Behawioralne określenie dyskryminacji par bodźców słuchowych, akustycznych i elektrycznych z zastosowaniem warunkowania klasycznego i analizy tętna

Podsumowanie

Opisano zastosowanie klasycznego behawioralnego paradygmatu warunkowania lękowego w badaniach nad protezami słuchowymi u szczurów. Paradygmat ten umożliwia identyfikację zarówno detekcji, jak i rozróżniania między odmiennymi bodźcami akustycznymi i elektrycznymi, wykorzystując tętno jako miernik wyniku.

Streszczenie

Ostre preparaty zwierzęce były wykorzystywane w badaniach prospektywnych nad konstrukcjami elektrod i technikami stymulacji w celu ich integracji z neuronowymi protezami słuchowymi, takimi jak implanty pnia mózgu^1-3 oraz implanty śródmózgowia^4,5. Choć eksperymenty ostre mogą dostarczyć wstępnych informacji na temat skuteczności implantu, testowanie zwierząt z implantami chronicznymi w stanie czuwania daje korzyść w postaci możliwości zbadania właściwości psychofizycznych doznań wywoływanych za pomocą wszczepionych urządzeń^6,7.

W celu uzyskania behawioralnego potwierdzenia detekcji odpowiedniej cechy bodźca stosowano kilka technik, takich jak warunkowanie instrumentalne oparte na nagrodzie^6-8, warunkowane unikanie^9-11 czy klasyczne warunkowanie lękowe¹². Wybór techniki wiąże się z koniecznością wyważenia takich aspektów jak efektywność czasowa (często niska w podejściach opartych na nagrodzie), możliwość jednoczesnego testowania wielu cech bodźca (ograniczona w warunkowanym unikaniu) oraz niezawodność pomiaru przy powtarzających się bodźcach (potencjalne ograniczenie w przypadku zastosowania pomiarów fizjologicznych).

W niniejszym materiale przedstawiono klasyczną behawioralną metodę warunkowania lękowego, która może być wykorzystana do jednoczesnego badania detekcji bodźca oraz dyskryminacji między dwoma bodźcami. Jako miara reakcji lękowej wykorzystano tętno, co ogranicza lub eliminuje potrzebę czasochłonnego kodowania wideo zachowań zamierania (freezing) lub innych podobnych parametrów (choć takie miary można uwzględnić w celu uzyskania dowodów zbieżnych). Zwierzęta poddano warunkowaniu przy użyciu tych technik w trzech 2-godzinnych sesjach warunkowania, z których każda obejmowała 48 prób bodźcowych. Następnie przeprowadzono sesje testowe, każda składająca się z 48 prób, aby zbadać detekcję każdego bodźca w prezentowanych parach oraz przetestować dyskryminację między poszczególnymi bodźcami w każdej parze.

Niniejsza metoda behawioralna została przedstawiona w kontekście jej zastosowania w badaniach nad protezami słuchowymi. Zaprezentowano implantację urządzeń do telemetrii elektrokardiograficznej. Przedstawiono również następującą po niej implantację elektrod mózgowych do jądra ślimakowego, prowadzoną pod kontrolą monitorowania odpowiedzi neuronalnych na bodźce akustyczne, a także stabilizację elektrody w miejscu implantacji w celu jej przewlekłego zastosowania.

