Mikroskopia przyżyciowa śledziony: analiza ilościowa ruchliwości pasożyta i przepływu krwi

Podsumowanie

Pokazujemy metodę wykonywania mikroskopii przyżyciowej śledziony przy użyciu transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz ilościowe określenie ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w tym organie.

Streszczenie

Pojawienie się mikroskopii przyżyciowej w eksperymentalnych modelach malarii u gryzoni umożliwiło znaczny postęp w wiedzy na temat interakcji pasożyt-gospodarz ^1,2. Tak więc obrazowanie in vivo pasożytów malarii w stadiach pre-erytrocytarnych ujawniło aktywne wnikanie pasożytów do węzłów chłonnych skóry ³, całkowity rozwój pasożyta w skórze ⁴ i tworzenie się merosomu pochodzącego z hepatocytów w celu zapewnienia migracji i uwalniania merozoitów do krwiobiegu ⁵. Co więcej, rozwój poszczególnych pasożytów w erytrocytach został niedawno udokumentowany za pomocą obrazowania 4D i podważył nasz obecny pogląd na eksport białka w malarii ⁶. W ten sposób obrazowanie przyżyciowe radykalnie zmieniło nasz pogląd na kluczowe wydarzenia w rozwoju Plasmodium. Niestety, ze względu na ograniczenia techniczne brakuje badań nad dynamicznym przechodzeniem pasożytów malarii przez śledzionę, główny narząd limfatyczny doskonale przystosowany do usuwania zakażonych czerwonych krwinek.

Korzystając z mysiego modelu malarii Plasmodium yoelii u myszy Balb/c, wdrożyliśmy obrazowanie intrażyciowe śledziony i odnotowaliśmy różnicową przebudowę śledziony oraz przyleganie pasożytniczych czerwonych krwinek (pRBC) do komórek barierowych pochodzenia fibroblastycznego w czerwonej miazdze podczas infekcji nieśmiertelnym pasożytem linii P.yoelii 17X, w przeciwieństwie do infekcji śmiertelnym pasożytem P.yoelii 17XL linii ⁷. Aby dojść do tych wniosków, opracowano specjalną metodologię wykorzystującą bezpłatne oprogramowanie ImageJ, aby umożliwić scharakteryzowanie szybkiego trójwymiarowego ruchu pojedynczych pRBC. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu pozwalają na określenie prędkości, kierunkowości i czasu przebywania pasożytów w śledzionie, przy czym wszystkie parametry dotyczą przestrzegania zaleceń in vivo. Ponadto przedstawiamy metodologię oznaczania ilościowego przepływu krwi za pomocą mikroskopii przyżyciowej i stosowania różnych barwników w celu uzyskania wglądu w złożoną strukturę mikrokrążenia śledziony.

Oświadczenie etyczne

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w obiektach dla zwierząt Uniwersytetu w Barcelonie, zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Barcelonie CEEA-UB (Protokół nr DMAH: 5429). Samice myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni uzyskano z Charles River Laboratories.

Protokół

Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w ⁷.

