Behawioralne określanie par bodźców, dyskryminacja bodźców słuchowych, akustycznych i elektrycznych przy użyciu klasycznego podejścia warunkowania i tętna

Summary

Opisano zastosowanie klasycznego paradygmatu behawioralnego warunkującego strach do badań protetycznych słuchu u szczurów. Paradygmat ten zapewnia mechanizm identyfikacji zarówno wykrywania, jak i rozróżniania różnych bodźców akustycznych i elektrycznych przy użyciu tętna jako miary wyniku.

Abstract

Preparaty dla zwierząt ostre były używane w badaniach prospektywnie badających projekty elektrod i techniki stymulacji do integracji z neuronalnymi protezami słuchowymi, takimi jak implanty słuchowe^{pnia mózgu 1-3} i implanty słuchowe śródmózgowia^4,5. Podczas gdy wnikliwe eksperymenty mogą dać wstępny wgląd w skuteczność implantu, badanie zwierząt przewlekle wszczepionych i przytomnych zapewnia przewagę w postaci zbadania właściwości psychofizycznych doznań wywołanych za pomocą wszczepionych urządzeń^6,7.

Kilka technik, takich jak warunkowanie instrumentalne oparte na nagrodzie^6-8, warunkowe unikanie^9-11, czy klasyczne warunkowanie strachu¹², zostało użytych, aby zapewnić behawioralne potwierdzenie wykrycia istotnego atrybutu bodźca. Wybór techniki wymaga zrównoważenia takich aspektów, jak efektywność czasowa (często słaba w podejściach opartych na nagrodzie), zdolność do jednoczesnego testowania wielu atrybutów bodźca (ograniczona w warunkowym unikaniu) oraz pomiar wiarygodności powtarzających się bodźców (potencjalne ograniczenie, gdy stosowane są miary fizjologiczne).

Tutaj prezentowana jest klasyczna metoda behawioralna warunkowania strachu, która może być używana do jednoczesnego testowania zarówno wykrywania bodźca, jak i rozróżniania między dwoma bodźcami. Tętno jest używane jako miara reakcji na strach, co zmniejsza lub eliminuje konieczność czasochłonnego kodowania wideo dla zachowania podczas zamrożenia lub innych podobnych środków (chociaż takie pomiary mogą być włączone w celu uzyskania zbieżnych dowodów). Zwierzęta były kondycjonowane przy użyciu tych technik w trzech dwugodzinnych sesjach warunkowania, z których każda dostarczyła 48 prób bodźców. Kolejne 48-próbne sesje testowe wykorzystano następnie do sprawdzenia wykrywania każdego bodźca w prezentowanych parach oraz przetestowania dyskryminacji między bodźcami członkowskimi każdej pary.

Ta metoda behawioralna jest przedstawiona w kontekście jej wykorzystania w badaniach protetycznych słuchu. Pokazano implantację urządzeń telemetrycznych do elektrokardiogramu. Pokazano również późniejsze wszczepienie elektrod mózgowych do jądra ślimakowego, prowadzone przez monitorowanie reakcji neuronalnych na bodźce akustyczne, oraz utrwalenie elektrody na miejscu w przypadku przewlekłego użytkowania.