Protokół

1. Implantacja urządzenia do telemetrii elektrokardiograficznej

1. Na godzinę przed rozpoczęciem operacji implantacji podaj Carprofen (4 mg/kg s.c.) w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.
2. Wstrzyknij Ketaminę/Ksylazynę (Ke: 70 mg/kg, Xy: 10 mg/kg, i.p.) w celu znieczulenia, aby umożliwić wstępne przygotowanie zwierzęcia, w tym zgolenie i zamocowanie uchwytów do uszu, przed przejściem na znieczulenie izofluranem, które jest stabilniejsze podczas operacji, co pozwala na lepszą regulację głębokości znieczulenia i skraca czas wybudzania po operacji.
3. Po wystąpieniu efektu znieczulenia zastosuj smar do oczu w oczach zwierzęcia, a następnie ogol brzuch, klatkę piersiową i gardło. Przetrzyj odsłoniętą skórę za pomocą scrubu chirurgicznego, następnie preparatem alkoholowym do skóry, a na końcu roztworem antyseptycznym. Umieść klatkę domową na kocu grzewczym w celu ogrzania.
4. Umieść zwierzę w pozycji na plecach na płycie homeotermicznej. Włóż watę pod szyję, aby unieść i odsłonić gardło.
5. Załóż lejek nosowy (podający 1-3% vol/vol izofluranu w tlenie, 2 L per min) na nos zwierzęcia i przymocuj lejek na miejscu.
6. Ustabilizuj przednie kończyny w pozycji półwyprostowanej, aby uzyskać napięcie skóry nad klatką piersiową i gardłem oraz zapobiec ześlizgnięciu się nosa z lejka nosowego.
7. Wprowadź sondę koca homeotermicznego do odbytnicy zwierzęcia.
8. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry, rozciągając je od wyrostka mieczykowatego 20 mm w kierunku ogonowym, aby odsłonić warstwę mięśniową. Wykonaj analogiczne nacięcie wzdłuż linea alba, a następnie w jamie otrzewnej.
9. Wprowadź urządzenie do telemetrii EKG do jamy otrzewnej, tak aby elektrody wystawały z przedniej części otworu, a następnie zaszyj tylne 15 mm otworu w otrzewnej.
10. Wykonaj nacięcie w linii środkowej gardła nad tchawicą, odsłaniając mięsień mostkowo-hyoideus.
11. Wprowadź kleszczyki typu alligator w przestrzeń podskórną przedniego nacięcia, kierując się ku tyłowi, i wykorzystaj je do utworzenia tunelu podskórnego od nacięcia przedniego do tylnego. Chwyć kleszczykami dodatnią (czerwoną) elektrodę i przeciągnij ją przez tunel.
12. Unieś mięsień mostkowo-hyoideus za pomocą kleszczyczek i wprowadź końcówkę dodatniej elektrody grzbietowo w kierunku prawego przedniego śródpiersia, pozostawiając około 1 mm pętli kabla przed miejscem wprowadzenia. Przyszyj elektrodę w miejscu, w którym wychodzi z jamy klatki piersiowej, oraz w górnej części pętli do leżącego pod nią mięśnia.
13. Odsłoń ścianę grzbietową wyrostka mieczykowatego i przyszyj końcówkę ujemnej elektrody do odsłoniętej powierzchni.
14. Sprawdź sygnał z implantowanego urządzenia, aby upewnić się, że można uzyskać odpowiedni zapis EKG.
15. Wprowadź nadmiar kabla do jamy otrzewnej. Zaszyj ścianę otrzewną, linea alba oraz skórę brzucha.
16. Zaszyj skórę gardła.
17. Przerwij podawanie izofluranu i kontynuuj podawanie tlenu aż do zaobserwowania spontanicznych ruchów.
18. Po zaobserwowaniu ruchów zwolnij przednie kończyny i przenieś zwierzę do klatki domowej. Ustaw klatkę tak, aby około połowa klatki znajdowała się na macie grzewczej. Pozwoli to zwierzęciu, gdy odzyska sprawność, przemieszczać się między cieplejszymi a chłodniejszymi obszarami klatki. Monitoruj zwierzę do czasu odzyskania zdolności poruszania się i pozostaw klatkę domową na kocu grzewczym przez 24 godziny.
19. Podawaj Carprofen (4 mg/kg s.c.) co 24 godziny przez 3-5 dni.