1. Zakażenie zwierząt transgenicznymi pasożytami z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP)

1. Linie transgeniczne P. yoelii-GFP 17XL i 17X zostały wygenerowane przy użyciu tych samych wektorów, strategii celowania i protokołów opisanych w innym miejscu dla P. berghei⁸. Wyrażają one zmutowany wariant 3 GFP ⁹ pod wszechobecnym promotorem czynnika wydłużającego P. berghei 1 (Pbeef1a), który kieruje konstytutywną ekspresję GFP do cytozolu pasożyta podczas całego wewnątrzerytrocytarnego cyklu rozwojowego.
2. Wstrzyknąć zwierzętom dootrzewnowo pasożytowane czerwone krwinki (pRBC) transgenicznych linii P. yoelii-GFP 17XL i 17X uzyskanych z krwi ogonowej myszy dawców w stężeniu 5-10% parazytemii i rozcieńczonych w PBS. Użyj dawki 5x10⁵ pRBC/mysz, aby osiągnąć peryferyjną parazytemię 1% w 3 dniu po zakażeniu (PI).
3. W dniu 3 p.i. sprawdź, czy parazytemia myszy zakażonych obiema liniami pasożytów jest taka sama, wykonując rozmaz krwi z kroplą krwi z ogona, a następnie barwienie Giemsy i obserwację pod mikroskopem świetlnym z obiektywem olejowym 100x. Parazytemię szacuje się, obliczając odsetek pRBC w stosunku do całkowitej liczby erytrocytów w trzech polach optycznych około 300 erytrocytów.
4. Zwierzęta kontrolne, którym wstrzyknięto erytrocyty znakowane FITC, można wykorzystać do scharakteryzowania ruchu tych komórek w normalnych śledzionach.

2. Znakowanie czerwonych krwinek za pomocą FITC i iniekcji do kontroli zwierząt

1. Zebrać 1 ml krwi całkowitej przez nakłucie serca myszy Balb/c w 200 μl PBS zawierającego kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (100 g/l, pH 7,4) i przemyć osad RBC w PBS/EDTA (0,1 g/l, pH 7,4) przez odwirowanie przy 300 xg przez 5 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).
2. Zawiesić ponownie 200 μl osadu RBC w 300 μl PBS/EDTA (0,1 g/l, pH 8) zawierającego FITC (10 g/l) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, delikatnie mieszając. Po tym czasie supernatant jest usuwany, a komórki przemywane pięciokrotnie (300 xg, 5 min, RT) w PBS/EDTA (0,1 g/L, pH 7,4).
3. W przypadku eksperymentów in vivo należy rozcieńczyć 10 μl osadu RBC znakowanego FITC w 200 μl PBS i wstrzyknąć dożylnie myszy Balb/c w celu osiągnięcia 1% FITC-RBC w krążeniu.

3. Zabiegi chirurgiczne

1. Przygotować środek znieczulający do wstrzykiwań składający się ze 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg midazolamu na dawkę, w zależności od masy ciała zwierzęcia. Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo jedną dawkę środka znieczulającego. PrzeczytajPodawaj połowę dawki co 30 minut, aby utrzymać mysz w znieczuleniu w pełnym wymiarze godzin.
2. Utrzymuj mysz w cieple i sprawdź, czy mysz jest całkowicie znieczulona (zwykle po 5-20 minutach), ściskając podkładkę pod stopy przed kontynuowaniem.
3. Aby ułatwić dożylne podawanie substancji w trakcie eksperymentu, należy kannuflować żyłę ogonową myszy za pomocą kaniuli 27G. Sprawdź, czy igła jest dobrze umieszczona wewnątrz żyły, wstrzykując 20-50 μl buforu soli fizjologicznej i uszczelnij ją taśmą. Jeśli jest niedrożny, powtórz kaniulację przed żyłą. Uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
4. Odsłoń dolną część śledziony przez małe nacięcie w skórze i mięśniach po lewej stronie grzbietowej zwierzęcia. Umieść śledzionę w miejscu, w którym obserwuje się mniejszy ruch oddechu i nałóż PBS na odsłoniętą powierzchnię, aby była czysta z włosów myszy i nawilżona.
5. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe o wymiarach 60x24mm klejem cyjanoakrylowym (Super Glue-3 Loctite) do skóry otaczającej śledzionę, aby umożliwić wizualizację.