Protocol

1. Implantacja urządzenia do telemetrii elektrokardiogramu

1. Na godzinę przed rozpoczęciem zabiegu implantacji należy podać karprofen (4 mg/kg s.c.) w celu zapewnienia znieczulenia pooperacyjnego.
2. Wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę (Ke: 70 mg/kg, Xy: 10 mg/kg, i.p.) do znieczulenia, aby umożliwić wstępne przygotowanie zwierzęcia, w tym golenie i zakładanie wkładek usznych, przed zmianą na znieczulenie izofluranem, który jest bardziej stabilny podczas operacji, umożliwiając lepszą regulację głębokości i skraca powrót do zdrowia po operacji po znieczuleniu.
3. Po rozpoczęciu znieczulenia nałóż lubrykant do oczu zwierzęcia, a następnie ogol brzuch, klatkę piersiową i gardło. Przetrzyj odsłoniętą skórę za pomocą peelingu chirurgicznego, następnie preparatu alkoholowego do skóry, a następnie roztworu antyseptycznego. Umieść klatkę domową na kocu grzewczym, aby się ogrzała.
4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na płytce homeotermicznej. Włóż watę pod szyję, aby podnieść i odsłonić gardło.
5. Umieścić stożek nosowy (dostarczający 1-3% obj. izofluranu w tlenie, 2 l na minutę) nad nosem zwierzęcia i zamocować stożek na miejscu.
6. Ułóż kończyny przednie w pozycji półprostnej, aby wytworzyć napięcie skóry nad klatką piersiową i gardłem oraz zapobiec wyślizgiwaniu się nosa ze stożka nosowego.
7. Włóż sondę koca homeotermicznego do odbytnicy zwierzęcia.
8. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry rozciągające się od wyrostka mieczykowatego 20 mm doogonowo, aby odsłonić warstwę mięśniową. Wykonaj pasujące nacięcie wzdłuż kresy białej, a następnie jamy otrzewnej.
9. Wprowadzić urządzenie telemetryczne EKG do jamy otrzewnej z przewodami wychodzącymi z rostralnego końca otworu i zszyć ogon 15 mm otworu w otrzewnej.
10. Wykonaj nacięcie w linii środkowej gardła nad tchawicą, odsłaniając mięsień mostkowo-gnykowy.
11. Włóż kleszczyki do uszu aligatora w przestrzeń podskórną nacięcia rostralnego skierowaną doogonowo i użyj ich do utworzenia podskórnego tunelu od nacięcia rostralnego do ogonowego. Chwyć dodatni (czerwony) przewód w kleszczach i wsuń przewód przez tunel.
12. Podnieś mięsień mostkowo-gnykowy za pomocą kleszczy i włóż końcówkę dodatniego przewodu grzbietowo w kierunku prawego przedniego śródpiersia, pozostawiając około 1 mm pętlę rostralnego do wprowadzenia. Zszyj przewód w miejscu, w którym rozciąga się od jamy piersiowej i w górnej części pętli do leżącego poniżej mięśnia.
13. Odsłoń grzbietową ścianę mieczykowatej i zszyj końcówkę negatywu ołowiu odsłoniętej powierzchni.
14. Sprawdź sygnał wszczepionego urządzenia, aby upewnić się, że można uzyskać odpowiednie EKG.
15. Nadmiar wprowadzić do jamy otrzewnej. Szew zamykał ścianę otrzewnej, kreskę białą i skórę brzucha.
16. Szew zamykał skórę gardła.
17. Należy przerwać podawanie izofluranu i kontynuować podawanie tlenu do momentu zaobserwowania spontanicznych ruchów.
18. Kiedy zaobserwujesz ruch, uwolnij przednie kończyny i wróć do klatki domowej. Przesuń klatkę domową tak, aby około połowa klatki znajdowała się na poduszce grzewczej. Umożliwi to zwierzęciu, gdy jest mobilne, przemieszczanie się między cieplejszymi i chłodniejszymi obszarami klatki. Monitoruj zwierzę do czasu rozpoczęcia chodzenia i pozostaw klatkę domową na kocu grzewczym na 24 godziny.
19. Karprofen (4 mg/kg mc. pół) należy podawać co 24 godziny przez 3-5 dni.

