Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3609

⸱

14 stycznia 2012

 ,  ,  , 
1Department of poverty related diseases, Barcelona Centre for International Health Research, 2Confocal Microscopy Unit, University of Barcelona- Scientific and Technological Centers, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Streszczenie

Wprowadzenie mikroskopii wewnątrzorganicznej w eksperymentalnych gryzoniach modelach malarii pozwoliło na dokonanie znaczących postępów w wiedzy na temat interakcji między pasożytem a gospodarzem 1,2. W ten sposób obrazowanie in vivo pasożytów malarii podczas stadiów preerytrocytarnych ujawniło aktywne wnikanie pasożytów do węzłów chłonnych skóry 3, pełny rozwój pasożyta w skórze 4 oraz tworzenie merosomu pochodzącego z hepatocytów, aby zapewnić migrację i uwalnianie merozoitów do krwiobiegu 5. Co więcej, rozwój pojedynczych pasożytów w erytrocytach został niedawno udokumentowany przy użyciu obrazowania 4D, co podważyło nasze obecne spojrzenie na eksport białek w malarii 6. Zatem obrazowanie wewnątrzorganiczne radykalnie zmieniło nasz pogląd na kluczowe zdarzenia w rozwoju Plasmodium. Niestety, ze względu na ograniczenia techniczne, brakuje badań nad dynamicznym przechodzeniem pasożytów malarii przez śledzionę, główny organ limfatyczny doskonale przystosowany do usuwania zainfekowanych czerwonych krwinek.

Wykorzystując mysi model malarii Plasmodium yoelii u myszy Balb/c, wdrożyliśmy obrazowanie śródoperacyjne śledziony i wykazaliśmy zróżnicowane przebudowy tego narządu oraz przyleganie zainfekowanych erytrocytów (pRBCs) do komórek barierowych pochodzenia fibroblastycznego w czerwonej miazdze podczas infekcji nieletalną linią pasożyta P.yoelii 17X w przeciwieństwie do infekcji letalną linią pasożyta P.yoelii 17XL 7. Aby dojść do tych wniosków, opracowano specyficzną metodologię z wykorzystaniem bezpłatnego oprogramowania ImageJ, umożliwiającą charakterystykę szybkiego ruchu trójwymiarowego pojedynczych pRBCs. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu pozwalają na określenie prędkości, kierunkowości oraz czasu rezydencji pasożytów w śledzionie, co stanowi parametry określające przyleganie in vivo. Ponadto opisujemy metodologię kwantyfikacji przepływu krwi za pomocą mikroskopii śródoperacyjnej oraz zastosowanie różnych środków barwiących w celu uzyskania wglądu w złożoną strukturę mikrokrążenia śledziony.

Oświadczenie etyczne

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w zapleczach dla zwierząt Uniwersytetu w Barcelonie zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Barcelonie CEEA-UB (protokół nr DMAH: 5429). Samice myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni zostały pozyskane z Charles River Laboratories.

Protokół

Metodę tę zastosowano w badaniach opisanych w 7.

1. Zakażanie zwierząt pasożytami transgenicznymi wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)

  1. Transgeniczne linie 17XL i 17X P. yoelii–GFP wygenerowano przy użyciu tych samych wektorów, strategii targetowania i protokołów, które opisano wcześniej dla P. berghei8. Linie te wykazują ekspresję wariantu mutant 3 GFP 9 pod kontrolą wszechobecnego promotora czynnika elongacyjnego 1 P. berghei (Pbeef1a), co zapewnia konstytutywną ekspresję GFP w cytozolu pasożyta podczas całego wewnątrzerytrocytarnego cyklu rozwojowego.
  2. Zainfekuj zwierzęta drogą dosytronialną za pomocą zakażonych czerwonych krwinek (pRBCs) transgenicznych linii 17XL i 17X P. yoelii-GFP, pobranych z krwi ogonowej myszy dawców przy parasitemii 5-10% i rozcieńczonych w PBS. Zastosuj dawkę 5x105 pRBCs/mysz, aby uzyskać obwodową parasitemię na poziomie 1% w 3. dniu po infekcji (p.i.).
  3. W 3. dniu p.i. sprawdź, czy parasitemia u myszy zainfekowanych obiema liniami pasożytów jest taka sama, wykonując rozmaz krwi z kropli krwi ogonowej, a następnie barwiąc preparat metodą Giemsy i obserwując go pod mikroskopem świetlnym z obiektywem olejowym 100x. Parasitemię szacuje się obliczając procent pRBCs w stosunku do całkowitej liczby RBCs w trzech polach widzenia, zawierających około 300 RBCs każde.
  4. Do charakterystyki ruchu tych komórek w prawidłowych śledzionach można wykorzystać zwierzęta kontrolne, którym wstrzyknięto RBCs znakowane FITC.

2. Znakowanie erytrocytów FITC i wstrzykiwanie do zwierząt kontrolnych

  1. Pobrać 1 ml krwi pełnej poprzez punkcję serca myszy Balb/c do 200 μl PBS zawierającego kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (100 g/L, pH 7.4), a następnie przemyć osad erytrocytów w PBS/EDTA (0.1 g/L, pH 7.4) poprzez wirowanie przy 300 xg przez 5 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Resuspender 200 μl osadu erytrocytów w 300 μl PBS/EDTA (0.1 g/L, pH 8) zawierającego FITC (10 g/L) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności przy łagodnym mieszaniu. Po tym czasie usunąć nadsącz i przemyć komórki pięć razy (300 xg, 5 min, RT) w PBS/EDTA (0.1 g/L, pH 7.4).
  3. Do eksperymentów in vivo rozcieńczyć 10 μl osadu erytrocytów znakowanych FITC w 200 μl PBS i wstrzyknąć dożylnie myszy Balb/c, aby uzyskać 1% erytrocytów FITC-RBCs w krążeniu.