4. Obrazowanie żywych pasożytów w śledzionie

1. Eksperymenty mikroskopowe z użyciem funkcji przyżyciowych przeprowadzono w mikroskopie konfokalnym Leica TCS-SP5 (Leica Microsystems, Heidelberg, Niemcy) wyposażonym w system inkubacji z kontrolą temperatury, soczewkę obiektywową APO 63x z glicerolem (NA 1,3), skaner rezonansowy o prędkości 8000 linii/s oraz lasery argonowe (488 nm) i HeNe (594 nm, 633 nm). Dodatkowe lasery, takie jak niebieska dioda (405 nm) i dioda-pompa-ciało stałe (561 nm), mogą być wymagane do wzbudzenia sond wymienionych w tabeli 1.
2. Umieść zwierzę na stoliku mikroskopu z osłonką śledziony skierowaną w dół do obiektywu. Ogólny widok struktury mikrokrążenia śledziony można opcjonalnie uwidocznić za pomocą obiektywu 20x. Kontrast odbicia RBC będzie pomocny w wyborze różnych obszarów zainteresowania do późniejszego obrazowania w większym powiększeniu.
3. Skoncentruj wybrane obszary zainteresowania za pomocą soczewki obiektywowej z 63-krotnym zanurzeniem w glicerolu za pomocą autofluorescencji tkankowej. Obserwuje się, że pasożyty GFP przechodzą przez różne obszary śledziony.
4. Fluorescencja jest rejestrowana na dwóch różnych kanałach (długość fali wzbudzenia/emisji 488/505-580 nm dla FITC/GFP i 488/570-630 nm dla autofluorescencji tkankowej) z otworkiem ustawionym na 3,0 jednostek Airy'ego. Odbicie RBC (488/480-495 nm) wraz z barwnikami fluorescencyjnymi do oznaczania unaczynienia krwi (patrz Tabela 1) służy do uzyskania dodatkowych informacji na temat obrazowanej strefy oraz w eksperymentach przepływu krwi opisanych poniżej.
5. Rejestruj obrazy za pomocą pięciu stosów Z pokrywających głębokość 8 μm ze względu na trójwymiarowość organów, z prędkością 8 kHz, aby generować filmy trwające 1,5 minuty.
6. Nagrywaj filmy z różnych stref śledziony do analizy ilościowej.

5. Mikroskopia przyżyciowy mikrokrążenia śledziony i akwizycja obrazu do pomiaru przepływu krwi

1. Niezbędne sondy fluorescencyjne rozpuszczone w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej mogą być wstrzykiwane do żyły ogonowej podczas eksperymentu, aby zobrazować naczynia krwionośne i uzyskać wgląd w strukturę śledziony. Wykaz sond i ich zastosowanie przedstawiono w tabeli 1 ¹⁰.
2. Aby oznaczyć układ naczyniowy dekstranem fluorescencyjnym, należy przygotować 1 mg dekstranu o stężeniu 70 kDa znakowanego czerwienią teksańską w 100 μl buforu soli fizjologicznej.
3. Użyj kaniulowanej żyły ogonowej, aby wstrzyknąć fluorescencyjny dekstran obrazowanemu zwierzęciu.
4. Ustaw naczynia poziomo, w kierunku skaningu laserowego, za pomocą rotacji pola optycznego (bez wpływu na prędkość). Użyj trybów skanowania linii xy i xt w centralnym świetle naczynia. Użyj skanowania dwukierunkowego ze średnią liniową 32 z prędkością 8 kHz, aby uzyskać obraz o wymiarach 512x512 pikseli.
5. Uzyskuj obrazy naczyń krwionośnych na trzech różnych kanałach (długość fali wzbudzenia/emisji 488/505-580 nm, 594/605-660 nm, 488/480-495 nm dla FITC/GFP, dekstran-Texas Red i odbicie erytrocytów).
6. Rób zdjęcia naczyń o różnych średnicach i w różnych fazach cyklu serca, aby skompensować wahania. Na tych obrazach smugi powstałe w wyniku poruszających się komórek zostaną wykorzystane do ilościowego określenia przepływu krwi ¹¹.

6. Przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa ruchliwości pasożytów za pomocą oprogramowania ImageJ

1. Utwórz wideo w czasie rzeczywistym z sekwencji obrazów wygenerowanej za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca).
2. Otwórz plik ".lif" w ImageJ, zachowując sekwencję "xyzct" i oddzielone kanały.
3. Zarejestruj kilka przydatnych informacji z pliku metadanych: dblvoxelX-voxel-width, dblvoxelY-voxel-height, dblvoxelZ-voxel-depth i interwał klatek między kolejnymi klatkami Z i między stosami. Informacje te zostaną wykorzystane do kalibracji.
4. Odejmij autofluorescencję (kanał 2) od obrazów pasożyta GFP (kanał 1). Filtruj obrazy za pomocą rozmycia gaussowskiego = 1. Proszę pamiętać, że użycie filtra rozmycia gaussowskiego na zdjęciach musi być zadeklarowane w przypadku publikacji. Zapisz plik "animal1_m1_substract.seq".
5. Kolorowy film wideo z kodowaniem Z jest tworzony jako materiał pomocniczy do ilościowej analizy ruchliwości pasożytów, ponieważ ułatwi identyfikację pojedynczych cząstek w szybko poruszających się cząstkach i charakterystykę ruchów Z.
6. Przekonwertuj stos na obraz 5D, gdzie trzeci wymiar to Z, a czwarty wymiar to czas. Nadaj inny kolor każdej literze Z i nakładce.
7. Wyświetlaj całą Z, używając maksymalnej intensywności we wszystkich przedziałach czasowych, aby stworzyć kolorowy film z kodowaniem Z. Zapisz jako "animal1_m1_Z_color.avi".
8. Sklasyfikuj i oznacz wszystkie cząsteczki, które pojawiają się w pierwszych 10 klatkach filmu, zgodnie z liczbą klatek zamieszkania (od 1 do 10). W każdym filmie 20 cząsteczek będzie śledzonych zgodnie z uzyskanymi proporcjami. W sumie 120 pasożytów zostanie oznaczonych ilościowo z 3 zwierząt, przy użyciu sześciu filmów wideo/zwierzęcia reprezentujących różne strefy śledziony.
9. Proszę podać klatki zamieszkania na każdym Z i na całym filmie dla wszystkich cząstek, które mają zostać określone ilościowo.
10. Wykonuj ręczne śledzenie cząstek 4D (x,y,z,t) za pomocą wtyczki MTrackJ (napisanej przez E. Meijeringa). Otwórz plik "animal1_m1_substract.seq" jako Image 5D i ustaw właściwości obrazu, korzystając z zarejestrowanych wcześniej informacji o szerokości piksela, wysokości, głębokości (w μm) i interwale stosu (w sekundach). Skonfiguruj ustawienia ścieżki w następujący sposób: "przenieś do następnego razu" i "zastosuj lokalny kursor - jasny środek ciężkości/25x25pixel". Skonfiguruj wyświetlanie: "pokaż początek", "pokaż obraz", "pokaż aktywną ścieżkę", "pokaż tylko ścieżki obecne w bieżących kanałach", "pokaż tylko punkt ścieżki w bieżącym czasie".
11. Dodaj ścieżkę dla każdej cząsteczki. Ruch w osi Z należy uwzględnić tylko wtedy, gdy przemieszczenie jest większe niż 6 μm (średnia średnica dla pRBC). Podążaj za cząsteczką przez maksymalnie 100 klatek.
12. Zapisz współrzędne x, y, z i t mierzone od ścieżki jako "animal1_m1_p1".xls.
13. Miary przemieszczenia (D=SQRT((x_{końcowy-x początkowy})²+(y_{końcowy-y, początkowy})²+(z_{końcowy-z, początkowy})²); długość ścieżki (P=Σ_{n=0→końcowy} SQRT((x_{n+1-x n})²+(y_{n+1-y n})²+(z_{n+1-z n})²) gdzie n oznacza każdą śledzoną pozycję; Średnią prędkość i czas przebywania można obliczyć przy użyciu wartości współrzędnych X,Y,Z,T, śledzonych skalibrowanych zgodnie z zarejestrowanymi danymi. Kierunkowość cząstek definiuje się jako iloraz przemieszczenia w funkcji długości ścieżki, przy czym wartości bliskie 1 wskazują ruch skierowany, a wartości bliskie 0 wskazują ruch ograniczony ¹². W załączeniu znajduje się szablon do obliczeń.

