Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Streszczenie

Niedawno odkryto, że regulatory epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w wielu różnych chorobach ^1-3. W konsekwencji enzymy te stanowią główne cele badań nad małymi cząsteczkami i rozwoju leków ⁴. Wiele regulatorów epigenetycznych zostało odkrytych niedawno i wciąż podlega klasyfikacji. Wśród tych enzymów znajdują się demetylazy lizyny, które usuwają grupy metylowe z lizyn w histonach i innych białkach. Ze względu na nowatorski charakter tej klasy enzymów opracowano niewiele testów służących do badania ich aktywności. Stanowiło to przeszkodę zarówno w klasyfikacji, jak i w badaniach wysokoprzepustowych demetylaz histonowych. Obecnie istnieje bardzo niewiele testów demetylaz. Te, które są dostępne, mają zazwyczaj charakter jakościowy i nie potrafią jednocześnie rozróżnić różnych stanów metylowania lizyny (braku metylowania, mono-, di- oraz trimetylowania). Spektrometria mas jest powszechnie stosowana do określania aktywności demetylaz, ale obecne metody spektrometryczne nie rozstrzygają, czy różnie zmetylowane peptydy jonizują się w odmienny sposób. Różnicowa jonizacja zmetylowanych peptydów utrudnia porównywanie stanów metylowania i sprawia, że nie jest ono ilościowe (Rysunek 1A). Zatem dostępne testy nie są zoptymalizowane pod kątem kompleksowej analizy aktywności demetylaz.

Opisujemy tutaj metodę o nazwie MassSQUIRM (ilościowe oznaczanie spektrometrią mas z wykorzystaniem izotopowego redukcyjnego metylowania), która opiera się na redukcyjnym metylowaniu grup aminowych za pomocą deuterowanego formaldehydu w celu wymuszenia dimetylowania wszystkich lizyn, co sprawia, że stają się one w zasadzie tym samym gatunkiem chemicznym i w związku z tym jonizują w ten sam sposób (Rysunek 1B). Jedyną różnicą chemiczną po redukcyjnym metylowaniu jest obecność wodoru i deuteru, co nie wpływa na wydajność jonizacji w technice MALDI. Analiza MassSQUIRM jest specyficzna dla produktów reakcji demetylaz z lizynami nie-metylowanymi, monometylowanymi lub dimetylowanymi. Metoda ta ma zastosowanie również do metylotransferaz lizyny dających te same produkty reakcji. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy kombinację chemii redukcyjnego metylowania i spektrometrii mas MALDI do pomiaru aktywności LSD1, demetylazy lizyny zdolnej do usuwania grup dimetylowych i monometylowych, w syntetycznym substracie peptydowym ⁵. Analiza ta jest prosta i łatwo dostępna dla każdego laboratorium posiadającego dostęp do spektrometru mas MALDI wewnątrz jednostki lub poprzez zaplecze proteomiczne. Metoda ta posiada około 8-krotny zakres dynamiczny i jest łatwo skalowalna do formatu wielodołkowego ⁵.

Protokół

Niniejszy protokół został zmodyfikowany na podstawie pracy Blair et al. ⁶.

1. Test demetylacji LSD1

1. W końcowej objętości 20 μL połączyć 125 ng rekombinowanego LSD1 z 0,25 μg peptydu dimetylowanej histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) w buforze do demetylazy (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5% glicerolu). Dodatkowo przeprowadzić kontrolę z samym peptydem bez enzymu. Kontrola ta jest przeznaczona do sekcji 3 i nie wymaga metylacji redukcyjnej.
2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
3. Aby zebrać peptydy, dodać 8 μL kulek POROS R2 20 micron do każdej próbki i mieszać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kulki POROS przygotować poprzez zawieszenie 1 objętości kulek w 1 objętości metanolu, a następnie dodać 10 objętości 5% kwasu mrówkowego / 0,2% TFA.
4. Uwarunkować dwie końcówki C₁₈ ZipTips, aspirując 20 μL 0,1% TFA do końcówki i wypychając roztwór pipetorem. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie z 0,1% TFA, czterokrotnie z 70% acetonitrylu / 0,1% TFA oraz ponownie czterokrotnie z 0,1% TFA.
5. Nanieść dwie próbki (kontrolną oraz reakcję demetylacji) na uwarunkowane ZipTips C₁₈, pipetując zawiesinę kulek za żywicę C₁₈ w ZipTips i przepychając objętość pipetorem.
6. Przemyć ZipTips dwukrotnie 20 μL 0,1% TFA.
7. Eluować w 40 μL 70% acetonitrylu / 0,1% TFA.
8. Całkowicie liofilizować każdy eluat za pomocą koncentratora SpeedVac.

