Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Podsumowanie

Przedstawiamy sposób przygotowania modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro oraz metodę oceny wpływu terapii komórkami macierzystymi na komórki serca po niedokrwieniu.

Streszczenie

Protokoły transplantacji komórek macierzystych są wdrażane do praktyki klinicznej^1,2,3. Celem aktualnych badań jest uzyskanie lepszych wyników, zwiększenie powtarzalności protokołów oraz znalezienie nowych źródeł komórek do implantacji^4,5. Badanie skuteczności terapii komórkowych nie jest łatwym zadaniem i wymagane są nowe narzędzia do analizy mechanizmów zaangażowanych w proces leczenia⁶. Opracowaliśmy eksperymentalny protokół niedokrwienia/reperfuzji, aby umożliwić obserwację połączeń komórkowych, a nawet mechanizmów subkomórkowych podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego oraz po transplantacji komórek macierzystych, a także w celu oceny skuteczności terapii komórkowej. Kardiomioblasty H9c2 naniesiono na płytki hodowlane^7,8. Niedokrwienie symulowano poprzez 150-minutową inkubację w medium bezglukozowym przy poziomie tlenu poniżej 0,5%. Następnie przywrócono standardowe medium i poziom tlenu, aby zasymulować reperfuzję. Po deprywacji tlenowo-glukozowej uszkodzone komórki poddano terapii poprzez transplantację znakowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z szpiku kostnego, dodając je do hodowli. Mezenchymalne komórki macierzyste są preferowane w badaniach klinicznych, ponieważ są łatwo dostępne przy minimalnie inwazyjnym zabiegu chirurgicznym, łatwo podlegają ekspansji i są autologiczne. Po 24 godzinach kokultywacji komórki barwiono kalceiną i etydyną-homodimerem, aby odróżnić komórki żywe od martwych. Układ ten pozwolił nam zbadać połączenia międzykomórkowe przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz określić wskaźnik przeżywalności komórek poniedokrwiennych za pomocą cytometrii przepływowej. Mikroskopia konfokalna wykazała interakcje między dwiema populacjami komórek, takie jak fuzja komórek i tworzenie nanorurek międzykomórkowych. Analiza cytometrii przepływowej ujawniła 3 klastry uszkodzonych komórek, które można przedstawić na wykresie i poddać analizie statystycznej. Populacje te mogą być badane osobno, a na podstawie uzyskanych danych można wyciągnąć wnioski dotyczące skuteczności symulowanego podejścia terapeutycznego.

Protokół

1. Przygotowanie komórek kardiomioblastów H9c2

Kardiomioblasty szczura H9c2 otrzymano z ATCC (Wesel, Niemcy) i namnażano w DMEM z wysoką zawartością glukozy (4,5 g/L), zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Linia komórkowa mioblastów H9c2 pochodzi z embrionalnego serca szczura i jest wykorzystywana jako model in vitro zarówno dla mięśni szkieletowych, jak i serca ^8,9.

Przygotuj płytkę 12-dołkową z komórkami H9c2:

1. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego z komórkami H9c2.
2. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml PBS i poddać trawieniu przy użyciu 2-3 ml 0,05% trypsyny/EDTA.
3. Umieścić szalkę Petriego na 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.
4. Zahamować działanie trypsyny, dodając 10 ml pożywki hodowlanej DMEM.
5. Odwirować komórki przy 1200 RPM przez 8 minut.
6. Po usunięciu supernatantu resuspendować komórki w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, stosując barwienie błękitem trypanu.
7. Wysiać 30 000 komórek H9c2 w 2 ml DMEM na każdą studzienkę płytki 12-dołkowej.
8. Umieścić płytkę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny.

2. Symulowane niedokrwienie/reperfuzja

Ischemię/reperfuzję symulowano in vitro poprzez przeprowadzenie deprywacji tlenu i glukozy (OGD) w hodowlach komórek H9c2. Procedurę tę wykonano na stole mikroskopu konfokalnego Zeiss z systemem inkubacji komórek PeCon (Erbach, Niemcy), co umożliwiło obserwację komórek podczas OGD.

