Zastosowanie MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizynowej

Podsumowanie

Prezentujemy metodę wykorzystania spektrometrii mas MALDI i chemii redukcyjnej metylacji do ilościowego określenia zmian w metylacji lizyny.

Streszczenie

Ostatnio odkryto, że regulatory epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w wielu różnych chorobach ^1-3. W rezultacie, enzymy te są głównymi celami badań nad małymi cząsteczkami i opracowywaniem leków ⁴. Wiele regulatorów epigenetycznych zostało odkrytych dopiero niedawno i nadal jest w trakcie klasyfikacji. Wśród tych enzymów znajdują się demetylazy lizynowe, które usuwają grupy metylowe z lizyn na histonach i innych białkach. Ze względu na nowatorski charakter tej klasy enzymów, opracowano niewiele testów do badania ich aktywności. Była to przeszkoda zarówno na drodze do klasyfikacji, jak i wysokoprzepustowego badania demetylaz histonowych. Obecnie istnieje bardzo niewiele testów demetylazy. Te, które istnieją, mają zwykle charakter jakościowy i nie mogą jednocześnie rozróżniać różnych stanów metylacji lizyny (un-, mono-, di- i tri-). Spektrometria mas jest powszechnie stosowana do określania aktywności demetylazy, ale obecne testy spektrometrii mas nie uwzględniają tego, czy różnie metylowane peptydy jonizują się inaczej. Różnicowa jonizacja metylowanych peptydów sprawia, że porównywanie stanów metylacji jest trudne, a na pewno nie ilościowe (ryc. 1A). W związku z tym dostępne testy nie są zoptymalizowane pod kątem kompleksowej analizy aktywności demetylazy.

Tutaj opisujemy metodę o nazwie MassSQUIRM (spektrometria mas z wykorzystaniem izotopowej redukcyjnej metylacji), która opiera się na redukcyjnej metylacji grup aminowych za pomocą deuterowanego formaldehydu, aby zmusić wszystkie lizyny do dimetylacji, czyniąc je w ten sposób zasadniczo tym samym rodzajem chemicznym, a zatem jonizując tak samo (Rysunek 1B). Jedyną różnicą chemiczną po redukcyjnej metylacji jest wodór i deuter, które nie wpływają na skuteczność jonizacji MALDI. Test MassSQUIRM jest specyficzny dla produktów reakcji demetylazy z nie-, mono- lub dimetylowanymi lizynami. Test ma również zastosowanie do metylotransferaz lizyny dających te same produkty reakcji. Tutaj używamy kombinacji chemii redukcyjnej metylacji i spektrometrii mas MALDI do pomiaru aktywności LSD1, demetylazy lizynowej zdolnej do usuwania grup di- i monometylowych, na syntetycznym podłożu peptydowym ⁵. Ten test jest prosty i łatwo dostępny dla każdego laboratorium z dostępem do spektrometru mas MALDI w laboratorium lub za pośrednictwem zakładu proteomicznego. Test ma ~8-krotny zakres dynamiki i można go łatwo skalować do formatu ^{płytki 5}.

Protokół

Ten protokół jest zmodyfikowany z Blair et al. ⁶.

1. Test demetylacji LSD1

1. W końcowej objętości 20 μl połączyć 125 ng rekombinowanego LSD1 z 0,25 μg peptydu H3 histonu dimetylowego (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotyna) w buforze demetylazy (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5% glicerolu). Dodatkowo wykonaj kontrolę samego peptydu bez enzymu. Kontrola dotyczy sekcji 3 i nie wymaga redukcyjnej metylacji.
2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
3. Aby zebrać peptydy, dodaj 8 μl kulek POROS R2 o grubości 20 mikronów do każdej próbki i mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować kulki POROS, zawieszając 1 objętość kulek z 1 objętością metanolu, a następnie dodać 10 objętości 5% kwasu mrówkowego / 0,2% TFA.
4. Kondycjonuj dwie końcówki C₁₈ ZipTip, zasysając 20 μl 0,1% TFA do końcówki i wypychając ją z powrotem za pomocą pipetora. Zrób to dwa razy z 0,1% TFA, cztery razy z 70% acetonitrylu / 0,1% TFA i cztery razy ponownie z 0,1% TFA.
5. Załaduj dwie próbki (kontrolną i reakcję demetylazy) na kondycjonowane końcówki ZipTip C₁₈, pipetując zawiesinę kulki za żywicą C₁₈ w końcówkach ZipTips i przepychając objętość za pomocą pipetora.
6. Umyj końcówki ZipTips dwukrotnie w 20 μl 0,1% TFA.
7. Elute w 40 μl 70% acetonitrylu / 0,1% TFA.
8. Całkowicie liofilizuj każdy eluant za pomocą koncentratora SpeedVac.