2. Implantacja elektrod do mózgu

1. Na godzinę przed rozpoczęciem implantacji podaj Karprofen (4 mg/kg s.c.) w celu zapewnienia przeciwbólowczego działania pooperacyjnego.
2. Wstrzyknij Ketaminę/Ksylazynę (Ke: 70 mg/kg, Xy: 10 mg/kg, i.p.) w celu wprowadzenia w stan znieczulenia.
3. W momencie wystąpienia znieczulenia nałóż maść do oczu w celu ochrony gałek ocznych, a następnie ogol głowę zwierzęcia. Przetrzyj odsłoniętą skórę za pomocą betadyny, następnie alkoholu, a na koniec ponownie betadyny.
4. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej na płycie homeotermicznej.
5. Ustaw jeden pusty w środku pręt uszny w przybliżonej końcowej pozycji, a następnie unieś i ustaw zwierzę tak, aby pręt znalazł się w przewodzie słuchowym zewnętrznym.
6. Wsuń drugi pusty w środku pręt uszny do przeciwległego przewodu słuchowego zewnętrznego.
7. Za pomocą kleszczy do zębów szczura rozewrzyj szczękę zwierzęcia i zahacz górne siekacze o uchwyt do zębów.
8. Nasuń maskę nosową na nos i rozpocznij podawanie Izofluranu (1-3% obj./obj. w tlenie). W trakcie całego zabiegu zwierzęta są utrzymywane pod tym środkiem znieczulającym.
9. Wykonaj nacięcie skóry na głowie, około 1 mm na lewo od linii środkowej, rozciągając się od 3-4 mm rostralnie do 2-3 mm kaudalnie od lambda.
10. Odciągnij skórę i mięśnie bocznie od nacięcia, odsłaniając kość ciemieniową i kość międzyciemieniową. Przetrzyj powierzchnię odsłoniętej kości za pomocą 20% roztworu nadtlenku wodoru i gazy.
11. Wywierć mały otwór w lewej i prawej kości ciemieniowej, a następnie wkręć w każdy otwór stalowy wkręt chirurgiczny, pozostawiając niewielką (0,5 mm) przestrzeń między łebkiem wkręta a czaszką. Podłącz te wkręty do punktów elektrody uziemiającej i referencyjnej wysokoimpedancyjnego wzmacniacza głowicowego.
12. Wywierć otwór o wymiarach około 2 mm kwadrat w najbardziej bocznej części kości międzyciemieniowej. Przepłucz otwór sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć pył lub odłamki kostne, które mogłyby uszkodzić elektrodę.
13. Przymocuj głośnik sprzęgający do lewego pustego pręta usznego.
14. Za pomocą czubka igły wykonaj nacięcie w oponie twardej w płaszczyźnie strzałkowej.
15. Ustaw manipulator elektrody nad otworem pod kątem caudorostralnym 10°. Wprowadź elektrodę ręcznie na głębokość około 2 mm do powierzchni mózgu. Upewnij się, że wzmacniacz jest włączony, a następnie zamknij komorę rejestracyjną.
16. Rozpocznij cykliczne podawanie szumu filtrowanego pasmowo o niskiej (2-8 kHz), średniej (16-24 kHz) i wysokiej częstotliwości (32 kHz-44 kHz). Maksymalna częstotliwość podawania serii powinna wynosić jedna seria co 200 ms. Monitoruj aktywność neuronalną na każdym kanale w celu wykrycia odpowiedzi na prezentowany szum.
17. Kontynuuj wprowadzanie elektrody, aż całkowita odległość wkłucia zbliży się do 8 mm. Jeśli limit 8 mm zostanie osiągnięty bez wykrycia odpowiedzi neuronalnych, wycofaj i ponownie ustaw elektrodę do kolejnego wprowadzenia. W przypadku dotarcia do jądra ślimakowego (CN), punkty na końcówce elektrody powinny wykazywać odpowiedzi głównie na bodźce wysokoczęstotliwościowe. Jeśli elektrody znajdują się w brzusznej części jądra ślimakowego (VCN), odpowiedzi na bodziec akustyczny powinny mieć silny komponent początkowy (1-5 ms), po którym następuje szybki spadek aktywności.
18. Kontynuuj wprowadzanie elektrody, aż końcówki elektrody wykryją odpowiedzi na bodźce niskoczęstotliwościowe lub do momentu zaprzestania występowania aktywności wywołanej słuchowo (w takim przypadku elektroda mogła przejść całkowicie przez CN i konieczna może być korekta jej umiejscowienia).
19. Stwórz mapę odpowiedzi częstotliwościowo-amplitudowych neuronów w miejscach kontaktu elektrod. Osiąga się to poprzez prezentowanie dźwięku w żądanym zakresie częstotliwości (zazwyczaj 1-44 kHz lub 1-80 kHz) przy amplitudach 1-70 dB, z 10 powtórzeniami każdego bodźca. Podczas mapowania CN jeden bodziec może być podawany co 300 ms. Jeśli mapa jest niewystarczająca, rozważ korektę ułożenia elektrody.
20. Nałóż cienką warstwę elastomeru silikonowego nieco powyżej odsłoniętych trzpieni elektrody, tak aby elastomer spłynął w dół trzpieni i pokrył zarówno trzpienie, jak i odsłoniętą powierzchnię mózgu.
21. Nałóż pierwszą warstwę polimerowego cementu protetycznego wokół elektrody. Cement powinien mieć minimalną lepkość, aby zmniejszyć ryzyko przemieszczenia elektrody podczas aplikacji. Upewnij się, że polimer nie zakrywa wkrętów w kościach ciemieniowych ani przyłączonych kabli. Odczekaj do utwardzenia akrylu, co zazwyczaj trwa 5-10 minut.
22. Odłącz przewody uziemiające i referencyjne wzmacniacza głowicowego od wkrętów w kościach ciemieniowych. Za pomocą pęsety delikatnie owiń przewód uziemiający elektrody wokół wkręta w lewej kości ciemieniowej.
23. Nałóż drugą warstwę polimerowego cementu protetycznego. Ta druga warstwa powinna otoczyć oba wkręty i wniknąć w przestrzeń między łebkiem wkręta a czaszką. Dzięki temu wkręty utrzymają akryl i elektrodę przy czaszce. Odczekaj do utwardzenia akrylu.
24. Zdejmij wzmacniacz głowicowy z złącza elektrody.
25. Za pomocą kleszczy do zębów szczura unieś skórę bocznie nad polimerem i użyj szwu typu „marszczącego” (purse-string), aby zamknąć skórę wokół odsłoniętego złącza elektrody.
26. Usuń pręty uszne, uwalniając głowę.
27. Zakończ podawanie Izofluranu i kontynuuj podawanie tlenu przez maskę nosową, aż do momentu zaobserwowania spontanicznych ruchów.
28. Kieruj zwierzę do klatki domowej. Ustaw klatkę tak, aby około połowa klatki znajdowała się na macie grzewczej. Pozwoli to zwierzęciu po odzyskaniu sprawności poruszać się między cieplejszymi a chłodniejszymi obszarami klatki.
29. Monitoruj zwierzę do momentu odzyskania zdolności poruszania się. Pozostaw klatkę domową na macie grzewczej przez 24 godziny.
30. Podawaj Karprofen (4 mg/kg s.c.) co 24 godziny przez 3-5 dni.

3. Kondycjonowanie

1. Umieść zwierzę w komorze testowej.
2. Uruchom urządzenie do telemetrii EKG.
3. Pozostaw zwierzę w komorze testowej na pięć minut w celu aklimatyzacji przed rozpoczęciem warunkowania. Pozwoli to na powrót częstotliwości akcji serca do poziomu bazowego, ponieważ manipulacja zwierzęciem powoduje wzrost tętna.
4. Przeprowadź procedurę warunkowania:
   1. Podawaj jeden losowo wybrany sygnał z pary bodźców akustycznych wielokrotnie w 250 ms seriach, oddzielonych 250 ms ciszy przez 80-170 s. Każda prezentacja bodźca musi mieć czas narastania i opadania wynoszący 10 ms, aby uniknąć słyszalnego „kliknięcia”, które percepcyjnie obejmuje szeroki zakres częstotliwości dźwięku.
   2. Zacznij naprzemienne podawanie drugiego sygnału z pary bodźców akustycznych z pierwszym, prezentując każdy ton przez 250 ms, po których następuje 250 ms ciszy.
   3. Po 9,5 s z 10 s okresu naprzemiennej prezentacji tonów, podaj wstrząs stopy o czasie trwania 0,5 ms (0,7 mA).
   4. Przerwij prezentację tonów na 30 s, aby umożliwić stabilizację częstotliwości akcji serca.
   5. Wznów podawanie par tonów (zgodnie z punktem 3.4.1). Pary tonów powinny być optymalnie prezentowane w losowej kolejności; należy użyć co najmniej 12 par tonów, aby zapewnić uogólnienie warunkowania na wszystkie pary częstotliwości, a nie tylko na konkretne częstotliwości tonów. Kontynuuj ten proces aż do ukończenia 48 cykli procedury (prób).
5. Wyłącz urządzenie EKG i przenieś zwierzę z powrotem do klatki domowej.