7. Obliczanie objętościowego przepływu krwi

1. Objętościowy przepływ krwi szacuje się jako Q=V*π*D_v²/4, z V, prędkością erytrocytów w przekroju poprzecznym i D_v, średnicą naczynia świetlnego ¹¹.
2. Aby obliczyć V, zmierz kąty (θ) pięciu smug cząstek wykazujących jasne odbicie (RBC) i czterech smug cząstek wykazujących zieloną fluorescencję (pRBC-GFP) na każdym obrazie xt za pomocą oprogramowania ImageJ. Zmierz średnicę naczynia świetlnego na obrazie xy.
3. Prędkość jest następnie wyrażana jako V=1/tan(θ)*D_{, e}/D_v, aby znormalizować dla erytrocytów (D_e=6 μm) i średnic naczyń świetlnych.
4. Określ ilościowo co najmniej trzy naczynia o różnych średnicach i pięć obrazów xt dla każdego naczynia.

8. Analiza statystyczna

1. Do analizy statystycznej należy wykreślić kierunkowość, średnią prędkość i czas przebywania jako rozkłady gęstości i użyć testu równości median w STATA (IC10) w celu oceny różnic między dwiema liniami pasożytów.

9. Reprezentatywne wyniki

Obrazowanie przyżyciowe pasożytów GFP w śledzionie ujawniło różnice w mobilności między dwoma szczepami pasożytów. Analiza ilościowa parametrów ruchliwości pojedynczych pasożytów wykazała zmniejszoną prędkość, brak kierunkowości i wydłużony czas przebywania pasożytów myszy zakażonych szczepem 17X. Co więcej, objętościowy przepływ krwi w naczyniach nie uległ zmianie między szczepami ⁷. Procedurę techniczną przedstawiono na rysunku 1A. Rycina 1B przedstawia ogólny widok normalnej śledziony myszy, której wstrzyknięto erytrocyty znakowane FITC, z powiększeniem na czerwoną miazgę, a innym na naczynie (Rysunek 1B, powiększenie odpowiednio 1 i 2). Unaczynienie zostało potwierdzone przez wstrzyknięcie 70 kDa Dextran-Texas Red wraz z kontrastem odbicia erytrocytów. Inne barwniki fluorescencyjne podsumowane w Tabeli 1 mogą być używane do uzyskania informacji o obrazowanym narządzie, takie jak Hoechst (Figura 1C, 1D).

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pasożytów szczepu 17XL i 17X jest prezentowane na filmach 1 i 2, a niektóre 17X-pRBC (Film 2) pokazują zachowanie toczącego się koła. Ilościową analizę parametrów mobilności uzyskano poprzez śledzenie poszczególnych pasożytów za pomocą kolorowych obrazów kodowanych Z. Rysunek 2A przedstawia projekcję Z stosu kolorów kodowanego Z, w której zakreślona cząstka wydaje się poruszać w różnych płaszczyznach. Ryciny 2B i 2C reprezentują ślady różnych pasożytów w infekcji 17X i 17XL, odpowiednio. Wyniki dotyczące kierunkowości i czasu przebywania wszystkich oznaczonych ilościowo cząstek przedstawiono jako mapę rozkładu gęstości populacji pasożytów odpowiednio na rysunkach 2D i 2E. Aby monitorować przepływ krwi w śledzionie za pomocą mikroskopii przyżyciowej, zmierzono smugi uzyskane w obrazach xt centralnego światła naczyń wynikających z ruchu erytrocytów w celu obliczenia prędkości ¹¹. Zdjęcia przedstawiają skan xy naczynia (rysunek 2F) z odpowiadającym mu skanem linii xt (rysunek 2G).