1. Usunąć pożywkę poprzez aspirację z płytki 12-dołkowej z komórkami H9c2.
2. Przemyć komórki dwukrotnie PBS.
3. Dodać 3 ml pożywki bezglukozowej do każdego dołka.
4. Umieścić płytkę w systemie inkubacji komórek.
5. Włączyć dopływ azotu w celu usunięcia tlenu z systemu inkubacji.
6. Odczekać, aż poziom tlenu spadnie do 0.5%, a następnie uruchomić stoper. Poziom 0.5% tlenu odpowiada ciśnieniu parcjalnemu około 3 mmHg. Poddać komórki 150-minutowej symulowanej ischemii.
7. Po zakończeniu symulowanej ischemii usunąć z komórek pożywkę bezglukozową.
8. Pipetować 2 ml normalnej pożywki hodowlanej do dołków.
9. Umieścić płytkę 12-dołkową na 30 minut w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C; jest to „okres reperfuzji”.

3. Przygotowanie mezenchymalnych komórek macierzystych do ratunku

Szpik kostny pochodzenia ludzkiego przeniesiono do kolb T75 i rozcieńczono w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy oraz 1 g/l glukozy. Kolby inkubowano w temperaturze 37°C w pełnej wilgotności w atmosferze 5% CO₂ przez 3 dni. Po okresie inkubacji BMSCs przylgnęły do powierzchni kolb, a pozostałe składniki szpiku kostnego usunięto poprzez przemycie PBS. W eksperymentach wykorzystano BMSCs w zakresie od 1 do 5 pasażu. Tożsamość komórek potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej poprzez wykazanie obecności markerów powierzchniowych specyficznych dla danej linii komórkowej. Badano markery powierzchniowe specyficzne dla linii hematopoetycznej (CD34, CD45) oraz markery powierzchniowe mezenchymalne (CD73, CD90, CD105 i CD166).

Podczas symulowanego niedokrwienia przygotować ratunkowe mezenchymalne komórki macierzyste do transplantacji.

1. Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny Vybrant DiD w stosunku 1:200 w pożywce hodowlanej DMEM.
2. Odssać pożywkę z komórek rescue i dodać 300 μl DMEM z Vybrant DiD.
3. Umieścić szalkę Petriego na 30 minut w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C.
4. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego zawierającej mezenchymalne komórki macierzyste.
5. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml PBS i strawić za pomocą 2-3 ml 0,05% trypsyny/EDTA.
6. Umieścić szalkę Petriego na 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C.
7. Zahamować działanie trypsyny, dodając 10 ml pożywki hodowlanej DMEM.
8. Odwirować komórki przy 1200 RPM przez 8 minut.
9. Po usunięciu supernatantu resuspendować komórki w 1 ml pożywki hodowlanej DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru z użyciem barwienia błękitem trypanu (Trypan Blue).
10. Po 30 minutach, pod koniec reperfuzji, dodać 20 000 mezenchymalnych komórek macierzystych na dołek do poischemicznych mioblastów serca H9c2.
11. Umieścić ko-kulturę komórek w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C na 24 godziny.

4. Analiza z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej

Po symulowanym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym komórki są inkubowane w zwykłej pożywce hodowlanej przez 24 godziny.

1. Po 24 godzinach przemyć komórki dwukrotnie PBS.
2. Przebarwić komórki w 500 μl roztworu barwnika live/dead przez 30 minut (5 nM kalceiny i 400 nM etydyny-homodimeru-2 w PBS) (5x10⁴ komórek/ml).

Ocenę obrazów konfokalnych żywych i martwych komórek wyselekcjonowanych na podstawie morfologii i fluorescencji można przeprowadzić przy użyciu oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health, USA). W przypadku kokultur MSC można odróżnić od komórek H9c2 dzięki ich znakowaniu Vybrant DiD. Odsetek martwych komórek można ocenić w 4 niezależnych polach widzenia (obiektyw 10x) dla każdej hodowli w sposób zaślepiony¹⁰.

Kardiomioblasty H9c2 hodowane na szklanych szkiełkach obejściowych o średnicy 42 mm można również badać za pomocą wideomikroskopii poklatkowej w trakcie i po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym, wykorzystując system inkubacji komórek mikroskopu konfokalnego. W czasie można badać oddziaływania międzykomórkowe, takie jak fuzja komórek i tworzenie nanorurek międzykomórkowych.

5. Analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Po symulowanym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym komórki są inkubowane w zwykłej pożywce hodowlanej przez 24 godziny.

