Przedstawiamy przydatne informacje dla chirurgów uczących się procesu implantacji chronicznych elektrod do rejestracji sygnałów neuronalnych. Opisano techniki stosowane dla systemów elektrod penetrujących oraz powierzchniowych w modelu gryzoni.
Artykuł metodologiczny
Chirurgiczna implantacja chronicznych elektrod neuronowych do rejestracji aktywności pojedynczych jednostek i sygnałów elektrokortykograficznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sukces długoterminowych rejestracji elektrofizjologicznych często zależy od jakości operacji implantacji. Przedstawiamy tutaj przydatne informacje dla chirurgów uczących się procesu implantacji systemów elektrod. Demonstrujemy procedurę implantacji zarówno elektrody penetrującej, jak i powierzchniowej. Proces chirurgiczny został opisany od początku do końca, wraz ze szczegółowymi opisami każdego etapu procedury. Należy również zaznaczyć, że niniejszy przewodnik wideo koncentruje się na procedurach przeprowadzanych na modelach gryzoni oraz innych modelach małych zwierząt. Opisane procedury można zmodyfikować w celu zastosowania ich w innych modelach zwierzęcych.
Protokół
1. Procedury przedimplantacyjne (wspólne)
- Wygolić górną część głowy zwierzęcia, od przestrzeni między oczami aż do miejsca za uszami. Do golenia głowy należy użyć elektrycznej maszynki do strzyżenia. Głowę należy najpierw przemyć alkoholem izopropylowym, a następnie betadyną (powtórzyć 3x). Nałożyć lubrykant do oczu.
- Zamocować zwierzę w prętach usznych stereotaktycznych. Nakierować stałą końcówkę prawego pręta stereotaktycznego do przewodu słuchowego prawego ucha zwierzęcia, przesuwając głowę na bok w kierunku przewodu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że końcówka każdego pręta usznego jest prawidłowo umieszczona w przewodzie słuchowym zewnętrznym. Następnie wsunąć poluzowany lewy pręt uszny do przewodu słuchowego i przyłożyć lekki nacisk do wewnątrz. Chwycić nos zwierzęcia i energicznie poruszać nim w przód i w tył. Jeśli zwierzę zostało zamocowane prawidłowo, głowa powinna być stabilnie unieruchomiona.
2. Operacja przedimplantacyjna (ogólna)
- Za pomocą precyzyjnych nożyczek wyciąć dwa półkola od linii środkowej na zewnątrz, częściowo usuwając skórę głowy.
- Zeskrobać i usunąć tkankę łączną okostnej przylegającą do kości. Skrobanie tępą krawędzią, np. grzbietem ostrza skalpela lub końcówką sterylnego patyczka bawełnianego, zminimalizuje krwawienie, ponieważ naczynia włosowate zostaną zmiażdżone, a nie przecięte. Krwawienie z kości należy opanować za pomocą wosku kostnego lub kauteryzatora.
- Zdezynfekować i oczyścić powierzchnię kości za pomocą nadtlenku wodoru. Osuszyć kość, aby szwy czaszkowe były bardziej widoczne. Należy wyznaczyć punkty Bregma i Lambda i wykorzystać je do wypoziomowania głowy. Miejsce kraniotomii i implantacji elektrody należy odmierzyć względem punktu Bregma; można je tymczasowo zaznaczyć pisakiem lub poprzez płytkie nawiercenie powierzchni. Lokalizacja kraniotomii zależy od celów eksperymentalnych badania (np. eksperymenty motoryczne lub sensoryczne) 1.
- Nawiercić otwory w kości i umieścić śruby uziemiające oraz stabilizujące. Zawsze należy używać śrub ze stali nierdzewnej lub tytanu. Zaleca się stosowanie małych śrub jubilerskich (na przykład #2-56 lub #00-80) z jak największą liczbą zwojów na cal.