2. Implant elektrody mózgowej

1. Na godzinę przed rozpoczęciem implantacji należy podać karprofen (4 mg/kg s.c.) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
2. Wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę (Ke: 70 mg/kg, Xy: 10 mg/kg, i.p.) do znieczulenia.
3. Po rozpoczęciu znieczulenia nałóż maść do oczu, aby chronić oczy, a następnie ogol głowę zwierzęcia. Przetrzyj odsłoniętą skórę peelingiem betadyny, następnie alkoholem, a następnie betadyną.
4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na płytce homeotermicznej.
5. Umieść jedną wydrążoną listwę uszną w przybliżeniu w oczekiwanej pozycji końcowej, a następnie podnieś i ustaw zwierzę tak, aby wkładka słuchowa znajdowała się w zewnętrznym przewodzie akustycznym.
6. Wsuń drugą pustą wkładkę słuchową do przeciwległego zewnętrznego przewodu akustycznego.
7. Za pomocą kleszczy do zębów szczura otwórz szczękę zwierzęcia i zaczep górne siekacze o uchwyt zęba.
8. Nasunąć stożek nosowy na nos i rozpocząć podawanie izofluranu (1-3% obj. / obj. tlenu). Zwierzęta są obecnie utrzymywane przez cały okres operacji w tym znieczuleniu.
9. Wykonaj nacięcie w skórze głowy, około 1 mm na lewo od linii środkowej i rozciągające się od 3-4 mm rostral do 2-3 mm ogona lambdy.
10. Wycofaj skórę i mięsień bocznie z nacięcia, odsłaniając kość ciemieniową i kość międzyciemieniową. Wyszoruj powierzchnię odsłoniętej kości za pomocą 20% roztworu nadtlenku wodoru i gaziku.
11. Wywierć mały otwór w lewej i prawej kości ciemieniowej i wkręć ze stali chirurgicznej w każdy otwór, pozostawiając niewielką (0,5 mm) przestrzeń między każdej a umiejętnością. Podłącz te do masy i punktów elektrod odniesienia stopnia czołowego o wysokiej impedancji.
12. Wywierć otwór o boku około 2 mm kwadratowych w najbardziej bocznym rozciągłości kości międzywęzłowej. Przepłucz otwór sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć kurz kostny lub fragmenty kości, które mogą uszkodzić elektrodę.
13. Przymocuj głośnik sprzęgający do lewego pustego paska na ucho.
14. Za pomocą końcówki igły wykonaj nacięcie opony twardej w płaszczyźnie strzałkowej.
15. Ustawić manipulator elektrod na miejscu nad otworem, pod kątem ogoniastym 10 °. Wprowadzić elektrodę ręcznie na około 2 mm w powierzchnię mózgu. Upewnij się, że amplifier jest włączony, a następnie uszczelnij komorę nagrywania.
16. Rozpocznij cykliczne dostarczanie szumów pasmowo-przepustowych o niskiej (2-8 kHz), średniej częstotliwości (16-24 kHz) i wysokiej (32 kHz-44 kHz). Maksymalna szybkość, z jaką powinny być dostarczane serie, to jedna seria co 200 ms. Monitoruj aktywność neuronalną na każdym kanale, aby wykryć reakcje na prezentację hałasu.
17. Kontynuuj wkładanie elektrody, aż całkowita włożona odległość zbliży się do 8 mm. Jeśli granica 8 mm zostanie osiągnięta bez wykrycia odpowiedzi neuronalnych, należy wycofać elektrodę i zmienić jej położenie w celu ponownego wprowadzenia. Jeśli udało się dotrzeć do jądra ślimakowego (CN), miejsca na końcu elektrody powinny wykazywać przede wszystkim reakcje na bodźce o wysokiej częstotliwości. Jeśli elektrody znajdują się w brzusznym jądrze ślimakowym (VCN), reakcje na bodziec akustyczny powinny mieć silny początek (1-5 ms), po którym następuje szybki spadek aktywności.
18. Kontynuuj wkładanie elektrody, aż końcówki elektrody wykryją reakcje na bodźce o niskiej częstotliwości lub aktywność słuchowa przestanie występować (w takim przypadku elektroda mogła przejść całkowicie przez CN i może być konieczna zmiana umieszczenia elektrody).
19. Skonstruuj mapę odpowiedzi częstotliwościowo-amplitudowej neuronów w miejscach elektrod. Osiąga się to poprzez prezentowanie dźwięku w pożądanym zakresie częstotliwości (zwykle 1-44 kHz lub 1-80 kHz) o amplitudach 1-70 dB, przy 10 powtórzeniach każdego bodźca. Jeden bodziec może być dostarczany co 300 ms podczas mapowania CN. Jeśli mapa jest nieodpowiednia, rozważ zmianę położenia elektrody.
20. Nałóż cienką warstwę elastomeru krzemowego nieco powyżej odsłoniętych trzonków elektrod, tak aby elastomer spłynął po trzonach i pokrył zarówno trzonki, jak i odsłoniętą powierzchnię mózgu.
21. Nałożyć pierwszą warstwę polimeru cementowego do protez zębowych wokół elektrody. Cement powinien mieć minimalną lepkość, aby zmniejszyć ryzyko przemieszczenia się elektrody w procesie aplikacji. Upewnij się, że polimer nie zakrywa w kościach ciemieniowych ani dołączonych. Poczekaj, aż akryl stwardnieje, co zwykle zajmuje 5-10 minut.
22. Odłącz przewody uziemiające i odniesienia stopnia czołowego od w kościach ciemieniowych. Za pomocą kleszczy delikatnie owiń przewód uziemiający elektrody wokół w lewej kości ciemieniowej.
23. Nałożyć drugą warstwę polimeru cementowego do protez. Ta druga warstwa powinna otaczać obie i przepływać do przestrzeni między a czaszką. W ten sposób przytrzymają akryl i elektrodę do czaszki. Poczekaj, aż akryl stwardnieje.
24. Zdejmij stopień czołowy ze złącza elektrody.
25. Za pomocą kleszczyków do zębów szczurów unieś skórę bocznie do polimeru nad polimerem i użyj szwu ze sznurka do torebki, aby zamknąć skórę wokół odsłoniętego łącznika elektrody.
26. Zdejmij nauszniki, zwalniając głowę.
27. Zakończyć podawanie izofluranu i kontynuować dostarczanie tlenu przez stożek nosowy, aż do zaobserwowania spontanicznego ruchu.
28. Zwróć zwierzę do klatki domowej. Przesuń klatkę domową tak, aby około połowa klatki znajdowała się na poduszce grzewczej. Umożliwi to zwierzęciu, gdy jest mobilne, przemieszczanie się między cieplejszymi i chłodniejszymi obszarami klatki.
29. Monitoruj zwierzę do czasu rozpoczęcia chodzenia. Pozostaw klatkę domową na poduszce grzewczej na 24 godziny.
30. Karprofen (4 mg/kg mc. pół) należy podawać co 24 godziny przez 3-5 dni.

3. Kondycjonowanie

1. Umieść zwierzę w komorze testowej.
2. Aktywuj urządzenie telemetryczne EKG.
3. Pozwolić zwierzęciu zaaklimatyzować się w komorze badawczej przez pięć minut przed rozpoczęciem kondycjonowania. Umożliwi to powrót tętna do wartości wyjściowej, ponieważ obsługa prowadzi do podniesienia tętna.
4. Wykonaj procedurę kondycjonowania:
   1. Dostarczaj jeden losowo wybrany element pary bodźców akustycznych wielokrotnie w seriach 250 ms, oddzielonych 250 ms ciszy przez 80-170 s. Każda prezentacja bodźca musi mieć czas narastania i opadania wynoszący 10 ms, aby uniknąć postrzegania "kliknięcia", które percepcyjnie obejmuje zakres częstotliwości dźwięku.
   2. Rozpocznij naprzemiennie drugi element pary bodźców akustycznych z pierwszym, prezentując każdy dźwięk przez 250 ms, a następnie przez 250 ms ciszy.
   3. Po 9,5 s z 10-sekundowego okresu naprzemiennego tonu należy zastosować wstrząs stopowy o sile 0,5 ms (0,7 mA).
   4. Przerwij prezentacje tonalne na 30 sekund, aby umożliwić ustabilizowanie się tętna.
   5. Wznowienie dostarczania par tonów (od 3.4.1). Pary tonów powinny być optymalnie przedstawione w losowej kolejności i należy użyć co najmniej 12 par tonów, aby zapewnić, że kondycjonowanie uogólnia się na wszystkie pary częstotliwości i nie jest specyficzne dla używanych częstotliwości tonów. Kontynuuj ten proces aż do zakończenia 48 cykli procedury (prób).
5. Wyłącz urządzenie EKG i wróć zwierzę do klatki domowej.