1. Po 24 godzinach należy zebrać pożywkę hodowlaną. Bardzo ważne jest zebranie pożywki, ponieważ w ciągu 24-godzinnej inkubacji z powierzchni naczynia hodowlanego mogły oddzielić się martwe komórki.
2. Komórki należy przemyć dwukrotnie roztworem PBS i poddać trawieniu 0,05% trypsyną-EDTA.
3. Trawienie trypsyną należy zahamować, dodając pożywkę DMEM.
4. Komórki oraz zebraną pożywkę hodowlaną należy odwirować przy 1200 RPM (około 150-200g) przez 8 minut.
5. Należy odlać nadsącz.
6. Komórki należy zawiesić w 500 μL roztworze barwnika live/dead na 30 minut (5 nM kalceiny i 400 nM etydinium-homodimeru-2 w PBS) (5x10⁴ komórek/ml).
7. Komórki należy przenieść do probówek do cytometrii przepływowej.
8. Należy uruchomić oprogramowanie CellQuest Pro.
9. Aby skonfigurować cytometr przepływowy do pomiaru, należy przygotować próbki kontrolne komórek żywych i martwych.
   1. Komórki H9c2 należy wysiać z gęstością 3x10⁴ w płytkach 12-dołkowych zgodnie z opisem w punkcie 1.
   2. Kontrole komórek żywych należy przygotować poprzez jednorazową trypsynizację zgodnie z opisem w punkcie 1.
   3. Kontrole komórek martwych należy przygotować poprzez traktowanie 10 μM H₂O₂ przez 1 godzinę.
   4. Po trypsynizacji kontrole komórek żywych i martwych należy resuspender w 500 μl roztworze barwnika live/dead (5 nM kalceiny-AM i 400 nM etydinium-homodimeru-2 w PBS).
10. Ustawienia instrumentu powinny zostać dostosowane tak, aby komórki żywe były dodatnie dla kalceiny i ujemne dla etydinium homodimeru, natomiast komórki martwe były ujemne dla kalceiny i dodatnie dla etydinium homodimeru.
11. Procentowy udział tych populacji można przedstawić w formie słupków na wykresie, a na podstawie tych wartości można przeprowadzić analizę statystyczną.
12. Należy zmierzyć poszczególne grupy eksperymentalne.

6. Reprezentatywne wyniki:

Nasze wyniki wykazały, że dodane mezenchymalne komórki macierzyste mogą poprawić przeżywalność komórek serca po niedokrwieniu. Obrazy z mikroskopii konfokalnej ujawniły bezpośrednie interakcje międzykomórkowe, takie jak częściowe połączenia błonowe lub nanotubule międzykomórkowe, które prawdopodobnie odgrywają istotną rolę w obserwowanej ochronie¹⁰. Nanotubule te rozciągają się na odległość kilku średnic komórkowych, a ich średnice wynosiły od 200 do 500 nm (białe strzałki).

Rycina 1. Tworzenie się nanotubul między komórkami. Obserwowano tworzenie się nanotubul (biała strzałka) pomiędzy kardiomioblastami znakowanymi Vybrant DiO a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi znakowanymi Vybrant DiD.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała populacje przeżywających i nekrotycznych kardiomioblastów oraz mezenchymalnych komórek macierzystych. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy również trzecią, „uszkodzoną” populację kardiomioblastów, która zawierała kalceinę, ale zawierała także wskaźnik komórek martwych, etydyny homodimer (Rycina 2).

Rycina 2. Reprezentatywny wykres kropkowy różnych populacji komórek po symulowanej ischemii.

Ocena kilku eksperymentów wykazała, że dodanie mezenchymalnych komórek macierzystych do poischemicznych kardiomioblastów H9c2 znacząco zwiększyło odsetek żywych komórek w porównaniu do kardiomioblastów hodowanych samodzielnie po niedokrwieniu (Rysunek 3).

Rycina 3. Wpływ leczenia komórkami macierzystymi na kardiomioblasty po niedokrwieniu. Procent żywych komórek uległ znacznemu zmniejszeniu po symulowanym niedokrwieniu w porównaniu z grupą kontrolną (kontrola vs model I-R: 90,36±2,60 vs 10,52±0,48, *** p>0,001), a następnie wzrósł po dodaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (model I-R vs I-R + BMSC: 10,52±0,48 vs 25,21±2,13, *** p>0,001). Dane przedstawiono jako średnia±SEM. Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z testem post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych.

Dyskusja

Przedstawiony protokół jest podejściem in vitro do znacznie bardziej złożonego problemu terapii komórkami macierzystymi w zawale mięśnia sercowego, ze wszystkimi zaletami i wadami takiego modelu. Oczywiście nie może on odzwierciedlać złożonych (np. immunologicznych) zdarzeń zachodzących podczas i po zawale mięśnia sercowego, ale pozwala skupić się na bezpośrednim wpływie dodanych komórek na komórki po niedokrwieniu. Efekty symulowanego niedokrwienia w kardiomioblastach H9c2 w dużym stopniu zależą od czasu OGD, n...