3. Procedury implantacji elektrod krzemowych
- Wykonaj kraniotomię po wszczepieniu śrub. Wywierć cztery płytkie otwory prowadzące w narożnikach obszaru kraniotomii. Wykorzystując otwory prowadzące jako wyznacznik, wywierć obwód kraniotomii. Usuń centralną masę kości, która nie została wywiercona, używając mocnych kleszczyków. Krawędź otwartej kraniotomii może wymagać oczyszczenia poprzez dalsze wiercenie. Cienkie fragmenty kości można odciąć kleszczykami kostnymi (mikrorongeurami). Zaplanuj operację ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia głównych naczyń krwionośnych, takich jak zatoka strzałkowa, która może znajdować się w odległości do 0,5 mm od linii środkowej szwu podłużnego 1. Przebicie zatoki strzałkowej może spowodować masywny krwotok. Odsłoniętą oponę twardą należy utrzymywać w stanie nawilżonym za pomocą aCSF lub soli fizjologicznej.
- Aby przebić oponę twardą, należy przygotować mały haczyk z jałowej igły hipodermicznej o małym rozmiarze (np. < 28 G). Przycisnąć ścięty koniec igły do twardej powierzchni (np. płaskiej części skalpela), lekko przechylając go, aby utworzyć zgięcie pod kątem 90 stopni w pobliżu ostrza. Użyć tego haczyka, aby uchwycić powierzchnię opony twardej i unieść ją do góry od powierzchni mózgu. Oponę twardą można przeciąć mikronożyczkami lub przerwać za pomocą ruchów bocznych haczyka do opony. Należy uważać, aby podczas używania haczyka do opony nie uszkodzić naczyń krwionośnych na powierzchni mózgu. Po resekcji opony twardej powinien być zauważalny wyciek CSF oraz różnica w kolorze w stosunku do powierzchni opony.
- Ostrożnie przymocuj przewód uziemiający elektrody silikonowej wokół podstawy śruby uziemiającej i utrwal go cementem stomatologicznym. Elektrody silikonowe należy umieścić ostrożnie w taki sposób, aby przewody kablowe elektrod tworzyły łuk nad kraniotomią.
- Implanty zostaną umieszczone przy użyciu liniowego siłownika silnikowego zamontowanego na aparacie stereotaktycznym. Aby przymocować elektrodę do urządzenia wprowadzającego, glikol polietylenowy (PEG) należy podgrzać lutownicą i nanieść na pręt wprowadzający oraz elektrodę rejestrującą.
- Po zabezpieczeniu elektrody, ręcznie opuść jej końcówkę do pożądanej lokalizacji stereotaktycznej na powierzchni mózgu.
- Korzystając z interfejsu oprogramowania siłownika liniowego, wprowadź elektrodę na pożądaną głębokość w tkance mózgowej.
- Zabezpiecz elektrodę rejestrującą w mózgu, przymocowując PEG z sąsiedniej śruby do kabla elektrody. Teraz można oddzielić elektrodę od urządzenia wprowadzającego, dodając sól fizjologiczną w celu rozpuszczenia wiązania PEG. Unieś urządzenie wprowadzające znad kraniotomii i powtórz czynność dla każdej elektrody.
- Przykryj odsłoniętą kraniotomię Gelfoam nasączonym solą fizjologiczną. Następnie należy użyć polimeru silikonowego, aby pokryć kabel elektrody i chronić go przed akrylem stomatologicznym. Ustaw złącze w końcowej lokalizacji, a następnie nałóż akryl stomatologiczny, aby stworzyć wytrzymałą czapeczkę (headcap).
4. Procedury implantacji elektrod MicroECoG
- Implantacja elektrody microECoG wymaga wykonania nieco większej kraniotomii. Dla urządzenia o wymiarach 5 x 5 mm należy wykonać kraniotomię o wymiarach 6 x 6 mm. Przed wywierceniem otworu kraniotomii, na obrzeżach miejsca zabiegu, gdy jest ono jeszcze suche i nie ma ryzyka kontaktu z oponą twardą lub miękką, nakłada się utwardzalny promieniami UV akryl dentystyczny.