4. Testowanie

1. Znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu (1-3% obj. / obj. tlenu).
2. Podłącz do stymulacji neuronowej do odsłoniętego złącza elektrody.
3. Umieść zwierzę w komorze testowej.
4. Aktywuj urządzenie telemetryczne EKG.
5. Pozwolić zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu izofluranem i zaaklimatyzować się w komorze badawczej na dziesięć minut przed rozpoczęciem badania. Pozwoli to na powrót tętna do wartości wyjściowej i powrót do zdrowia po krótkim efekcie znieczulenia.
6. Wykonaj procedurę testowania.
   1. Dostarczaj jeden losowo wybrany element pary bodźców akustycznych wielokrotnie w seriach 250 ms, oddzielonych 250 ms ciszy przez 80-170 s. Każda prezentacja bodźca musi mieć czas narastania i opadania wynoszący 10 ms, aby uniknąć postrzegania "kliknięcia", które percepcyjnie obejmuje zakres częstotliwości dźwięku.
   2. Rozpocznij naprzemiennie drugi element pary bodźców akustycznych z pierwszym, prezentując każdy dźwięk przez 250 ms, a następnie przez 250 ms ciszy.
   3. Po 9,5 s z 10-sekundowego okresu naprzemiennego tonu należy zastosować wstrząs stopą o długości 0,5 ms.
   4. Przerwij prezentacje tonalne na 30 sekund, aby umożliwić ustabilizowanie się tętna.
   5. Rozpocznij dostarczanie jednego losowo wybranego członka pary elektrycznej stymulacji mózgu wielokrotnie, używając 250 ms okresów stymulacji oddzielonych 250 ms bez stymulacji przez 80-170 s.
   6. Rozpocznij naprzemiennie drugi element pary bodźców z pierwszym, prezentując każdy bodziec przez 250 ms, po którym następuje 250-milimetrowy okres bez stymulacji. Kontynuuj naprzemienną stymulację przez 10 sekund.
   7. Przerwij prezentację bodźca na 30 sekund, aby umożliwić ustabilizowanie się tętna.
   8. Wznowić dostarczanie par bodźców (od 4.6.5 lub 4.6.1). Pary bodźców powinny być prezentowane w losowej kolejności i należy przeprowadzić co najmniej 20 prób każdej pary bodźców, aby zapewnić zebranie wystarczających danych dotyczących częstości akcji serca, aby zapewnić jasny średni wynik i zminimalizować zmienność. Dystrybucja prób z wykorzystaniem bodźców akustycznych przez całą sesję testową zmniejsza prawdopodobieństwo, że wygaśnięcie nastąpi podczas zabiegu.
7. Odłącz do stymulacji od zwierzęcia.
8. Wyłącz urządzenie EKG.
9. Zwróć zwierzę do klatki domowej.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykładowy zapis EKG wykonany za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego tydzień po implantacji jest pokazany na rysunku 1. Takie zapis można zazwyczaj uzyskać z wszczepionych urządzeń, a urządzenia nadal działają odpowiednio do nagrywania przez ponad sześć miesięcy, nawet jeśli do przymocowania do mięśni stosuje się rozpuszczalny szew. Zapis EKG pokazany na rycinie 2 został uzyskany od zwierzęcia w ciągu ośmiu miesięcy po implantacji.

Rysunki 3 pokazują miejsce udanej implantacji. Umieszczenie elektrody ma wiele miejsc elektrod w tylno-brzusznym jądrze ślimaka (PVCN), zapewniając stymulację i rejestrując dostęp do dużej części grzbietowo-brzusznej. Odpowiedzi częstotliwościowe każdego miejsca elektrody dla tej implantacji przedstawiono na rysunku 4. Długi obszar PVCN, w którym rozmieszczone są elektrody, prowadzi do tego, że populacje komórek są dostępne do rejestracji i stymulacji "dostrojone" do szerokiego zakresu częstotliwości. Co więcej, same populacje są wąsko dostrojone - reagują tylko na wąskie pasmo częstotliwości dźwięku (patrz rysunek 5).

Dla kontrastu, na rysunku 6 pokazano słabe umiejscowienie. W tym przypadku elektroda została umieszczona zbyt przyśrodkowo i nie została włożona wystarczająco głęboko, aby wniknąć w PVCN. W związku z tym tylko miejsca elektrod w pobliżu końcówki wykazują reakcje na dźwięk, jak pokazano na rysunku 7. Ponadto zakres częstotliwości, do których dostrojone są dostępne populacje komórek, jest bardzo ograniczony. Dostrojenie samych populacji jest wąskie (patrz Ryc. 8), ale grupowany rozkład centralnych częstotliwości populacji komórek uniemożliwia stymulację odrębnych obszarów częstotliwości.