4. Testowanie

1. Zanurzyć zwierzę w narkozie z użyciem izofluranu (1-3% vol/vol w tlenie).
2. Podłączyć kabel do stymulacji nerwowej do odsłoniętego złącza elektrody.
3. Umieścić zwierzę w komorze testowej.
4. Aktywować urządzenie do telemetrii EKG.
5. Pozwolić zwierzęciu dojść do siebie po narkozie izofluranem i aklimatyzować się w komorze testowej przez dziesięć minut przed rozpoczęciem testów. Pozwoli to na powrót częstości akcji serca do poziomu bazowego oraz wyzdrowienie po krótkotrwałym działaniu środka anestetycznego.
6. Przeprowadzić procedurę testową.
   1. Podawać jeden losowo wybrany sygnał z pary bodźców akustycznych wielokrotnie, w seriach trwających 250 ms przedzielonych 250 ms ciszy, przez okres od 80 do 170 s. Każda prezentacja bodźca musi mieć czas narastania i opadania wynoszący 10 ms, aby uniknąć postrzegania „kliknięcia”, które obejmuje szeroki zakres częstotliwości dźwięku.
   2. Zacząć naprzemienne podawanie drugiego sygnału z pary bodźców akustycznych z pierwszym, prezentując każdy ton przez 250 ms, po których następuje 250 ms ciszy.
   3. Po 9,5 s okresu 10 s naprzemiennej prezentacji tonów, podać wstrząs elektryczny stopy o czasie trwania 0,5 ms.
   4. Przerwać prezentację tonów na 30 s, aby pozwolić na stabilizację częstości akcji serca.
   5. Zacząć podawać jeden losowo wybrany bodziec z pary elektrycznych stymulacji mózgu wielokrotnie, stosując 250 ms okresów stymulacji przedzielonych 250 ms brakiem stymulacji przez 80-170 s.
   6. Zacząć naprzemienne podawanie drugiego bodźca z pary stymulującej z pierwszym, prezentując każdy bodziec przez 250 ms, po których następuje 250 ms okresu braku stymulacji. Kontynuować naprzemienną stymulację przez 10 s.
   7. Przerwać prezentację bodźców na 30 s, aby pozwolić na stabilizację częstości akcji serca.
   8. Wznowić podawanie par bodźców (zgodnie z punktem 4.6.5 lub 4.6.1). Pary bodźców powinny być prezentowane w losowej kolejności, a dla każdej pary bodźców powinno zostać przeprowadzonych co najmniej 20 prób, aby zapewnić zebranie wystarczającej ilości danych o częstości akcji serca dla uzyskania wyraźnego wyniku średniego i zminimalizowania zmienności. Rozmieszczenie prób z bodźcami akustycznymi w trakcie całej sesji testowej zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia wygaszenia w trakcie procedury.
7. Odłączyć kabel stymulujący od zwierzęcia.
8. Dezaktywować urządzenie EKG.
9. Zwrócić zwierzę do klatki domowej.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykładowy zapis EKG wykonany za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego tydzień po implantacji przedstawiono na Rysunku 1. Taki zapis można zazwyczaj uzyskać z wszczepionych urządzeń, które nadal funkcjonują prawidłowo w zakresie rejestracji przez ponad sześć miesięcy, nawet jeśli do przymocowania kabli do mięśni użyto rozpuszczalnej nici chirurgicznej. Zapis EKG przedstawiony na Rysunku 2 uzyskano od zwierzęcia ponad osiem miesięcy po implantacji.

Rycina 3 przedstawia lokalizację udanej implantacji. Rozmieszczenie elektrod obejmuje wiele punktów elektrodowych w tylno-brzusznej części jądra ślimakowego (PVCN), zapewniając dostęp do stymulacji i rejestracji znacznej części aspektu grzbietowo-brzusznego. Odpowiedzi częstotliwościowe każdego punktu elektrodowego dla tej implantacji przedstawiono na Rycynie 4. Rozległy obszar PVCN, w którym rozmieszczone są elektrody, sprawia, że populacje komórek dostępne do rejestracji i stymulacji są „dostrojone” do szerokiego zakresu częstotliwości. Ponadto same populacje są wąsko dostrojone – reagują one jedynie na wąski pas częstotliwości dźwięku (patrz Rycina 5).