2. Metylowanie redukcyjne

Ta część protokołu została zmodyfikowana na podstawie prac Blair et al. oraz Rayment et al. ^6,7.

1. Resuspender reakcję demethylazy w 100 μL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.4.
2. Do reakcji demethylazy dodać 8 μL boranu dimetyloaminy w stężeniu 15 mg/mL. Boran dimetyloaminy rozpuszcza się w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7.4, aby otrzymać roztwór stokowy o stężeniu 15 mg/mL. Należy go przygotować bezpośrednio przed użyciem.
3. Do reakcji demethylazy dodać 16 μL deuterowanego formaldehydu w stężeniu 250 mM. Deuterowany formaldehyd 250 mM przygotowuje się poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego w H₂0. Należy go przygotować bezpośrednio przed użyciem.
4. Inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
5. Powtórzyć kroki 2.2, 2.3 i 2.4.
6. Powtórzyć krok 2.2.
7. Inkubować w temperaturze 4°C przez ok. 15 godzin.
8. Do próbki z reakcją demethylazy dodać 12.5 μL 1M Tris, pH 7.4, aby zatrzymać reakcję redukcyjnego metylowania.

3. Spektrometria mas MALDI

1. Dodaj kulki POROS R2 20 micron do reakcji demetylacji, a następnie zbierz je na ZipTips zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.6.

Uwaga: Kontrolę należy zawiesić ponownie w 100 μL 50 mM buforu fosforanowego o pH 7.4 i traktować tak samo jak pozostałą próbkę, zaczynając od kroku 3.1.

2. Przenieś próbki kontrolne i próbki z reakcją demetylazy z ZipTips na płytkę do próbek MALDI, eluując je za pomocą 2 μL 33% nasyconego kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego. Aby przygotować 33% kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego, należy sporządzić nasycony roztwór kwasu 2,5-dihydroksybenzoenowego w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA, a następnie rozcieńczyć go do stężenia 33% nasycenia w 70% acetonitrylu / 0,1% TFA. Pozostaw eluowane próbki do wyschnięcia i krystalizacji.
3. Zarejestruj widma mas za pomocą spektrometru mas PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF lub innego dostępnego spektrometru mas MALDI o wysokiej rozdzielczości ^8,9,10.
4. Przeanalizuj widma i wyznacz powierzchnie pików przy użyciu oprogramowania PerkinElmerSciex TOFworks lub oprogramowania dostarczonego przez producenta spektrometru mas.
5. Zweryfikuj produkty reakcji za pomocą MS² przy użyciu dostępnego systemu spektrometrii mas z możliwością przeprowadzania spektrometrii mas tandemowej.

4. Analiza danych

1. Aby skompensować nakładanie się izotopowe wynikające z użycia ciężkiego formaldehydu (Rysunek 1B), wyznacz stosunek pola powierzchni piku (A) izotopów ¹³C₂ i ¹³C₄ względem piku monoisotopowego dla próbki kontrolnej, która nie została poddana metylacji redukcyjnej (Rys. 2A).
   Eq 1: A_13C2/A_12C = r₁
   Eq 2: A_13C4/A_12C = r₂
   Pozwoli to określić stosunek peptydów występujących w tych stanach izotopowych (r₁ i r₂) specyficzny dla danego eksperymentu i spektrometru mas.
2. Wykorzystaj wartości r₁ i r₂ w poniższych wzorach do ilościowego oznaczenia względnej zawartości peptydu w każdym stanie modyfikacji w próbce reakcji demethylazy (Rys. 2B):
   Eq 3: H3K4me2= A₁
   Eq 4: H3K4me = A₂ - r₁(A₁)
   Eq 5: H3K4 =A₃ - r₂(A₁) - [r₁(A₂ - r₁(A₁))]