Podstawowe dane dotyczące tętna różniły się między prezentacjami warunkowych bodźców akustycznych. Aby uwzględnić tę zmienność, surowe dane dotyczące częstości akcji serca (HR) znormalizowano jako odsetek tętna obserwowanego w momencie rozpoczęcia zmiany bodźca (czas 0). Rysunek 9 przedstawia dane w różnych formach zebrane podczas pierwszej sesji kondycjonowania. Przykład wyników HR uzyskanych u innego zwierzęcia podczas drugiej części początkowych sesji kondycjonowania przedstawiono na rycinie 10. Proces warunkowania bodźców akustycznych jest szybki, a silne zmiany w HR można zaobserwować za pomocą kilku prób; 7 w przypadku rysunków 9 i 10. Zmiana tętna zaobserwowana bezpośrednio po rozpoczęciu przemiany bodźca (patrz 3.4.1 i 3.4.2) dostarcza dowodów na to, że zwierzę jest w stanie odróżnić początkowy powtarzający się bodziec od drugiego bodźca dodanego później.

Po rozpoczęciu sesji testowych, w których zazwyczaj dostarczane są bodźce elektryczne, a nie akustyczne, włączenie prezentacji bodźców akustycznych pozwala na potwierdzenie, że efekty warunkowania są nadal obecne. Ogólna zmiana tętna w odpowiedzi na rozpoczęcie prezentacji bodźca akustycznego potwierdza, że warunkowy wpływ na bodźce akustyczne pozostaje obecny, jak pokazano na rycinie 11. Podobnie, rysunek 12 przedstawia średnią proporcjonalną zmianę tętna wokół początku zmiany tonów akustycznych w pierwszej sesji testowej. Podobnie jak w przypadku wykresów 9 i 10, względnie stabilny wskaźnik tętna przed wprowadzeniem drugiego bodźca, w przeciwieństwie do gwałtownej zmiany tętna po wprowadzeniu drugiego bodźca, stanowi dowód na to, że nastąpiła dyskryminacja między tymi dwoma tonami.

Dla kontrastu, brak detekcji można zaobserwować na rysunku 13, na którym rozpoczyna się stymulacja elektryczna. Średnia proporcjonalna zmiana tętna w 10 badaniach nie wskazuje na stały szybki spadek obserwowany po wykryciu, jak pokazano na rycinie 11. Podobnie, brak spójnej i szybkiej zmiany częstości akcji serca na rycinie 14 sugeruje, że dwa dostarczane bodźce elektryczne nie różnią się wystarczająco różne, aby mogła wystąpić dyskryminacja. Zarówno przed rozpoczęciem okresu przemiennego (przed czasem 0), jak i po rozpoczęciu zmiany, średnia proporcjonalna zmiana HR pozostaje bliska linii braku zmian.

Wzorzec bardziej charakterystyczny dla dyskryminacji między dwoma elementami pary bodźców nerwowych jest pokazany na rysunku 15. Spadek częstości akcji serca następuje szybko po rozpoczęciu przemiany bodźców, po którym następuje znaczny wzrost częstości akcji serca. Konkretna strategia stymulacji zastosowana w tym przypadku okazała się skuteczna w wywołaniu behawioralnie istotnej reakcji.

Rysunek 1. Zapis EKG uzyskany za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego tydzień po implantacji. Sygnał widoczny w tym nagraniu jest w dużej mierze typowy dla nagrań uzyskanych za pomocą tych urządzeń.

Rysunek 2. Zapis EKG uzyskany za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego sześć miesięcy po implantacji. W tym okresie występuje znikoma degradacja sygnału rejestrowanego w tym okresie, a sygnał ten jest z pewnością wystarczający do obliczenia tętna zwierzęcia.

Rysunek 3. Rekonstrukcja 3D udanego umieszczenia elektrody przy użyciu połączonej rentgenowskiej tomografii komputerowej i sekcji histologicznych. Oba trzonki elektrod penetrowały tylno-brzuszne jądro ślimaka z elektrodami skierowanymi w stronę struktury.

Rysunek 4. Mapa reakcji elektrofizjologicznych zarejestrowanych wraz z umieszczeniem elektrod na rysunku 3. Każdy histogram przedstawia dane dotyczące aktywności w jednym miejscu elektrody w odpowiedzi na prezentację jednej częstotliwości akustycznej; Każda kolumna reprezentuje okres 25 ms. Na obu trzonach układu elektrod odpowiedzi są wykrywane w każdym pojedynczym miejscu elektrody tylko w odpowiedzi na dość wąskie pasmo częstotliwości, ale te wąskie pasma są rozmieszczone w szerokim zakresie częstotliwości. Taki rozkład jest idealny, ponieważ wiele odrębnych obszarów mózgu związanych z częstotliwością może być stymulowanych niezależnie.

Rysunek 5. Odpowiedź elektrofizjologiczna w kanale 10 z implantu przedstawionego na rysunkach 3 i 4. Idealnie byłoby, gdyby rozmieszczenie elektrod prowadziło do wykrywania odpowiedzi neuronalnych na bodziec akustyczny na kilku kanałach o amplitudzie dźwięku tak niskiej jak 10 dB, jak pokazano w tym przykładzie.