W przeciwieństwie do tego, błędne umiejscowienie pokazano na Rysunku 6. W tym przypadku elektroda została umieszczona zbyt przyśrodkowo i nie została wprowadzona wystarczająco głęboko, aby spenetrować PVCN. W konsekwencji tylko miejsca elektrod w pobliżu wierzchołka wykazują odpowiedzi na dźwięk, co przedstawiono na Rysunku 7. Ponadto zakres częstotliwości, na które zestrojone są dostępne populacje komórek, jest bardzo ograniczony. Strojenie samych populacji jest wąskie (patrz Rysunek 8), ale skupiony rozkład częstotliwości centralnych populacji komórek uniemożliwia stymulację odrębnych obszarów częstotliwości.

Bazowe dane dotyczące częstości pracy serca różniły się pomiędzy prezentacjami warunkowych bodźców akustycznych. Aby uwzględnić tę zmienność, surowe dane częstości akcji serca (HR) zostały znormalizowane jako proporcja HR zaobserwowanego w momencie rozpoczęcia naprzemiennego podawania bodźców (czas 0). Rycina 9 przedstawia dane w różnych formach, zebrane podczas pierwszej sesji warunkowania. Przykład wyników HR uzyskanych u innego zwierzęcia w późniejszej części początkowych sesji warunkowania zaprezentowano na Rycini 10. Proces warunkowania na bodźce akustyczne przebiega szybko i już po kilku próbach można zaobserwować znaczne zmiany HR; w przypadku Ryciny 9 i 10 było to 7 prób. Zmiana HR zaobserwowana bezpośrednio po rozpoczęciu naprzemiennego podawania bodźców (patrz pkt 3.4.1 i 3.4.2) stanowi dowód na to, że zwierzę jest w stanie odróżnić początkowy bodziec powtarzany od drugiego bodźca dodanego w późniejszym czasie.

Po rozpoczęciu sesji testowych, podczas których zazwyczaj podaje się elektryczne bodźce neuronalne zamiast bodźców akustycznych, włączenie prezentacji bodźców akustycznych pozwala potwierdzić, że efekty warunkowania nadal występują. Ogólna zmiana HR w odpowiedzi na rozpoczęcie prezentacji bodźca akustycznego potwierdza, że efekt warunkowania na bodźce akustyczne nadal występuje, co przedstawiono na Rysunku 11. Podobnie, Rysunek 12 przedstawia średnią proporcjonalną zmianę HR w czasie rozpoczęcia naprzemiennego podawania sygnałów akustycznych w pierwszej sesji testowej. Podobnie jak na Rysunku 9 i 10, stosunkowo stabilne HR przed wprowadzeniem drugiego bodźca w przeciwieństwie do gwałtownej zmiany HR po wprowadzeniu drugiego bodźca stanowi dowód na to, że nastąpiło rozróżnienie między dwoma tonami.

W przeciwieństwie do tego, brak detekcji można zaobserwować na Rysunku 13, na którym rozpoczyna się stymulacja elektryczna. Średnia proporcjonalna zmiana HR w 10 próbach nie wykazuje oznak stałego, gwałtownego spadku obserwowanego podczas detekcji, jak na Rysunku 11. Podobnie, brak spójnej i szybkiej zmiany rytmu serca na Rysunku 14 sugeruje, że dwa dostarczane bodźce elektryczne nie różnią się od siebie na tyle, aby doszło do dyskryminacji. Zarówno przed rozpoczęciem okresu naprzemiennego (przed czasem 0), jak i po jego rozpoczęciu, średnia proporcjonalna zmiana HR pozostaje blisko linii braku zmian.

Wzorzec bardziej charakterystyczny dla rozróżniania dwóch członków pary bodźców neuronalnych przedstawiono na Rysunku 15. Szybko po rozpoczęciu naprzemiennego podawania bodźców następuje spadek częstości akcji serca, po którym następuje jego znaczny wzrost. Strategia stymulacji zastosowana w tym przypadku okazała się skuteczna w wywołaniu odpowiedzi istotnej behawioralnie.

Rysunek 1. Zapis EKG uzyskany za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego tydzień po implantacji. Sygnał widoczny w tym zapisie jest w dużej mierze typowy dla zapisów uzyskiwanych za pomocą tych urządzeń.

Figura 2. Rejestracja EKG uzyskana za pomocą implantowanego urządzenia telemetrycznego sześć miesięcy po implantacji. W tym okresie odnotowano pomijalną degradację rejestrowanego sygnału, a sygnał ten jest w pełni wystarczający do obliczenia tętna zwierzęcia.

Rycina 3. Rekonstrukcja 3D prawidłowego rozmieszczenia elektrod, wykonana przy użyciu połączonej tomografii komputerowej rentgenowskiej oraz przekrojów histologicznych. Oba trzpienie elektrod przeniknęły przez grzbietowo-brzuszną część jądra ślimakowego, a elektrody zostały zorientowane przodem do tej struktury.

Rycina 4. Mapa odpowiedzi elektrofizjologicznych zarejestrowanych przy rozmieszczeniu elektrod przedstawionym na Rycynie 3. Każdy histogram przedstawia dane dotyczące aktywności w miejscu jednej elektrody w odpowiedzi na prezentację jednej częstotliwości akustycznej; każda kolumna reprezentuje okres czasu 25 ms. Na obu ramionach macierzy elektrod odpowiedzi są wykrywane w każdym poszczególnym miejscu elektrody tylko w odpowiedzi na dość wąskie pasmo częstotliwości, jednak te wąskie pasma są rozłożone w szerokim zakresie częstotliwości. Taki rozkład jest idealny, ponieważ wiele odrębnych regionów mózgu związanych z częstotliwością może być stymulowanych niezależnie.