Sonda fluorescencyjna Lokalizacji Wzbudzenie 1 fotonu (nm) Wzbudzenie 2 fotonów (nm) Wykryta emisja (nm) Ilość/ waga myszy Hoechst 33342 powiedział: Sonda wiążąca DNA z permetyką błonową. Znakuje jądra wszystkich komórek (żywych i martwych) po wstrzyknięciu dożylnym. Rejon 405 TGL 800 szt. Wymiary: 410-480 12,5 g/kg Jodek propidyny Sonda wiążąca DNA z nieprzepuszczalną błoną. Znakuje jądra komórek z naruszoną błoną (komórki apoptotyczne i martwicze). Okręg wyborczy 561 TGL 800 szt. Nr kat. 570-650 szt. 250 mg/kg 70 000 mol wt Dekstran fluorescencyjny (FITC, Texas Red) Marker fazy płynnej, który zwiększa kontrast osocza. FITC 488 Czerwień teksańska 594 800 szt. 500-540
600-650 szt. 50 mg/kg Fluoresceina sodu Zbiorczy marker albuminy w fazie płynnej, który zwiększa kontrast osocza. Z numerem 488 800 szt. 500-540 szt. 2 mmol/kg Evans Niebieski Zbiorczy marker albuminy w fazie płynnej, który zwiększa kontrast osocza. 633 TGL Nd Tel. 645-700 TGL 20 mg/kg Rodamina R6 Niezbędna sonda, która gromadzi się w aktywnych mitochondriach. Znakuje śródbłonek i krążące białe krwinki po wstrzyknięciu dożylnym. Okręg wyborczy 561 TGL 800 szt. Nr kat. 570-650 szt. 25 mg/kg Fluosfery - średnica 1 mikrona Koraliki, które są wychwytywane przez komórki o aktywności fagocytarnej. Z numerem 488 800 szt. 500-540 szt. Nd Przeciwciało specyficzne dla łańcucha fibryny IIβ znakowane Alexa488 Sonda znakująca łańcuch fibryny IIβ Z numerem 488 800 szt. 500-540 szt. 0,3 mg/kg

Tabela 1. Sondy fluorescencyjne do mikroskopii przyżyciowej. Niezbędne barwniki fluorescencyjne o różnych lokalizacjach, które można wykorzystać do znakowania śledziony in vivo. Podano zakresy wzbudzenia/emisji (Exc/em) do stosowania z mikroskopią jednofotonową (lub dwufotonową). Wskazaną dawkę rozpuszcza się w 0,1-0,2 ml buforu soli fizjologicznej i wstrzykuje do żyły ogonowej myszy. [ND: Nie określono w tym badaniu.

Rysunek 1. Mikroskopia przyżyciowa śledziony. A. Mikroskop konfokalny Leica TCS-SP5 z jedną myszką umieszczoną na stoliku mikroskopu. Mysz ma dolną część śledziony odsłoniętą i uszczelnioną szkiełkiem nakrywkowym. Ur. Obraz reprezentatywnego obszaru śledziony niezakażonego zwierzęcia, któremu wstrzyknięto erytrocyty znakowane FITC i 70 kDa Dextran-Texas Red w celu uwidocznienia układu naczyniowego. Pokazane są odbicia (żółty), dekstran (niebieski) i FITC-RBC (zielony). Powiększenia w białych pudełkach reprezentują obszary otwartego obiegu (1) i zamkniętego (2). Otwarty obieg (C) i zamknięty obieg (D) barwiony dekstranem 70 kDa (czerwony) i Hoechst 33342 (niebieski).