- Do usunięcia powierzchni kości w ogólnym kształcie planowanej kraniotomii używa się sterylnego wiertła chirurgicznego z frezem #107. Następnie można użyć mniejszego frezu #106, aby wywiercić resztę kości do poziomu cienkiej, przezroczystej warstwy. Pozostały fragment kości można następnie usunąć kleszczykami kostnymi. Elektroda microECoG może być implantowana znad twardówki (epiduralnie) lub pod twardówkę (subduralnie). Ponownie należy dbać o to, aby opona twarda była dobrze nawilżona sztucznym CSF lub solą fizjologiczną.
- Aby zaimplantować microECoG, należy umieścić ramię stereotaktyczne nad otwartą czaszką i przymocować elektrodę do ramienia za pomocą sterylnej taśmy. Elektroda może teraz zostać opuszczona do otworu kraniotomii. Należy upewnić się, że miejsca pomiarowe elektrody są skierowane w dół i będą miały kontakt z powierzchnią opony twardej lub miękkiej. Jeśli tkanka pozostanie wilgotna, elektroda powinna gładko osunąć się na tkankę i pozostać na swoim miejscu.
- Przewód uziemiający łączy się ze śrubą uziemiającą, owijając go co najmniej trzy razy wokół niej. Śrubą uziemiającą może być dowolna śruba, która miała kontakt z oponą twardą. Przewód referencyjny można w ten sam sposób przymocować do śruby referencyjnej.
- Małe kawałki Gelfoamu nasączonego solą fizjologiczną należy umieścić wokół elektrody w miejscach, gdzie odsłonięta jest opona twarda lub miękka. Niewielka ilość Gelfoamu nasączonego solą fizjologiczną powinna również zakrywać górną część cienkowarstwowej elektrody. Na wierzchu Gelfoamu można nałożyć utwardzalny promieniami UV akryl dentystyczny, aby stworzyć stabilną czapeczkę głowową. Akryl nakłada się bezpośrednio na izolację cienkowarstwowego kabla, aż do osiągnięcia złącza. Należy uważać, aby nie zakryć obszaru poniżej dolnej krawędzi nasadki złącza.
- Alternatywnie, po implantacji microECoG opisanej w punkcie 4.3, można niezwłocznie przystąpić do implantacji krzemowego macierzy mikroelektrod (kroki 3.2-3.6) poprzez małe otwory wykonane w podłożu microECoG. Pozwala to na jednoczesną rejestrację zarówno pojedynczych jednostek na różnych głębokościach, jak i wysokorozdzielczych potencjałów polowych z otaczającej powierzchni mózgu.
5. Rekonwalescencja pooperacyjna
- Po całkowitym utwardzeniu cementu ściśle zaszyj skórę wokół nakładki na głowę i wyjmij zwierzę z aparatu stereotaktycznego.
- Obficie zastosuj proszek antyseptyczny lub maść antybiotykową wokół rany. W przypadku krwawienia z uszu, wprowadź antybiotyk głęboko do kanału słuchowego.
- Zapewnij zwierzęciu ciepło, ponieważ barbiturany upośledzają zdolność do utrzymania temperatury ciała. Każde zwierzę z implantem przewlekłym umieść w oddzielnej klatce. Pełna rekonwalescencja zwierzęcia po zabiegu chirurgicznym trwa zazwyczaj od czterech do siedmiu dni.
6. Reprezentatywne wyniki
Pomyślnie przeprowadzona operacja implantacji elektrody krzemowej powinna skutkować uzyskaniem impedancji miejsc rejestracji w zakresie od 500kOhm do 2MOhm, a w przypadku elektrod cienkowarstwowych od 10kOhm do 50kOhm (przy 1kHz). Sygnał neuronalny można sprawdzić również bezpośrednio po operacji. Powinny być widoczne kolce (spikes) na implantowanych elektrodach oraz oscylacje wolnofalowe na powierzchniowej elektrodzie cienkowarstwowej (Rycina 1).
Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki aktywności pojedynczych jednostek i oscylacji ECoG. a) Dane szerokopasmowe z 6 jednocześnie rejestrowanych kanałów chronicznej elektrody krzemowej implantowanej w neocortex. Zauważalne jest, że kolce często występują w wielu miejscach rejestracji. b) Oscylacje ECoG z 6 kanałów 16-kanałowej cienkowarstwowej macierzy elektrod uECoG na powierzchni mózgu. Ze śladu każdego sygnału odjęto średnią ze wszystkich 16 sygnałów (referencja średniej wspólnej) i zastosowano cyfrowy filtr dolnoprzepustowy 500 Hz.