2. Metylacja redukcyjna

Ta część protokołu jest zmodyfikowana z Blair et al. i Rayment et al. ^6,7.

1. Ponownie zawiesić reakcję demetylazy w 100 μl 50 mM buforu fosforanowego o pH 7,4.
2. Do reakcji demetylazy dodać 8 μl 15 mg/ml dimetyloaminy boranowej. Boran dimetyloamina rozpuszcza się w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,4, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 15 mg/ml. To powinno być świeże.
3. Do reakcji demetylazy dodać 16 μl 250 mM deuterowanego formaldehydu. Deuterowany formaldehyd o stężeniu 250 mM otrzymuje się przez rozcieńczenie substancji w H₂0. To powinno być świeże.
4. Inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
5. Powtórz kroki 2.2, 2.3 i 2.4.
6. Powtórz krok 2.2.
7. Inkubować w temperaturze 4°C przez ~15 godzin.
8. Do próbki demetylazy dodać 12,5 μl 1M Tris o pH 7,4 w celu wygaszenia reakcji metylacji redukcyjnej.

3. Spektrometria mas MALDI

1. Dodaj kulki POROS R2 o grubości 20 mikronów do reakcji demetylazy i zbierz na ZipTips, jak opisano w krokach 1.3-1.6.

Uwaga: Ponownie zawiesić kontrolę w 100 μL 50 mM buforu fosforanowego o pH 7,4 i traktować jak drugą próbkę, zaczynając od kroku 3.1.

2. Eluować próbki reakcji kontrolnej i demetylazy z końcówek ZipTips na płytkę próbki MALDI przy użyciu 2 μl 33% nasyconego kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego. Aby przygotować 33% kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, należy przygotować nasycony roztwór kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA, a następnie rozcieńczyć do 33% nasyconego w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA. Pozostawić eluowane próbki do wyschnięcia i krystalizacji.
3. Zbieraj widma masowe za pomocą spektrometru masowego PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF lub dostępnego spektrometru masowego MALDI o wysokiej rozdzielczości ^8,9,10.
4. Przeglądaj widma i wyodrębniaj obszary pików za pomocą oprogramowania PerkinElmerSciex TOFworks lub oprogramowania dostarczonego przez producenta spektrometru mas.
5. Weryfikacja produktów reakcji za pomocą MS² za pomocą dostępnego systemu spektrometrii mas zapewniającego możliwości tandemowej spektrometrii mas.

4. Analiza danych

1. W celu skompensowania nakładania się izotopów powstałego przy użyciu ciężkiego formaldehydu (rysunek 1B), należy określić stosunek powierzchni pików (A) izotopów ¹³C₂ i ¹³C₄ w stosunku do piku monoizotopowego dla próbki kontrolnej, która nie została poddana metylacji redukcyjnej (rys. 2A).
   Równanie 1: A_13C2/A_12C = r₁
   Równanie 2: A_13C4/A_12C = r₂
   To da ci stosunek peptydu istniejącego w tych stanach izotopowych (r₁ i r₂) specyficzny dla twojego eksperymentu i spektrometru masowego.
2. Użyj wartości r₁ i r₂ w poniższych wzorach do ilościowego określenia względnej ilości peptydu istniejącego w każdym stanie modyfikacji w próbce reakcji demetylazy (ryc. 2B):
   Korektor 3: H3K4me2= A₁
   Równanie 4: H3K4me = A₂ - r₁(A₁)
   Korektor 5: H3K4 =A₃ - r₂(A₁) - [r₁(A₂ - r₁(A₁))]