Rysunek 6. Rekonstrukcja 3D złego umieszczenia elektrody. Chociaż kąt ogoniasty elektrody był prawidłowy, był zbyt środkowy. Co więcej, elektroda nie została wprowadzona wystarczająco głęboko, co spowodowało, że miejsca znajdujące się najbliżej końcówki elektrody znajdowały się w grzbietowym jądrze ślimaka.

Rysunek 7. Mapa reakcji elektrofizjologicznych zarejestrowanych wraz z umieszczeniem elektrody, jak pokazano na rysunku 6. Aktywność zachodzi na końcach każdego trzpienia układu elektrod, ale występuje niewielka różnica w częstotliwości bodźców akustycznych, które wywołują aktywność w każdym miejscu elektrody. Taka implantacja nie umożliwia stymulacji odrębnej warstwy częstotliwości do testów dyskryminacyjnych.

Rysunek 8. Odpowiedź elektrofizjologiczna w kanale 28 w miejscu elektrody pokazanym na rysunkach 6 i 7. Bodziec akustyczny wytwarza silne wybuchy aktywności, podobne pod względem częstotliwości skoków do tej obserwowanej w bardzo udanej implantacji (ryc. 3). Próg jest również dość niski, a odpowiedzi są wykrywane w odpowiedzi na tony na poziomie 20 dB. Gdyby istniała większa zmienność częstotliwości, na które wystąpiły najsilniejsze reakcje, w innych kanałach matrycy, ten kanał z pewnością byłby odpowiedni do stymulacji.

Rysunek 9. Porównanie surowego tętna (A) i średniej proporcjonalnej (B) danych zebranych podczas pierwszej sesji kondycjonowania u jednego zwierzęcia. Pokazane są odpowiedzi z 7 prezentacji. Ze względu na zmienność początkowego tętna przed rozpoczęciem zmiany tonu, średnie surowe tętno (±95% przedziałów ufności) nie pokazuje odpowiednio stopnia zmiany początkowego spadku częstości akcji serca, po którym następuje wzrost, jak wskazano w poszczególnych surowych śladach (A, dół). Średnia proporcjonalna zmiana w danych dotyczących częstości akcji serca, w której tętno jest podzielone przez tętno w momencie prezentacji warunkowego bodźca akustycznego dla każdego śladu, przedstawiono w (B). Pokazuje to statystycznie istotny spadek po prezentacji bodźca warunkowego z późnym znaczącym wzrostem odzwierciedlonym za pomocą 95% przedziałów ufności. Pokazane są indywidualne proporcjonalne przebiegi tętna (B, na dole).

Rysunek 10. Średnia proporcjonalna zmiana tętna od 8 s przed 8 s do 8 s po rozpoczęciu naprzemiennej prezentacji bodźca akustycznego, łącząca dane z drugiej i trzeciej sesji kondycjonowania. Przedstawione dane obejmują siedem badań zaprezentowanych podczas dwóch sesji kondycjonowania, czterech w pierwszej sesji kondycjonowania i trzech w drugiej. W odpowiedzi na naprzemienne prezentowanie bodźca nastąpił duży początkowy spadek częstości akcji serca, po którym nastąpił późny wzrost częstości akcji serca.

Rysunek 11. Średnia proporcjonalna zmiana częstości akcji serca z 10 s przed 10 s po rozpoczęciu prezentacji bodźca akustycznego po 30-sekundowym okresie ciszy. Dane z badania pochodzą z pierwszej sesji testowej i obejmują sześć prezentacji bodźców akustycznych. Wyraźny wczesny spadek częstości akcji serca świadczy o dyskryminacji między prezentowanymi bodźcami akustycznymi.

Rysunek 12. Średnia proporcjonalna zmiana częstości akcji serca z 8 s przed 8 s do 8 s po rozpoczęciu naprzemiennej prezentacji bodźca akustycznego, pobrana z pierwszej sesji badawczej i obejmująca pięć prezentacji bodźców akustycznych. Wyraźny wczesny spadek częstości akcji serca świadczy o dyskryminacji między prezentowanymi bodźcami akustycznymi.

Rysunek 13. Średnia proporcjonalna zmiana tętna z 10 s przed 10 s po rozpoczęciu elektrycznej stymulacji mózgu po 30-sekundowym okresie ciszy. Dane próbne zostały pobrane z pierwszej i drugiej sesji testowej i obejmują 18 prezentacji stymulacji elektrycznej, wszystkie przy użyciu tych samych ustawień stymulacji. Brak jakiegokolwiek szczególnego spadku częstości akcji serca, szczególnie proksymalnego do czasu 0, w którym rozpoczyna się stymulacja, sugeruje, że zwierzę nie jest w stanie wykryć bodźca.

Rysunek 14. Średnia proporcjonalna zmiana częstości akcji serca z 8 s przed 8 s po rozpoczęciu naprzemiennej prezentacji bodźca elektrycznego (patrz 4.6.5 i 4.6.6), uzyskana z pierwszej sesji badawczej i obejmująca 33 prezentacje bodźców elektrycznych. W pobliżu godziny 0 nie występuje żaden spójny wzorzec zmian częstości akcji serca, co sugeruje, że naprzemienne bodźce nie różnią się wystarczająco mocno, aby mogła wystąpić dyskryminacja.