5. Reprezentatywne wyniki

Wykorzystując LSD1, wykazujemy skuteczność metody MassSQUIRM w ilościowym oznaczaniu demetylacji lizyny. Zgodnie z opisem w sekcji Tekst Protokołu, przeprowadziliśmy test demetylazy z użyciem 125 ng LSD1 oraz 0,25 μg peptydu dimetylowanej histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Próbki z reakcji kontrolnej i demetylazy poddano metylacji redukcyjnej oraz spektrometrii mas MALDI. Reakcja kontrolna, która nie została poddana metylacji redukcyjnej, wykazała typową obwiednię izotopową dla tego peptydu i dostarczyła pól powierzchni pików do równań 1 i 2 (Rysunek 2A). Widmo mas dla reakcji demetylazy dostarczyło pól powierzchni pików do równań 3-5 (Rysunek 2B). Wykorzystując pola powierzchni pików z reakcji kontrolnej i demetylazy, ustaliliśmy, że LSD1 zdemetyluje peptyd, dając następujące produkty reakcji: 33,7% dimetylowanej Lys4, 42,3% monometylowanej Lys4 oraz 24% niemetylowanej Lys4. Pełną analizę aktywności demetylazy LSD1, a także badania nad inhibitorami, przedstawiono w pracy Blair et al. ⁶. Należy zauważyć, że zmiana zmiennych, takich jak czas reakcji, stężenie enzymu i stężenie substratu, pozwoli na szczegółową analizę aktywności.

Rycina 1. Przegląd metody MassSQUIRM. (A) Przedstawiono peptyd N-końcowy histony H3 będący nie- (zielony), mono- (czerwony) lub di- (niebieski) metylowany w pozycji lizyny 4. Zróżnicowanie składu chemicznego każdego peptydu prowadzi do różnic w jonizacji, co komplikuje kwantyfikację. (B) Metylacja redukcyjna przekształca wszystkie reszty lizyny w stan di-metylowany, co sprawia, że wszystkie peptydy jonizują się w podobny sposób. Zastosowanie ciężkiego formaldehydu w reakcji metylacji redukcyjnej pozwala na zachowanie tożsamości pierwotnego metylowania. Otwarte kółka oznaczają metylację lekką, a zamknięte kółka metylację ciężką. Zmodyfikowano na podstawie Blair et al. 2011⁶.

Rysunek 2. MassSQUIRM może być wykorzystywany do ilościowego oznaczania różnicowo zmetylowanych peptydów. (A) Di-zmetylowany syntetyczny peptyd histony H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) został poddany analizie za pomocą spektrometrii mas, a stosunki pików w odniesieniu do piku monoisotopowego zapisano jako r₁ i r₂ w równaniach 1 i 2. (B) Ten sam syntetyczny peptyd inkubowano z 125 ng LSD1 w buforze demethylazowym przez dwie godziny w 37°C. Następnie próbki poddano analizie MassSQUIRM. Mieszana populacja nakładających się pików reprezentuje trzy różne stany metylacji, jak pokazano na Rysunku 1B. Pola pod pikami monoisotopowymi zapisano jako A₁, A₂ i A₃. Pola pików wykorzystano w równaniach 3-5. Puste kółka oznaczają lekką metylację, natomiast pełne kółka oznaczają ciężką metylację. Zmodyfikowano na podstawie Blair et al. 2011⁶.

Dyskusja

MassSQUIRM to niedroga i ilościowa metoda kompleksowej analizy aktywności demetylaz lizyny uczestniczących w mono- i dimetylacji. MassSQUIRM umożliwia oznaczanie ilościowe nie tylko produktu reakcji, ale także produktów pośrednich. Analiza ta może służyć jako potężne narzędzie w badaniu mechanizmu działania LSD1 oraz innych demetylaz histonów. Będzie ona również przydatna w klasyfikacji wielu nowo odkrytych enzymów demetylaz lizyny, takich jak PHF8, i mogłaby zostać zastosowana do określonych enzymów metylotransferaz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LSD1	BPS Biosciences	50100
peptyd H3K4me2-biotyna	Przygotowano w laboratorium	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
kule POROS R2 20 μm	Applied Biosystems	1-1129-06
C18 ZipTip	EMD Millipore	ZTC18M
Kwas triflorooctowy (TFA)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28904
acetonitryl	Fisher Scientific	A996
kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Sigma-Aldrich	85707
Boran dimetyloaminy	Sigma-Aldrich	180238
izotopowo ciężki d2-formaldehyd	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-805-20
Tris	Fisher Scientific	BP154
KCl	Fisher Scientific	BP366
MgCl22	Fisher Scientific	BP214
Glicerol	Fisher Scientific	G33
Kwas mrówkowy	Fluka	06440
Methanol	Fisher Scientific	A452
fosforan sodu	Fisher Scientific	BP329
Koncentrator SpeedVac	Savant	DNA110
spektrometr mas MALDI-prOTOF oraz oprogramowanie TOFworks	PerkinElmer, Inc.	Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.