie stanowi problemu) lub używając strzykawki z minimalną ilością roztworu bufor/barwnik pomiędzy etapem buforowania a utrwalania.
- W przypadku odlewania naczyń krwionośnych etap monitorowania ciśnienia buforem jest kluczowy, jednak ze względu na lepkość i krzepnącą naturę roztworu odlewowego należy użyć strzykawki 50 ml do bezpośredniego podania lub jednorazowego dodatkowego elementu do aparatury (rurki, zawór i pojemnik utrzymujący) przystosowanego do współpracy z obecnym systemem. Odlewanie naczyń w naszym laboratorium poprzedzało zaprojektowanie i wykonanie aparatury do perfuzji. W związku z tym nie możemy stwierdzić, że pomiary ciśnienia będą dokładnym odzwierciedleniem wartości w miejscu podania. Wartości mogą wymagać korekty, aby uzyskać pomyślne podanie lepkich płynów.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana przez Center for Neural Communication Technology (CNCT), centrum zasobów P41 finansowane przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) oraz wspierane przez National Institutes of Health (NIH).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Środek znieczulający: | |||
| Mieszanina ketaminy i ksylazyny (środek znieczulający może się różnić w zależności od laboratorium/instytucji) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | fiolka 10 ml |
| Chirurgia: | |||
| Końcówka igły, 27 GA x 1,25" | Usługi Materiałowe | 25251 | |
| Duże nożyczki tępe/tępozakrzywione (~14,5 cm) | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| Proste nożyczki irydologiczne | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standardowe pęsety | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Para pęsety precyzyjnej (Graefe) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 1 duże kleszczyki hemostatyczne – zakrzywione lub proste (~19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
| 2 standardowe kleszczyki hemostatyczne – proste, ząbkowane (14 cm) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 1 zmodyfikowany zacisk hemostatyczny (z otworem o rozmiarze 15G wykonanym w końcówce) | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| igła tępa lub z oliwnym zakończeniem o rozmiarze 15G (igła do perfuzji) | Fisnar | 5601137 | |
| Perfuzja: | |||
| System HyPerFusion lub odpowiednik | |||
| Sroztwór soli fosforowej (PBS), pH 7,4 | |||
| 4% paraformaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4 | |||
| Płytka tacka szklana lub plastikowa, ok. 10" x 10" | |||
| Kruszony lód | |||
| Kąpiel wodna (37 °C) | |||
| Timer | |||
| strzykawka 50 ml | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| Sekcja: | |||
| Para standardowych prostych nożyczek ostrych/tępych (~12 cm) | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Średnie kleszczyki kostne (rongeury) zakrzywione lub proste (14-16 cm) lub kleszczyki do usuwania kości czaszki | Fine Science Tools | 16020-14 | |
| Proste nożyczki irydologiczne (~9 cm) | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Mikroszpatułka (podwójna 2" końce płaskie, jeden zaokrąglony, jeden zwężający się do 1/8") | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Po utrwalaniu &Przechowywanie: | |||
| fiolka szklana 50 ml | |||
| 40 ml roztworu Hanksa buforowanego HEPES-em (HBHS) z azotkiem sodu (90 mg/l) |
Bibliografia
- Cinar, O., Semiz, O., Can, A. A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections. Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).
- Fritz, M., Rinaldi, G. Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).
- Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats. Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).
- Jacobowitz, D. M. Removal of discrete fresh regions of rat brain. Brain Res. 80, 111-115 (1974).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).
- Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).
- Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).
- Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).
- Walker, W. F. Vertebrate dissection. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).
- Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. J. Neurotrauma. Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).
Przedruki i uprawnienia