Rysunek 5. Odpowiedź elektrofizjologiczna w kanale 10 implantu przedstawionego na Rysunkach 3 i 4. W idealnym przypadku rozmieszczenie elektrod powinno prowadzić do wykrycia odpowiedzi neuronalnych na bodziec akustyczny w kilku kanałach przy amplitudzie dźwięku tak niskiej jak 10 dB, co widoczne jest w niniejszym przykładzie.

Rysunek 6. Rekonstrukcja 3D błędnego rozmieszczenia elektrody. Mimo że kąt caudorostralny elektrody był prawidłowy, została ona umieszczona zbyt przyśrodkowo. Ponadto elektroda nie została wprowadzona wystarczająco głęboko, w wyniku czego punkty najbliższe końcówce elektrody znalazły się w obrębie grzbietowego jądra ślimakowego.

Rysunek 7. Mapa odpowiedzi elektrofizjologicznych zarejestrowanych przy rozmieszczeniu elektrod pokazanym na Rysunku 6. Aktywność występuje na końcach każdego ramienia matrycy elektrod, jednak różnice w częstotliwości bodźca akustycznego wywołującego aktywność w każdym miejscu elektrody są niewielkie. Taka implantacja nie umożliwia stymulacji odrębnych warstw częstotliwości w celu przeprowadzenia testów dyskryminacyjnych.

Rysunek 8. Odpowiedź elektrofizjologiczna w kanale 28 przy rozmieszczeniu elektrod pokazanym na Rysunkach 6 i 7. Bodziec akustyczny wywołuje silne serie aktywności, o częstotliwości impulsów zbliżonej do tej obserwowanej przy bardzo udanej implantacji (Rysunek 3). Próg jest również dość niski, a odpowiedzi wykrywano w reakcji na tony o natężeniu 20 dB. Gdyby w innych kanałach macierzy występowała większa zmienność częstotliwości, dla których odnotowano najsilniejsze odpowiedzi, kanał ten z pewnością byłby odpowiedni do stymulacji.

Rysunek 9. Porównanie surowego tętna (A) z danymi średnimi proporcjonalnymi (B) zebranymi podczas pierwszej sesji warunkowania u jednego zwierzęcia. Przedstawiono odpowiedzi z 7 prezentacji. Ze względu na zmienność tętna początkowego przed rozpoczęciem zmiany dźwięku, średnie surowe tętno (±95% przedziały ufności) nie oddaje w sposób adekwatny stopnia zmiany w postaci początkowego spadku tętna, po którym następuje wzrost, co wskazują poszczególne surowe ślady (A, dół). Średnią proporcjonalną zmianę tętna, w której tętno dzielono przez tętno w momencie prezentacji warunkowanego bodźca akustycznego dla każdego śladu, przedstawiono w (B). Wykazuje ona statystycznie istotny spadek po prezentacji bodźca warunkującego z późniejszym istotnym wzrostem, odzwierciedlonym za pomocą 95% przedziałów ufności. Przedstawiono poszczególne proporcjonalne ślady tętna (B, dół).

Rysunek 10. Średnia proporcjonalna zmiana tętna od 8 s przed do 8 s po rozpoczęciu prezentacji naprzemiennego bodźca akustycznego, łącząca dane z drugiej i trzeciej sesji warunkowania. Przedstawione dane obejmują siedem prób przeprowadzonych podczas dwóch sesji warunkowania: cztery w pierwszej sesji warunkowania i trzy w drugiej. W odpowiedzi na prezentację naprzemiennych bodźców wystąpił początkowo znaczny spadek tętna, po którym nastąpił późniejszy wzrost tętna.

Rycina 11. Średnia proporcjonalna zmiana częstotliwości akcji serca od 10 s przed do 10 s po rozpoczęciu prezentacji bodźca akustycznego po 30 s okresie ciszy. Dane z prób pobrano z pierwszej sesji testowej i obejmują sześć prezentacji bodźca akustycznego. Wyraźny wczesny spadek częstotliwości akcji serca stanowi dowód na rozróżnianie prezentowanych bodźców akustycznych.

Rysunek 12. Średnia proporcjonalna zmiana rytmu serca od 8 s przed do 8 s po rozpoczęciu naprzemiennej prezentacji bodźców akustycznych, pobrana z pierwszej sesji testowej i obejmująca pięć prezentacji bodźców akustycznych. Wyraźny wczesny spadek rytmu serca stanowi dowód na rozróżnianie prezentowanych bodźców akustycznych.

Rysunek 13. Średnia proporcjonalna zmiana rytmu serca od 10 s przed do 10 s po rozpoczęciu elektrycznej stymulacji mózgu po 30 s okresu ciszy. Dane z prób pobrano z pierwszej i drugiej sesji testowej i obejmują one 18 prezentacji stymulacji elektrycznej, przy zastosowaniu tych samych ustawień stymulacji. Brak wyraźnego spadku rytmu serca, szczególnie w pobliżu czasu 0, w którym rozpoczyna się stymulacja, sugeruje, że zwierzę nie jest w stanie wykryć bodźca.