Rysunek 2. Kwantyfikacja ruchliwości pasożyta i przepływu krwi. A-C. Ilościowa analiza ruchu cząstek w czterech wymiarach (4D) jest ułatwiona dzięki zastosowaniu przetwarzania obrazu oznaczonego kolorami. ZA. Śledzenie przeprowadzono za pomocą informacji o głębi z kolorowych obrazów zakodowanych w Z, reprezentowanych za pomocą projekcji maksymalnej intensywności na pięciu różnych głębokościach. Biały prostokąt reprezentuje tę samą cząstkę w różnych Z w jednym punkcie czasowym. Różne pozycje wynikają z upływów czasu między akwizycją różnych obrazów Z. Kod głębokości: żółty (0 μm), pomarańczowy (2 μm), różowy (4 μm), niebieski (6 μm), zielony (8 μm). B, C. Projekcje czasowe ruchu cząstek w każdym przedziale czasowym oznaczone jako: szary (0-2,4 s), cyjan (2,4-4,8 s), magenta (4,8-7,0 s), czerwony (7,0-9,4 s) i żółty (9,4-11,8 s). Biała linia reprezentuje ręczne śledzenie 4D cząstek pasożytów GFP 17X (11,8 s) (B) i 17XL (4,8 s) (C) za pomocą MTrackJ. D,E. Rozkład gęstości cząstek GFP według wartości kierunkowości (D) i czasu przebywania (E). Dane odpowiadają 120 cząstkom każdej linii pasożytów i 100 krwinkom czerwonym znakowanym FITC z trzech niezależnych eksperymentów analizowanych za pomocą testu równości median. Mediany 17X/17XL/FITC-RBC wynoszą 0,53/0,75/0,85 (D) i 4,61/0,67/0,9 s (E). Różnice między dwiema liniami w (D) i (E) są istotne statystycznie (P < 0,001). Różnice między erytrocytami znakowanymi FITC a pasożytami 17XL nie są statystycznie istotne (P > 0,05). F,G. Pomiary przepływu krwi w śledzionie. Reprezentacja obrazu xy (F) i obrazu xt (G) z liniowego skanu centralnego światła tego samego naczynia (biała linia). Naczynie śledziony z widocznym osoczem z dekstranem 70 kDa (czerwony), pRBC (zielony) i odbiciem erytrocytów (niebieski).

Filmy 1 i 2. Obrazy z mikroskopii przyżyciowej w trybie poklatkowym mysiej śledziony zakażonej 17XL (1) lub 17X (2) transgenicznymi pasożytami GFP przy 10% parazytemii (projekcja Z-max). Autofluorescencja pasożyta i tkanek jest pokazana odpowiednio na zielono i czerwono. Podziałka liniowa wynosi 10 μm, a przedział czasu jest podany w sek.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 1.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 2.

Dyskusja

Zastosowanie mikroskopii przyżyciowej śledziony w tym modelu malarii u gryzoni otworzyło możliwość zbadania dynamicznego przechodzenia pasożytów przez ten narząd, który do tej pory był uważany za "czarną skrzynkę" ze względów technicznych. W tym przypadku włożono duży wysiłek w dostosowanie metody ilościowej, która umożliwia analizę porównawczą różnych linii pasożytów na poziomie pojedynczym i populacji. W przeciwieństwie do innych tkanek i komórek, które zostały wcześniej zobrazowane w malarii ^3,5, obrazowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop konfokalny Leica TCS-SP5	Numer	seryjny TCS-SP5 Numer seryjny 5100000419
Ketamina (Ketolar 50 mg/ml)	Pfizer Pharma GmbH	631028
Midazolam 15 mg/3 ml	Normon	838193
70 000 MW Dekstran, sprzężony z Texas Red	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
Izotiocyjanian fluoresceiny, izomer I (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
H– CHST 33342	Sigma-Aldrich	H1399
Bejca Giemsa	Sigma-Aldrich	GS1	Roztwór roboczy ma 10% stężenia w wodzie destylowanej
Super Glue-3 Loctite	Loctite	9975-0880