Utrwalanie perfuzji całego zwierzęcia u gryzoni

Podsumowanie

Tutaj opisujemy tanią, szybką, kontrolowaną i jednolitą procedurę utrwalania przy użyciu 4% paraformaldehydu przenikanego przez układ naczyniowy: przez serce szczura w celu uzyskania najlepszego możliwego zachowania mózgu.

Streszczenie

Celem fiksacji jest szybkie i jednolite zachowanie tkanki w stanie zbliżonym do życia. Podczas gdy umieszczenie tkanki bezpośrednio w utrwalaczu działa dobrze w przypadku małych fragmentów tkanki, większe próbki, takie jak nienaruszony mózg, stanowią problem dla fiksacji zanurzeniowej, ponieważ utrwalacz nie dociera do wszystkich obszarów tkanki w tym samym tempie ^5,7. Często zmiany w odpowiedzi na niedotlenienie zaczynają się, zanim tkanka będzie mogła zostać zachowana ¹². Zaletą bezpośredniego przenikania utrwalacza przez układ krążenia jest to, że substancja chemiczna może szybko dotrzeć do każdego zakątka organizmu za pomocą naturalnej sieci naczyniowej. Aby jak najefektywniej wykorzystać układ krążenia, należy zadbać o dopasowanie ciśnień fizjologicznych ³. Należy zauważyć, że ciśnienie fizjologiczne zależy od użytego gatunku. Techniki fiksacji perfuzyjnej różnią się w zależności od tkanki, która ma być utrwalona i sposobu przetwarzania tkanki po utrwaleniu. W tym filmie opisujemy tanią, szybką, kontrolowaną i jednolitą procedurę utrwalania przy użyciu 4% paraformaldehydu perfundowanego przez układ naczyniowy: przez serce szczura, aby uzyskać najlepszą możliwą ochronę mózgu do celów immunohistochemicznych. Główną zaletą tej techniki (w porównaniu z systemami zasilanymi grawitacyjnie) jest to, że układ krążenia jest wykorzystywany najefektywniej.

Protokół

1. Przygotuj utrwalacz

(Zobacz tabelę Utrwalacz i.)

2. Przygotuj perfuzyjne

(Zobacz tabelę Utrwalacz i.)

3. Przygotuj aparaturę i znieczulenie

1. Korzystając z łaźni wodnej, podgrzać bufor perfuzyjny do temperatury 37 °C. Umieścić zawór wylotowy w zlewce wypełnionej buforem. Napełnić strzykawkę o pojemności 50 ml buforem i podłączyć do rurki utrwalającej. Kilkakrotnie przepłukiwać rurki poprzez wyrzucanie i wycofywanie bufora.
2. Wyczyść linię z buforem, aż wszystkie pęcherzyki powietrza w rurce zostaną usunięte. Kluczowe znaczenie dla powodzenia perfuzji ma to, aby w żadnej z linii nie było pęcherzyków powietrza.
3. Wyjąć strzykawkę i podłączyć pojemnik z 4% utrwalaczem paraformaldehydu (o temperaturze pokojowej). Aby uniknąć pęcherzyków powietrza na końcu rurki, ściśnij rurkę, jednocześnie umieszczając rurkę w pojemniku tak, aby kropla buforu wystawała z końca i stykała się z powierzchnią płynu w pojemniku.
4. Zamknąć port wylotowy (koniec igły). Przekręć zawór buforowy (niebieski) do tej samej pozycji co zawór utrwalający (biały). Umożliwi to przepływ tylko z linii buforowej.
5. Otwórz port wylotowy i powtórz kroki od A1 do A3, aby napełnić przewód buforowy. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza zamknij otwór wylotowy, wyjmij strzykawkę i podłącz pojemnik buforowy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do rurki.
6. System testowy pod kątem zdolności do utrzymywania ciśnienia poprzez pompowanie gumowego manometru blub. Zwykle występuje pewien opór spowodowany sprężaniem powietrza w układzie.
7. Skonfiguruj narzędzia chirurgiczne, aby mieć do nich łatwy dostęp. Napełnij igłę perfuzyjną buforem, aby wyeliminować możliwość powstawania pęcherzyków powietrza.
8. Przed zabiegiem chirurgicznym mieszaninę ketaminy i ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) podaje się we wstrzyknięciu dootrzewnowym (igła o rozmiarze 27 i strzykawka o pojemności 1 cm3). W trakcie każdej operacji zostanie wykonane dodatkowe podanie środka znieczulającego, jeśli będzie to konieczne, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.