Rysunek 14. Średnia proporcjonalna zmiana częstości uderzeń serca od 8 s przed do 8 s po rozpoczęciu prezentacji naprzemiennych bodźców elektrycznych (patrz 4.6.5 i 4.6.6), pobrana z pierwszej sesji testowej i obejmująca 33 prezentacje bodźców elektrycznych. W okolicach czasu 0 nie występuje stały wzorzec zmian częstości uderzeń serca, co sugeruje, że naprzemienne bodźce są niewystarczająco różne, aby doszło do ich rozróżnienia.

Rycina 15. Reprezentatywne przykłady poszczególnych śladów (A) oraz średnich danych proporcjonalnych tętna (B,C) od 8 s przed do 8 s po rozpoczęciu naprzemiennego podawania stymulacji elektrycznej, pobrane z siódmej sesji testowej drugiego zwierzęcia i obejmujące 12 prezentacji stymulacji elektrycznej. Znaczący spadek HR następuje szybko po wprowadzeniu drugiego bodźca nerwowego, po czym następuje znaczący wzrost tętna, co sugeruje, że zwierzę wykryło różnicę między pierwszym a drugim bodźcem. Stopień błędu i wariancja odpowiedzi są widoczne na wykresie proporcjonalnej średniej ± błędu standardowego (SE) przedstawionym w (B). Istotność spadku i wzrostu po prezentacji drugiego bodźca można zweryfikować za pomocą 95% przedziałów ufności zastosowanych do danych pokazanych w (C). Odpowiedź widoczna w (C) jest podobna do odpowiedzi przedstawionej na Rycina 9 B.

Dyskusja

Opisane tutaj techniki umożliwiają szybkie przeprowadzanie szeregu zadań dyskryminacyjnych przy krótkim czasie treningu i pozwalają na znaczną automatyzację, co minimalizuje czas badacza wymagany do przetwarzania danych. Wykorzystując dane uzyskane z wszczepionego EKG, można zautomatyzować obliczanie zmian częstości akcji serca (HR) w momentach prezentacji bodźca. Błędy w przetwarzaniu EKG (takie jak pominięcie pojedynczego uderzenia serca) można łatwo zidentyfikować, ponieważ powodują one sztucznie duże zmiany w pozornej częstości akcji serca przez bardzo krótki czas, a tak prosta detekcja błędów minimalizuje potrzebę czasochłonnego, ręcznego przeglądu danych.

Opisana technika implantacji urządzenia do telemetrii EKG pozwala na konsekwentne uzyskiwanie zapisów z niewielkimi zakłóceniami lub bez nich (patrz Ryciny 1 i 2). Niemniej jednak, stosunkowo niewielkie różnice w rozmieszczeniu elektrod w obszarze śródpiersia mogą prowadzić do wystąpienia zakłóceń pochodzących z pobliskich mięśni oraz specyficznego szumu związanego z oddychaniem. Weryfikacja prawidłowego rozmieszczenia elektrod podczas procesu implantacji, szczególnie po ich przyszyciu, umożliwia precyzyjną korektę ich ułożenia w celu zminimalizowania zakłóceń.

Proces implantacji do jądra ślimakowego mózgu jest trudny. Dzięki zastosowaniu seryjnych prezentacji szumu filtrowanego pasmowo w kilku zakresach częstotliwości, zamiast szumu szerokopasmowego stosowanego wcześniej³, odpowiedzi populacji komórek w miejscach umieszczenia elektrod można szybko zweryfikować pod kątem odpowiedzi częstotliwościowej, a nie mniej specyficznej odpowiedzi na szum. Zdolność do szybkiej identyfikacji momentu, w którym dostępny jest wystarczający zakres populacji komórek nastrojonych na konkretne częstotliwości, ma krytyczne znaczenie w badaniach nad dyskryminacją stymulacji elektrycznej. Jeśli nie uzyskano wystarczającego rozkładu częstotliwości, porównanie stymulacji odrębnych obszarów częstotliwościowych jest po prostu niemożliwe. Niemniej jednak, dłuższy proces mapowania odpowiedzi częstotliwość-amplituda pozostaje kluczowy dla uzyskania szczegółowych informacji na temat szerokości strojenia populacji komórek i powinien zostać przeprowadzony przed ostatecznym zamocowaniem elektrody.

W treningu i testach behawioralnych wprowadzenie okresu bezbodźcowego (lub ciszy) między próbami, przed wystąpieniem bodźca, pozwala na zbadanie reakcji na sam początek stymulacji. W przypadku zastosowania elektrycznej stymulacji neuronalnej, odpowiedź na początek bodźca stanowi dowód na prostą detekcję bodźca. Zatem, gdy nie występuje reakcja na początek bodźca, ale pojawia się odpowiedź po wprowadzeniu drugiego bodźca naprzemiennego, można wywnioskować, że wykrywalny jest jedynie ten drugi bodziec. Bez wprowadzenia takiego okresu ciszy nie byłoby możliwości ustalenia, że pierwszy bodziec nie został wykryty.