5. Reprezentatywne wyniki

Korzystając z LSD1, pokazujemy skuteczność MassSQUIRM w ilościowym określaniu demetylacji lizyny. Jak opisano w sekcji Tekst protokołu, przeprowadziliśmy test demetylazy ze 125 ng LSD1 i 0,25 μg peptydu histonu dimetylowego H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotyna). Próbki reakcji kontrolnej i demetylazy poddano metylacji redukcyjnej i spektrometrii mas MALDI. Reakcja kontrolna, która nie uległa metylacji redukcyjnej, wykazała typową otoczkę izotopową dla tego peptydu i dostarczyła obszarów pików dla równań 1 i 2 (Figura 2A). Widmo masowe dla reakcji demetylazy dostarczyło obszarów pików dla równań 3-5 (rysunek 2B). Wykorzystując obszary pików z reakcji kontrolnej i demetylazy, ustaliliśmy, że LSD1 demetylował peptyd, dając następujące produkty reakcji: 33,7% di-metyloLys4, 42,3% monometylo-Lys4 i 24% niemetylowany Lys 4. Zapoznaj się z Blair et al., aby uzyskać pełną analizę aktywności demetylazy LSD1, a także badania inhibitorów ⁶. Należy pamiętać, że zmieniające się zmienne, takie jak czas reakcji, stężenie enzymu i stężenie substratu, pozwoli na dogłębną analizę aktywności.

Rysunek 1. Przegląd MassSQUIRM. (A) N-końcowy peptyd z histonu H3 jest pokazany jako nie- (zielony), mono- (czerwony) lub di- (niebieski) metylowany w lizynie 4. Zmienność składu chemicznego każdego peptydu prowadzi do jonizacji różnicowej, co sprawia, że kwantyfikacja jest złożona. (B) Metylacja redukcyjna przekształca wszystkie reszty lizyny w stan dimetylowy, który powoduje, że wszystkie peptydy jonizują się w podobny sposób. Zastosowanie ciężkiego formaldehydu w reakcji metylacji redukcyjnej pozwala na zachowanie tożsamości pierwotnej metylacji. Otwarte kręgi wskazują na lekką metylację, podczas gdy zamknięte koła wskazują na ciężką metylację. Zmodyfikowano na podstawie Blair i in. 2011⁶.

Rysunek 2. MassSQUIRM może być stosowany do ilościowego oznaczania różnie metylowanych peptydów. (A) Dimetylowany syntetyczny peptyd histonu H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotyna) analizowano przy użyciu spektrometrii mas, a stosunki pików w stosunku do piku monoizotopowego odnotowano jako r₁ i r₂ w równaniach 1 i 2. (B) Ten sam syntetyczny peptyd inkubowano ze 125 ng LSD1 w buforze demetylazy przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Próbki następnie poddano analizie MassSQUIRM. Mieszana populacja nakładających się pików reprezentuje trzy różne stany metylacji, jak pokazano na rysunku 1B. Obszary poniżej pików monoizotopowych zostały oznaczone jako A₁, A₂ i A₃. Powierzchnie pików wykorzystano w równaniach 3-5. Otwarte kręgi wskazują na lekką metylację, podczas gdy zamknięte koła wskazują na ciężką metylację. Zmodyfikowano na podstawie Blair i in. 2011⁶.

Dyskusja

MassSQUIRM to niedroga i ilościowa metoda kompleksowej analizy aktywności demetylazy lizynowej biorących udział w mono- i dimetylacji. MassSQUIRM oferuje ilościowe oznaczanie nie tylko produktu reakcji, ale także produktów pośrednich. Test ten może być wykorzystany jako potężne narzędzie do badania mechanizmu LSD1 i innych demetylazy histonowych. Będzie również przydatny do klasyfikacji wielu nowo odkrytych enzymów demetylazy lizyny, takich jak PHF8, i może być stosowany do niektórych enzymów metylotransferazy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LSD1	BPS Biosciences	50100
Peptyd H3K4me2-biotyna	Przygotowany w laboratorium	brak
Koraliki POROS R2 20 mikronów	Applied Biosystems	1-1129-06
C18 ZipTip	EMD Millipore	ZTC18M
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28904
acetonitryl	Fisher Scientific	A996
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Sigma-Aldrich	85707
Boran dimetyloamina	Sigma-Aldrich	180238
izotopowo ciężki d2-formaldehyd	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-805-20
Tris	Fisher Scientific	BP154
KCl	Fisher Scientific	BP366
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Glicerol	Fisher Scientific	G33
Kwas mrówkowy	Fluka	06440
Metanol	Fisher Scientific	A452
Koncentrator fosforanu	Fisher Scientific	BP329
SpeedVac	Savant	DNA110
Spektrometr masowy MALDI-prOTOF i oprogramowanie TOFworks	PerkinElmer, Inc.	żaden