4. Chirurgia perfuzji

1. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, umieść je na płytkiej tacy wypełnionej pokruszonym lodem. (Użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia. Zwierzę musi nie reagować przed kontynuacją).
2. Wykonaj 5-6 cm boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.
3. Wykonaj małe nacięcie w przeponie za pomocą zakrzywionych, nożyczek. Pozycja i nacisk palca mogą pomóc w przecięciu przepony.
4. Kontynuuj nacięcie przepony na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.
5. Umieść zakrzywione, nożyczki po jednej stronie żeber, ostrożnie przesuwając płuca, i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Wykonaj podobne cięcie po stronie przeciwnej.
6. Unosząc mostek, ostrożnie przytnij tkankę łączącą go z sercem. Zacisnąć końcówkę mostka hemostatem i umieścić hemostat nad głową. Prawidłowo wykonana grasica unosi się od serca wraz z mostkiem, zapewniając wyraźny widok na główne naczynia.
7. Wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu lewej komory za pomocą nożyczek do tęczówki.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

8. Przełóż igłę perfuzyjną o lub oliwkowej końcówce w rozmiarze 15 przez przeciętą komorę do aorty wstępującej. Końcówka powinna być widoczna przez ścianę aorty i nie powinna sięgać do łuku aorty, gdzie rozchodzą się tętnice ramienne i szyjne.
9. Użyj hemostatu do zaciśnięcia serca, co zabezpieczy igłę i zapobiegnie wyciekowi. W razie potrzeby zmodyfikowany hemostat może być użyty do zaciśnięcia aorty wokół końcówki igły (hemostatyki te pozostają na miejscu do momentu rozpoczęcia sekcji, ale są pomijane na przyszłych ilustracjach dla jasności).
10. Na koniec wykonaj nacięcie prawego przedsionka zwierzęcia za pomocą nożyczek do tęczówki, aby stworzyć jak największy ujść bez uszkadzania aorty zstępującej. W tym momencie zwierzę jest gotowe do perfuzji.

5. Perfuzja

1. Otwórz i przymocuj port wylotowy do podstawy igły, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.
2. Szybko i równomiernie napompuj bańkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg. Ciśnienie to należy utrzymywać przez cały okres infuzji buforu. Uruchom minutnik.
3. Wyreguluj kąt igły. Kąt igły ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia maksymalnego natężenia przepływu (zwróć uwagę na zmianę przepływu wraz z regulacją kąta).
4. Przełącz zawór buforowy (niebieski), gdy bufor jest prawie gotowy (200 ml). Płyn powinien być czysty. Oczyszczenie wątroby jest wskaźnikiem dobrej perfuzji. W tym momencie wątroba powinna być czysta. Wskaż czas dla swoich rekordów.
5. Drżenie fiksacji powinno być obserwowane w ciągu kilku sekund; należy to uznać za prawdziwy czas utrwalenia. Wskaż czas dla swoich rekordów.
6. Ciśnienie można stopniowo zwiększać, aż do maksymalnie 130 mm Hg ² w celu utrzymania stałego natężenia przepływu.
7. Zamknij zawór wylotowy, gdy utrwalacz jest prawie gotowy. Wskaż czas zakończenia rekordów.
8. Na tym etapie szczur powinien być sztywny.
9. Zużyty paraformaldehyd musi być zbierany i przechowywany w celu utylizacji zgodnie z przepisami Twojej instytucji.

6. Sekcja ^4,11

1. Zdejmij głowę za pomocą nożyczek.
2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż powłoki od szyi do nosa i odsłoń czaszkę.
3. Odetnij pozostały mięsień szyi tak, aby podstawa czaszki była odsłonięta; usuń wszelkie resztki mięśni za pomocą nożyczek lub rongeurs.
4. Umieść ostry koniec nożyczek tęczówkowych w otworze wielkim po jednej stronie, ostrożnie przesuwając nożyczki po wewnętrznej powierzchni czaszki.
5. Następnie wykonaj cięcie sięgające do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki. Wykonaj identyczne cięcie po stronie przeciwnej. Użyj rongeurs, aby oczyścić czaszkę wokół móżdżku.
6. Ostrożnie przesuwaj nożyczki po wewnętrznej powierzchni czaszki, gdy końcówka przemieszcza się od grzbietowego dystalnego tylnego rogu do dystalnej przedniej krawędzi czaszki, unosząc ostrze podczas cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz dla przeciwnej strony.
7. Za pomocą rongeurs oderwij grzbietową powierzchnię czaszki od mózgu. Odetnij również boki czaszki za pomocą rongeurs.
8. Za pomocą szpatułki odetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu.
9. Delikatnie odsuń mózg od głowy, przycinając oponę twardą, która nadal łączy mózg z czaszką, za pomocą nożyczek do tęczówki.
10. Usuń mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem zawierającym płyn o objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość samego mózgu. Od czasu do czasu obracać fiolkę.