Rysunek 15. Reprezentatywne przykłady indywidualnych przebiegów (A) i danych dotyczących średniej proporcjonalności tętna (B,C) od 8 s przed 8 s po rozpoczęciu naprzemiennej prezentacji bodźca elektrycznego, pobrane z siódmej sesji badawczej drugiego zwierzęcia, w tym 12 prezentacji bodźców elektrycznych. Znaczny spadek tętna następuje szybko po wprowadzeniu drugiego bodźca nerwowego, po którym następuje znaczny wzrost częstości akcji serca, co sugeruje, że różnica między pierwszym a drugim bodźcem została wykryta przez zwierzę. Stopień błędu i wariancji odpowiedzi można zobaczyć na wykresie średniej proporcjonalnej ± błędu standardowego (SE) pokazanym na rysunku (B). Znaczenie spadku i wzrostu po prezentacji drugiego bodźca można zweryfikować za pomocą 95% przedziałów ufności zastosowanych do danych pokazanych w (C). Odpowiedź zaobserwowana w (C) jest podobna do odpowiedzi, która jest widoczna na rysunku 9 B.

Discussion

Opisane tutaj techniki umożliwiają szybkie testowanie szeregu zadań związanych z dyskryminacją, przy krótkim czasie szkolenia i pozwalają na znaczną automatyzację, minimalizując w ten sposób czas potrzebny badaczom na przetwarzanie danych. Korzystając z danych uzyskanych z wszczepionego EKG, można zautomatyzować obliczanie zmiany tętna (HR) w momencie prezentacji bodźca. Błędy w przetwarzaniu EKG (takie jak brak pojedynczego uderzenia serca) można łatwo zidentyfikować, ponieważ powodują one zaskakująco duże zmiany w pozornym tętnie przez bardzo krótki czas, a takie łatwe wykrywanie błędów minimalizuje konieczność czasochłonnego ręcznego przeglądania danych.

Technika opisana dla implantacji urządzenia telemetrycznego EKG konsekwentnie tworzy zapisy z niewielkimi lub żadnymi zakłóceniami (patrz ryc. 1 i 2). Jednak stosunkowo niewielkie różnice w umieszczeniu elektrody w okolicy śródpiersia mogą prowadzić do zakłóceń ze strony pobliskich mięśni i szczególnego hałasu związanego z oddychaniem. Weryfikacja prawidłowego ułożenia elektrod podczas procesu implantacji, szczególnie po zszyciu elektrod, pozwala na precyzyjną regulację ułożenia elektrod w celu zminimalizowania zakłóceń.

Proces implantacji mózgu do jądra ślimaka jest trudny. Wykorzystując szeregowe prezentacje szumu filtrowanego pasmowo-przepustowego w kilku zakresach częstotliwości, a nie szumu szerokopasmowego, jak to było wcześniej stosowane³, odpowiedzi populacji komórek w miejscach elektrod można szybko przejrzeć pod względem odpowiedzi częstotliwościowej, a nie mniej specyficznej odpowiedzi szumowej. Zdolność do szybkiej identyfikacji, kiedy dostępny jest wystarczający zakres populacji komórek dostrojonych do częstotliwości, ma kluczowe znaczenie w badaniach, gdy testowana jest dyskryminacja bodźców elektrycznych. Jeśli uzyskuje się niewystarczający rozkład częstotliwości, to porównanie stymulacji między różnymi obszarami częstotliwości jest po prostu niemożliwe. Niemniej jednak dłuższy proces mapowania odpowiedzi częstotliwościowo-amplitudowej ma kluczowe znaczenie dla dostarczenia szczegółowych informacji na temat zakresu strojenia populacji komórek i powinien być przeprowadzony przed zamocowaniem elektrody na miejscu.

W treningu behawioralnym i testowaniu, włączenie okresu bez bodźca (lub cichego) między próbami, przed wystąpieniem bodźca, pozwala na zbadanie reakcji na początkowy początek bodźca. W przypadku korzystania z elektrycznej stymulacji neuronalnej, reakcja na pojawienie się bodźca dostarcza dowodów na proste wykrycie bodźca. Tak więc, gdy nie ma reakcji na początek bodźca, ale reakcja, gdy wprowadzany jest drugi bodziec naprzemienny, można wywnioskować, że można wykryć tylko ten drugi bodziec. Bez uwzględnienia takiego okresu ciszy nie byłoby możliwości stwierdzenia, że poprzedni bodziec nie został wykryty.