Ograniczeniem tej techniki testowania behawioralnego jest fakt, że brak wstrząsów łap podawanych po prezentacji stymulacji neuronalnej może prowadzić do wykształcenia specyficzności lęku uwarunkowanego, w taki sposób, że lęk przejawia się jedynie w momencie prezentacji bodźca akustycznego. Oznacza to, że zwierzę może nauczyć się, iż konkretne efekty sensoryczne stymulacji neuronalnej wiążą się z brakiem wstrząsu łapy. Z kolei podawanie wstrząsów łap po prezentacji stymulacji neuronalnej mogłoby prowadzić do uwarunkowanego lęku przed samym bodźcem neuronalnym, niezależnie od wszelkich właściwości dźwiękowych, jakie ten bodziec może posiadać. Wyniki uzyskane przy wykluczeniu wstrząsu łapy po stymulacji neuronalnej stanowią niewątpliwie silniejszy dowód na to, że bodziec neuronalny ma charakter dźwiękowy, niż wyniki uzyskane przy stosowaniu wstrząsu łapy po stymulacji neuronalnej, ponieważ w pierwszym przypadku lęk uwarunkowany uogólnił się z bodźca akustycznego na stymulację neuronalną. Niemniej jednak istnieje ryzyko wykształcenia specyficzności względem stymulacji akustycznej, a nie neuronalnej. Zastosowanie szumu filtrowanego pasmowo jako bodźca akustycznego zamiast czystych tonów impulsowych, co może lepiej odzwierciedlać doświadczenie percepcyjne stymulacji neuronalnej, mogłoby zmniejszyć ryzyko wystąpienia takiej specyficzności. Taka procedura wprowadza jednak dodatkową zmienną w postaci szerokości pasma filtra, co wpłynie na zadania dyskryminacyjne.

Dodatkowym ograniczeniem związanym z każdą przewlekłą implantacją neuronalną, taką jak ta wymagana do testów behawioralnych, jest zmiana funkcji elektrody lub powiązanej tkanki neuronalnej w czasie. Stymulacja tkanki neuronalnej może prowadzić zarówno do tymczasowego zahamowania aktywności neuronalnej¹³, jak i do zmian w tkance, takich jak utrata komórek¹⁴ oraz bezpośredniej reakcji tkanki mózgowej na elektrodę.¹⁵

Opisane podejście do implantacji i testów behawioralnych umożliwia badanie zarówno detekcji, jak i dyskryminacji bodźców akustycznych i elektrycznych przy krótkim treningu, a także pozwala na kontrolowanie częstotliwości prób. Technika wykorzystania zmiany HR jako miary uwarunkowanego lęku może mieć zastosowanie nie tylko w testach słuchowych, ale ogólniej w każdym badaniu sensorycznym, w którym bodźce mogą być prezentowane przez określony czas i w którym pożądanym jest wykrycie dyskryminacji sensorycznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PowerLab	ADInstruments	ML880	Rejestruje dane otrzymane z wszczepionego nadajnika TR40
Karta sterująca SmartCtrl	Med Associates, Inc.	DIG-716B	Steruje komorą testową behawioralną, w tym wstrząsami stóp
Modularna komora testowa behawioralna	Med Associates, Inc.	ENV-009	Rozmiar komory testowej: 30.5cm x 39.4cm
Generator bodźców awersyjnych	Med Associates, Inc.	ENV-410B	Podaje awersyjny wstrząs stóp do metalowej kratki podłogi klatki poprzez jednostkę Solid State Scrambler
Programowalny atenuator	TDT	PA5	Kontroluje amplitudę podawanego sygnału akustycznego w celu zapewnienia stabilnej amplitudy w różnych częstotliwościach
Sterownik głośnika elektrostatycznego	TDT	ED1	Steruje głośnikami elektrostatycznymi (EC1, ES1)
Głośnik elektrostatyczny pola swobodnego	TDT	ES1	Dźwięki są prezentowane za pomocą tego głośnika w komorze testowej behawioralnej
Sprzężony głośnik elektrostatyczny	TDT	EC1	Dźwięki są prezentowane za pomocą tego głośnika podczas operacji wszczepienia implantu neuronalnego
Stacja bazowa stymulatora	TDT	RX7	Steruje podawaniem elektrycznej stymulacji neuronalnej (stosowana z MS16)
Mikrostymulator	TDT	MS16	Podaje wielokanałową elektryczną stymulację neuronalną
Stacja bazowa przetwarzania	TDT	RZ2	Rejestruje aktywność neuronalną podczas implantacji do mózgu (przy użyciu przedwzmacniacza PZ2)
Przedwzmacniacz	TDT	PZ2-256	256-kanałowy przedwzmacniacz o wysokiej impedancji
Odbiornik urządzenia telemetrycznego	Telemetry Research	TR162	Odbiera sygnał cyfrowy z TR40 i konwertuje go na wzmocnione wyjście analogowe
Wszczepialne telemetryczne urządzenie do elektrokardiogramu	Telemetry Research	TR40	Wszczepione urządzenie nadawcze, próbkowanie przy 2kHz
Procesor wielofunkcyjny	Tucker-Davis Technologies	RX6	Służy do generowania bodźców akustycznych
Vertex Castavaria	Vertex Dental		Akryl dentystyczny używany do stabilizacji elektrody
Klej Kwik-Sil, niska lepkość	World Precision Instruments, Inc.		Elastomer silikonowy używany do powlekania trzpieni elektrody
Elektroda wielokanałowa	NeuroNexus Technologies	a2x16-10mm 100-500-413	2-trzpieniowy 32-kanałowy macierzowy zestaw elektrod zewnątrzkomórkowych używany do implantacji. Miejsca kontaktu elektrody zostały aktywowane w celu wytworzenia powłoki z tlenku irydu w przygotowaniu do stymulacji.