7. Utrwalenie i przechowywanie

1. Utrzymuj mózg w utrwalaczu przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, od czasu do czasu wirując.
2. Po 24 godzinach przemyj mózg solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, wymieniając pożywkę 3 razy i za każdym razem mieszając.
3. Mózgi można następnie przechowywać w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub HBHS z azydkiem sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C.

8. Reprezentatywne wyniki

Początkowym wskaźnikiem sukcesu perfuzji jest oczyszczenie kończyn, takich jak nos, uszy i łapy oraz narządów wewnętrznych, takich jak grasica i wątroba (IHC World). Dokładne oględziny mózgu ujawniają, że naczynie krwionośne jest pozbawione krwi (wygląd od białego do bladożółtego). Dotyczy to również skrawków tkanek przeznaczonych do barwienia i immunohistochemii. Ostatnim wskaźnikiem wyniku perfuzji jest stan ultrastruktury w tkance. ^1,6,7,8

Przygotuj utrwalacz: Przygotuj 8% bulionu paraformaldehydu

1. Dodać 40 g paraformaldehydu do 500 ml dH₂O. Podgrzać roztwór do 60-65 °C, mieszając (nie przekraczać 65 °C, może to niekorzystnie wpłynąć na powodzenie procedury immunohistochemicznej).
2. Aby usunąć roztwór, zmniejsz ogień i dodaj 2-3 ml 1,0 M NaOH za pomocą zakraplacza.
3. Filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

Przygotować 0,2 M bufor fosforanu sodu, pH 7,4

4. W przypadku monozasadowego roztworu fosforanu sodu dodać 27,8 g NaH₂PO₄ * H₂O do 1 L dH₂O.
5. Do dwuzasadowego roztworu fosforanu sodu dodać 28,4 g Na₂HPO₄ do 1 L dH₂O.
6. Dodać 810 ml bulionu jednozasadowego do 190 ml bulionu dwuzasadowego.

Przygotuj 4% utrwalacz paraformaldehydu

7. Dodaj równe części 8% bulionu paraformaldehydu do 0,2 M buforu fosforanu sodu
8. Uwaga: tę poprawkę najlepiej przygotować na świeżo, nie wcześniej niż 72 godziny wcześniej.

Przygotuj perfuzyjne i magazynowe: Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, pH 7,4

9. 1 L dH₂O
10. 9 g NaCl
11. 144 mg tabletki powlekane KH₂PO₄
12. 795 mg na₂HPO₄
13. Sprawdź pH

Buforowany roztwór Hanksa HEPES (HBHS) z azydkiem sodu o pH 7,4

14. 990 ml dH₂O
15. 7,5 g NaCl,
16. 0,3 g KCl
17. 0,06 g K H₂PO₄
18. 0,13 g na₂HPO₄
19. 2 g dekstrozy/glukozy
20. 2,4 g 10 mm Hepes
21. 0,1 g MgCl₂ 6 części dH₂O
22. 0,05 g MgSO_{, 4} 7 części dH₂O
23. 0,165 g CaCl₂ 2 części dH₂O
24. 90 mg NaN₃
25. Sprawdź pH

Tabela 1. Przygotowanie utrwalacza i.

Rysunek 1. Aparat perfuzyjny z oznaczonymi komponentami.

Rysunek 2. Przygotowanie aparatu perfuzyjnego I. Zacznij od linii utrwalającej. Przepłukać rurkę z pęcherzyków powietrza i napełnić buforem, szybko usuwając i wycofując bufor do strzykawki i przez przewód. Zamknąć zawór na końcu igły. Umieść linię utrwalającą w butelce utrwalającej bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Rysunek 3. Przygotowanie aparatu perfuzyjnego II. 1. Otwórz zawór na końcu igły. 2. Przekręć zawór buforowy (niebieski) do pozycji przepływu. 3. Przepłukać rurki z pęcherzyków powietrza i napełnić buforem, szybko usuwając i wycofując bufor za pomocą strzykawki. 4. Zamknąć zawór na końcu igły. Umieść rurki w butelce buforowej. Ciśnienie próbne, aby upewnić się, że system jest prawidłowo uszczelniony, pompując żarówkę manometru i obserwując manometr. Aparat jest teraz gotowy do zabiegu perfuzji.