Dyskusja
Obserwuje się rosnące zainteresowanie wykorzystaniem wewnątrzkorowych i powierzchniowych wielokanałowych interfejsów rejestrujących do badania funkcji mózgu 2, dostarczania mikrostymulacji 3 lub sygnałów sterujących dla systemów neuroprotetycznych 4,5. Metody przedstawione w tym filmie demonstrują sposób implantacji chronicznych penetrujących i powierzchniowych systemów elektrod. Choć istnieją inne krzemowe chroniczne systemy elektrod 6, skupiliśmy się na implantacji elektrod płaskich opracowanych przez NeuroNexus Technologies 7,8. Techniki implantacji innych systemów elektrod będą się znacznie różnić.
Spośród opisanych etapów chirurgicznych, unieruchomienie zwierzęcia w stereotaktycznych uchwytach usznych może być najtrudniejszym i najważniejszym krokiem w określaniu dokładności umiejscowienia implantowanych elektrod. Należy zatem zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że końcówka każdego uchwytu usznego jest prawidłowo umieszczona w przewodzie słuchowym. Po upewnieniu się, że końcówka uchwytu znajduje się w przewodzie słuchowym prawego ucha zwierzęcia, zwolnij zacisk na szyi zwierzęcia prawą ręką, podczas gdy kciuk i palec wskazujący lewej ręki powinny nadal podtrzymywać głowę i dociskać ją do końcówki uchwytu usznego. Prawą ręką wsuń poluzowany lewy uchwyt uszny do kanału słuchowego, wywierając lekki nacisk do wewnątrz. Przesuwaj lewą stronę głowy zwierzęcia w dół, do przodu i we wszystkich kierunkach, aż poczujesz, że końcówka lewego uchwytu usznego wsunęła się do przewodu słuchowego. Prawą ręką kontynuuj wywieranie nacisku na lewy uchwyt uszny. Zwolnij głowę zwierzęcia i, używając teraz wolnej lewej ręki, dokręć śrubę mocującą lewego uchwytu usznego.
Oświadczenia
DRK jest współwłaścicielem firmy NeuroNexus Technologies.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez Center for Neural Communication Technology (CNCT), centrum zasobów P41 finansowane przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) i wspierane przez National Institutes of Health (NIH). Autorzy pragną podziękować Rio Vetterowi z NeuroNexus Technologies za opracowanie technik chirurgicznych oraz Parasowi Patelowi z University of Michigan za sporządzenie listy sprzętu wykorzystanego podczas operacji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Śruba kostna - #2-56 x 3/16, z łbem panhead na krzyżak, stal nierdzewna 18-8 S/S | BoltDepot | 7650 | |
| Śruba kostna – #2-56 x 1/8, łeb pan phillips, stal nierdzewna 18-8 | BoltDepot | 9617 | |
| Duża butla z tlenem – rozmiar K | Gazy kriogeniczne | OXKME | |
| Mała butla tlenowa – rozmiar E | Gazy kriogeniczne | OXYE-AL | |
| Nożyczki sprężynowe Vannasa-Tubingen – ostrze 2,5 mm, kątowe | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Pinceta Dumont nr 5, Teflon | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Pinceta Dumont #5, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannasa dla studentów | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Pinceta Adsona | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Krzywa rurka Friedmana-Pearsona | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Nożyczki irydologiczne - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannasa-Tubingena - ostrza 5 mm, proste | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Rękojeść skalpela | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Plastikowy pojemnik do sterylizacji | Fine Science Tools | 20810-02 | |
| Linijka ze stali nierdzewnej | Fine Science Tools | 30086-15 | |