Ograniczeniem w tej technice testowania behawioralnego jest to, że brak wstrząsów stopą po prezentacji stymulacji neuronalnej może prowadzić do rozwoju specyficzności w uwarunkowanym strachu, tak że strach jest wyrażany tylko wtedy, gdy prezentowany jest bodziec akustyczny. Oznacza to, że zwierzę może nauczyć się, że szczególne efekty sensoryczne stymulacji neuronalnej są związane z brakiem wstrząsu stopy. W przeciwieństwie do tego, wywoływanie wstrząsów stopami po prezentacji stymulacji neuronalnej może prowadzić do uwarunkowanego strachu przed samym bodźcem nerwowym, odrębnym od wszelkich właściwości podobnych do dźwięku, jakie może mieć bodziec nerwowy. Wyniki uzyskane po wykluczeniu wstrząsu stopowego po stymulacji neuronalnej z pewnością dostarczają silniejszych dowodów na to, że bodziec nerwowy jest podobny do dźwięku niż te, w których zastosowano wstrząs stopowy po stymulacji neuronalnej, ponieważ w pierwszym przypadku uwarunkowany strach uogólnił się ze stymulacji akustycznej na neuronalną. Niemniej jednak istnieje ryzyko rozwoju specyficzności dla stymulacji akustycznej, a nie neuronalnej, jest obecne. Wykorzystanie szumu z filtrem pasmowo-przepustowym jako bodźca akustycznego, a nie czystych wybuchów tonów, z których pierwsze może lepiej odzwierciedlać percepcyjne doświadczenie stymulacji neuronalnej, może zmniejszyć ryzyko rozwoju takiej specyficzności. Jednak taka procedura wprowadza dodatkową zmienną w postaci szerokości pasma filtra, która będzie miała wpływ na zadania dyskryminacyjne.

Dodatkowym ograniczeniem związanym z przewlekłą implantacją neuronalną, takim jak wymagane do testów behawioralnych, jest zmiana funkcji elektrody lub związanej z nią tkanki nerwowej w czasie. Stymulacja tkanki nerwowej może prowadzić zarówno do tymczasowego zahamowania aktywności neuronalnej13, jak i zmian w tkankach, takich jak utrata komórek¹⁴ i bezpośredniej odpowiedzi tkanki mózgowej na elektrodę. ¹⁵

Opisane podejście do implantacji i testów behawioralnych zapewnia środki do testowania zarówno wykrywania, jak i dyskryminacji bodźców akustycznych i elektrycznych po krótkim szkoleniu oraz zdolność do sprawowania kontroli nad częstotliwością próby. Technika wykorzystania zmiany w HR jako miary uwarunkowanego strachu może mieć zastosowanie nie tylko do testów słuchowych, ale bardziej ogólnie do wszelkich testów sensorycznych, w których bodźce mogą być prezentowane przez dowolny dyskretny okres i w których pożądane jest wykrycie dyskryminacji sensorycznej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerLab	ADInstruments	ML880	Rejestruje dane otrzymane z wszczepionej karty kontrolera SmartCtrl nadajnika TR40
	Med Associates, Inc.	DIG-716B	Steruje komorą testów behawioralnych, w tym wstrząsami stopy
Modułowa komora do testów behawioralnych	Med Associates, Inc.	ENV-009	Rozmiar komory testowej: 30,5 cm x 39,4 cm
Generator bodźców awersyjnych	Med Associates, Inc.	ENV-410B	Dostarcza awersyjne uderzenia stopy na metalową podłogę klatki za pomocą jednostki Solid State Scrambler
Programowalny tłumik	TDT	PA5	Kontroluje amplitudę dostarczanego sygnału akustycznego, aby zapewnić stabilną amplitudę w zakresie częstotliwości
Elektrostatyczny sterownik głośnikowy	TDT	ED1	Napędza głośniki elektrostatyczne (EC1, ES1)
Głośnik elektrostatyczny w polu swobodnym	TDT	ES1	Dźwięki są prezentowane za pomocą tego głośnika w komorze testów behawioralnych
Sprzężony głośnik elektrostatyczny	TDT	EC1	Dźwięki są prezentowane za pomocą tego głośnika podczas operacji wszczepienia implantu nerwowego
Stacja bazowa stymulatora	TDT	RX7	Kontroluje dostarczanie elektrycznej stymulacji neuronowej (używana z MS16)
Mikrostymulator	TDT	MS16	Dostarcza wielokanałowy elektryczny neuron stymulacja
Stacja bazowa przetwarzania	TDT	RZ2	Rejestruje aktywność neuronalną podczas implantacji mózgu (za pomocą przedwzmacniacza PZ2)
Przedwzmacniacz	TDT	PZ2-256	256-kanałowy przedwzmacniacz o wysokiej impedancji
Odbiornik urządzenia telemetrycznego	telemetryczne	TR162	Odbiera sygnał cyfrowy z TR40 i konwertuje go na wzmocnione wyjście
analogoweWszczepialne urządzenie telemetryczne do elektrokardiogramu	telemetryczne	TR40	Wszczepione urządzenie nadawcze, próbkowanie z częstotliwością 2 kHz
Procesor wielofunkcyjny	Tucker-Davis Technologies	RX6	Służy do generowania bodźców akustycznych
Vertex Castavaria	Vertex Dental		Akryl dentystyczny służy do mocowania elektrody na miejscu
Kwik-Sil Adhesive, niska lepkość	World Precision Instrumenty, Inc.		Elastomer silikonowy stosowany do powlekania trzonków elektrod Elektroda
wielokanałowa	NeuroNexus Technologies	a2x16-10mm 100-500-413	2-trzonkowa 32-kanałowa matryca elektrod zewnątrzkomórkowych używana do implantacji. Miejsca elektrod zostały aktywowane w celu wytworzenia powłoki z tlenku irydu w ramach przygotowań do stymulacji.