Rysunek 4. Aparat perfuzyjny w pozycji do dostarczania buforu.

Rysunek 5. Chirurgia perfuzji I. a) Wykonaj boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha. b) Wykonaj nacięcie w przeponie i przetnij w poprzek przepony, odsłaniając serce. Wykonuj równoległe nacięcia po obu stronach żeber aż do obojczyka. c) Zacisnąć końcówkę mostka hemostatem i umieścić hemostat nad głową.

Rysunek 6. Chirurgia perfuzji II. a) Przełóż igłę perfuzyjną przez przeciętą komorę do aorty wstępującej. b) Zabezpiecz igłę perfuzyjną, użyj jednego zestawu hemostatów, aby zacisnąć serce. Drugi zestaw zmodyfikowanego hemostatu może być również użyty do zaciśnięcia aorty wokół końcówki igły, aby zapobiec wyciekowi. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu lewej komory.

Rysunek 7. Perfuzja za pomocą pompy buforowej bańki manometru, aby wytworzyć ciśnienie w przewodzie. Otwórz zawór (1) i przymocuj do piasty igły. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza. Napompować bańkę manometru do ciśnienia 80 mm Hg i utrzymywać to ciśnienie przez cały okres infuzji buforowej.

Rysunek 8. Perfuzja z utrwalaczem Gdy bufor jest prawie gotowy (200 ml), przełączyć zawór buforowy (1), aby umożliwić przepływ utrwalacza. Ciśnienie można stopniowo zwiększać, aż do maksymalnie 130 mm Hg.

Rysunek 9. Sekcja I. a) usuń głowę za pomocą nożyczek. b) Wykonaj nacięcie w skórze wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa i odsłoń czaszkę. c) Odetnij pozostały mięsień szyi tak, aby podstawa czaszki była odsłonięta. Trzymaj głowę tak, aby duży otwór w powierzchni czaszki (otwór wielki) był dostępny. Ostrożnie włóż ostry koniec nożyczek do tęczówki do otworu wielkiego i wykonaj cięcie. Powtórz ten sam manewr dla strony przeciwnej. Użyj rongeurs, aby oczyścić czaszkę wokół móżdżku.

Rysunek 10. Sekcja II. a) Ostrożnie przesuń nożyczki po wewnętrznej powierzchni czaszki. Podnieś końcówkę podczas cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz to samo dla przeciwnej strony. Użyj rongeurs, aby oderwać czaszkę od mózgu. b) ilustracja z usuniętą czaszką i odsłoniętym mózgiem. c) Użyj szpatułki, aby przeciąć opuszki węchowe i połączenia nerwowe w najbardziej wysuniętym do przodu miejscu mózgu. Ostrożnie poprowadź końcówkę szpatułki wzdłuż spodu mózgu, aby przeciąć połączenia i ułatwić usunięcie. Usuń mózg i umieść go w fiolce z utrwalaczem.

Dyskusja

Dodatkowe uwagi dotyczące udanego zabiegu:

1. Gdy przepona zostanie przerwana, należy ją szybko poprzedzić, ponieważ niedotlenienie i hiperkapnia zainicjują nieodwracalne zmiany fizjologiczne, które mogą zakłócić późniejszą analizę.
2. Gdy igła zostanie włożona i zaciśnięta na miejscu, ciśnienie resztkowe wypchnie krew do podstawy igły (cofnięcie się płomienia). W rzeczywistości większe zwierzęta mogą energicznie wydalać krew. Bardzo ważne jest, aby krew dotarła przynajmniej do podstawy igły, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, które będą stanowić przeszkodę w całkowitej perfuzji. Jeśli nie zaobserwuje się krwi u podstawy igły, wyjmij igłę i napełnij ją buforem, podłączając go do portu wylotowego zestawu do perfuzji. Po przepuszczeniu buforu przez końcówkę, igłę można ponownie wprowadzić do serca.
3. Prawidłowe umieszczenie igły w aorcie ma kluczowe znaczenie, nie powinna ona sięgać aż do łuku aorty.
4. Jeśli ma miejsce wiele perfuzji, nie jest konieczne ustawianie za każdym razem od początku. Użytkownik musi mieć odpowiednią objętość zarówno buforu, jak i utrwalacza w każdej butelce (200 ml zwierzęcia/roztworu). W razie potrzeby butelki można również ponownie napełnić. Najważniejszym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest wypłukanie linii perfuzyjnej, która biegnie od zestawu do zwierzęcia (zawór wyjściowy). Po zakończeniu perfuzji linia ta będzie zawierała 4% paraformaldehydu. Wyjąć rurkę z butelki buforowej i użyć strzykawki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą, aby wypłukać utrwalacz. Upewnij się, że zawór wylotowy jest umieszczony w zlewce do zbierania odpadów w celu prawidłowego usunięcia paraformaldehydu. Powtórz to trzy razy. Uzupełnić buforem, stosując tę samą metodę, którą pokazano w ppkt 2.3.
5. Ta metoda utrwalania jest wysoce elastyczna dzięki możliwości zmiany zarówno bufora, jak i utrwalacza, innych utrwalaczy (takich jak te używane do EM) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
6. System jest również często używany do ekstrakcji żywych tkanek. Do tego procesu po prostu używa się samego buforu (butelka buforowa, gdy jest nadal podłączona do całego systemu, jest umieszczana w pojemniku na lód, a butelka utrwalająca jest ustawiana jako pusta, ale szczelna). Zapewnia to perfuzję zimnego buforu pod optymalnym ciśnieniem. Stąd system można dostosować do infuzji barwników utrwalających, dodając barwnik bezpośrednio do buforu (jeśli ilość nie stanowi problemu) lub używając strzykawki z minimalną ilością roztworu buforowego/barwnikowego pomiędzy etapem bufor – utrwalacz.
7. W przypadku odlewania naczyniowego etap buforowania monitorowania ciśnienia ma kluczowe znaczenie, jednak ze względu na lepkość i krzepnący charakter roztworu odlewniczego należy użyć strzykawki o pojemności 50 ml do bezpośredniego podawania lub użyć jednorazowego dodatkowego mocowania do aparatu (rurki, zaworu i pojemnika podtrzymującego) wykonanego w celu połączenia z obecnym systemem. Odlewanie naczyniowe w naszych laboratoriach poprzedziło zaprojektowanie i wyprodukowanie aparatu perfuzyjnego. W związku z tym nie możemy stwierdzić, że pomiary ciśnienia będą dokładnym pomiarem w miejscu dostawy. Może być konieczne dostosowanie liczb w celu pomyślnego dostarczenia lepkich płynów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Znieczulenie:
Mieszanina ketaminy/ksylazyny (Znieczulenie może się różnić w zależności od laboratorium / instytucji)	Ketaset	NDC 0856-2013-01	Fiolka
Chirurgia:
Końcówka igły, 27 GA x 1,25"	Materiel Services	25251
Duże/zakrzywione nożyczki (~14,5 cm)	Dobra Science Tools	14519-14
Nożyczki do prostych tęczówek	Fine Science Tools	14058-11
Pęsety standardowe	Fine Science Tools	11027-12
Para cienkich (Graefe) pęset	Fine Science Tools	11050-10
1 Duże kleszcze do hemostatu - zakrzywione lub proste (~19 cm)	surgicaltools.com	17.21.51
2 standardowe kleszcze do hemostatu - proste ząbkowane (14 cm)	Fine Science Tools	13013-14
1 zmodyfikowany hemostat (z otworem o rozmiarze 15 przepiłowanym przez końcówkę)	Fine Science Tools	13013-14
igła lub oliwkowa o rozmiarze 15 (igła perfuzyjna)	Fisnar	5601137
Perfusion:
System HyPerfusion lub równoważny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4
4% Paraformaldehyd w 0,1 M Bufor fosforanowy, pH 7,4
Płytka taca szklana lub plastikowa, około 10 "x 10"
Kruszony lód
Łaźnia wodna (37 & deg; C)
Strzykawka
Rozwarstwienie:
	Narzędzia	16020-14
Nożyczki do prostych tęczówek (~9 cm)	Fine Science Tools	14058-11
Mikroszpatułka (podwójne 2" płaskie końce, jedna zaokrąglona, jedna zwężająca się do 1/8")	Fine Science Tools	10091-12
Po utrwaleniu i Przechowywanie:
50 ml szklana fiolka
40 ml buforowany przez HEPES roztwór Hanksa (HBHS) z azydkiem sodu (90 mg / l)