| Sonda &Szpatułka prosta, 14 cm | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| Kleszczyki hemostatyczne proste | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Zakleszczka hemostatyczna zakrzywiona | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Stalowe wiertła mikro – 0,7 mm | Fine Science Tools | 19008-07 | Opakowanie po 10 szt. |
| Wiertła stalowe z mikro wiertłami ze stali nierdzewnej – 0,5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | Opakowanie 10 szt.* |
| Samowiercące wkręty kostne – 1,17 mm (średnica) – 4,7 mm (długość) | Fine Science Tools | 19010-00 | Opakowanie 100 szt. |
| Sztuczne łzy | Fisher Scientific | NC9860842 | Każdy |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-066452 | Butelka |
| Filtry węglowe F-AIR | Fisher Scientific | NC9112250 | Kanister |
| Patyczek aplikacyjny z bawełnianą końcówką, niejałowy | Usługi materiałowe | 1104 | 10 opakowań/karton |
| Gaza 2" x 2" | Usługi materiałowe | 1630 | 25 opakowań w opakowaniu zbiorczym |
| Końcówka igły, 23 GA x 1" | Usługi Materiałowe | 39412 | Sprzedawane w opakowaniach zbiorczych |
| Końcówka igły, 27 GA x 1,25" | Usługi Materiałowe | 25251 | |
| Końcówka igły, 30 GA x 0,5" | Usługi Materiałowe | 22023 | 10 pudełek/opakowanie |
| Maść z potrójnym antybiotykiem 0,6 g | Usługi Materiałowe | 2528 | |
| Woreczek, samouszczelniające woreczki do sterylizacji, 3,5" x 8" | Usługi materiałowe | 1023 | 10 pudełek/opakowanie |
| Roztwór Ringera 1000 ml | Usługi Materiałowe | 5263 | 12 woreczków/opakowanie |
| Jednorazowe sterylne ostrze skalpela nr 15 | Usługi Materiałowe | 1975 | 3 pudełka/opakowanie |
| Szew, nylon z igłą P-3, 5-0, 18 cali. | Usługi Materiałowe | 4618 | 12/op. |
| Podkład chłonny, jednorazowy 23" x 36" | Usługi materiałowe | 2545 | 15 opakowań/opakowanie zbiorcze |
| Lubrykant, żel chirurgiczny sterylny | Usługi Materiałowe | 2538 | 12 pudełek/opakowanie zbiorcze |
| Wchłanialna pianka żelowa 2 cm x 6 cm x 7 mm | Usługi materiałowe | 3107 | |
| Zestaw sześciu śrubokrętów do śrub imbusowych | National Jewelers Supplies | ETSCR98001 | |
| Klej Kwik Sil | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-SIL | |
| Probówki Kwik Sil | World Precision Instruments, Inc. | 600009 | |
| Przewlekłe elektrody krzemowe z 16 do 64 kanałami | NeuroNexus Technologies | Zależy od konstrukcji sondy | |
| Przewlekłe cienkowarstwowe elektrody powierzchniowe (mikr–(CoG) od 16 do 32 miejsc | NeuroNexus Technologies | Zależne od projektu sondy |
Bibliografia
- Paxinos, G. A. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Sixth Edition, Academic Press. (2007).
- Fujisawa, S. A. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat. Neurosci. 11 (7), 823-833 (2008).
- Merrill, D. B. Electrical stimulation of excitable tissue: design of efficacious and safe protocols. J. Neurosci. Methods. 141, 171-171 (2005).
- Gage, G. J. Naive coadaptive cortical control. J. Neural Eng. 2, 52-52 (2005).
- Marzullo, T. L. Development of Closed-Loop Neural Interface Technology in a Rat Model: Combining Motor Cortex Operant Conditioning With Visual Cortex Microstimulation. IEEE Trans. Neur. Sys. and Rehab. Eng. 18 (2), 117-126 (2010).
- Maynard, E. N. The Utah intracortical electrode array: a recording structure for potential brain-computer interfaces. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 102, 228-239 (1997).
- Kipke, D. V. Silicon-substrate intracortical microelectrode arrays for long-term recording of neuronal spike activity in cerebral cortex. IEEE Trans. Neural Syst. Rehab. Eng. 11 (2), 151-155 (2003).
- Vetter, R. W. Chronic neural recording using silicon-substrate microelectrode arrays implanted in cerebral cortex. IEEE Trans. Biomed. Eng. 51 (6), 896-904 (2004).
Przedruki i uprawnienia