3. Procedury chirurgiczne

  1. Przygotować środek znieczulający do wstrzykiwań w składzie 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg midazolamu na dawkę, dostosowaną do masy ciała zwierzęcia. Wstrzyknąć myszy dojamową jedną dawkę środka znieczulającego. Powtarzać podawanie połowy dawki co 30 min, aby utrzymać pełną znieczulenie myszy.
  2. Utrzymywać mysz w cieple i przed przystąpieniem do dalszych czynności sprawdzić (zazwyczaj po 5-20 min), czy zwierzę jest całkowicie znieczulone, poprzez uciśnięcie poduszeczki stopy.
  3. W celu ułatwienia dożylnego podawania substancji w trakcie eksperymentu, przeprowadzić kanulację żyły ogonowej myszy przy użyciu kaniuli 27G. Sprawdzić, czy igła jest prawidłowo umieszczona w naczyniu, wstrzykując 20-50 μl buforu solnego, a następnie zabezpieczyć miejsce wkłucia taśmą. W przypadku niedrożności powtórzyć kanulację powyżej miejsca zatoru. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
  4. Odsłonić dolną część śledziony poprzez niewielkie nacięcie skóry i mięśni po lewej stronie grzbietu zwierzęcia. Umieścić śledzionę w miejscu, w którym obserwuje się mniejszy ruch oddechowy, a następnie nanieść PBS na odsłoniętą powierzchnię, aby zapobiec przywieraniu sierści myszy i zapewnić nawodnienie.
  5. Przymocować szkiełko nakrywki o wymiarach 60x24mm do skóry wokół śledziony za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Super Glue-3 Loctite), aby umożliwić wizualizację.

4. Obrazowanie żywych pasożytów w śledzionie

  1. Eksperymenty z mikroskopii intravitalnej przeprowadzono przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica TCS-SP5 (Leica Microsystems, Heidelberg, Niemcy) wyposażonego w system inkubacji z kontrolą temperatury, obiektywu imersyjnego glicerollowego APO 63x (NA 1,3), skanera rezonansowego o częstotliwości 8000 linii/s oraz laserów argonowego (488 nm) i HeNe (594 nm, 633 nm). Do wzbudzenia sond wymienionych w Tabeli 1 mogą być wymagane dodatkowe lasery, takie jak niebieska dioda (405 nm) oraz laser diodowy ze stanem stałym (561 nm).
  2. Umieść zwierzę na stoliku mikroskopu tak, aby przykryta szkiełkiem nakrywkowym śledziona była skierowana w dół, w stronę obiektywu. Opcjonalnie można zwizualizować ogólny widok struktury mikrokrażenia śledziony, używając obiektywu 20x. Kontrast odbiciowy erytrocytów (RBC) będzie pomocny w wyborze różnych obszarów zainteresowania do późniejszego obrazowania przy większym powiększeniu.
  3. Ustaw ostrość w wybranych obszarach zainteresowania za pomocą obiektywu imersyjnego glicerollowego 63x, wykorzystując autofluorescencję tkanki. Obserwuje się pasożyty GFP przechodzące przez różne obszary śledziony.
  4. Fluorescencję rejestruje się na dwóch różnych kanałach (długość fali wzbudzenia/emisji 488/505-580 nm dla FITC/GFP oraz 488/570-630 nm dla autofluorescencji tkanki) przy ustawieniu przysłony (pinhole) na 3,0 jednostki Airy. Odbicie erytrocytów (488/480-495 nm), wraz z barwnikami fluorescencyjnymi do znakowania naczyń krwionośnych (patrz Tabela 1), jest wykorzystywane do uzyskania dodatkowych informacji o obrazowanej strefie oraz w eksperymentach dotyczących przepływu krwi opisanych poniżej.
  5. Przechwyć obrazy w pięciu seriach Z-stacków obejmujących głębokość 8 μm ze względu na trójwymiarowość narządu, przy prędkości 8 kHz, aby wygenerować filmy trwające 1,5 min.
  6. Nagraj filmy z różnych stref śledziony do analizy ilościowej.

5. Mikroskopia witalna mikrokrążenia śledziony i akwizycja obrazów do pomiaru przepływu krwi

  1. W celu obrazowania naczyń krwionośnych oraz uzyskania informacji o strukturze śledziony podczas eksperymentu można wstrzyknąć do żyły ogonowej witalne sondy fluorescencyjne rozpuszczone w soli izotonicznej. Listę sond oraz ich zastosowania przedstawiono w Tabeli 1 10.
  2. Aby oznakować układ naczyniowy fluorescencyjnym dekstranem, przygotuj 1 mg dekstranu 70 kDa znakowanego Texas Red w 100 μl buforu solnego.
  3. Wykorzystaj kaniulowaną żyłę ogonową, aby wstrzyknąć fluorescencyjny dekstran zwierzęciu poddawanemu obrazowaniu.
  4. Ustaw naczynia poziomo, w kierunku skanowania laserem, poprzez rotację pola optycznego (nie wpływa to na prędkość). W centralnym świetle naczynia zastosuj tryby skanowania liniowego xy i xt. Użyj skanowania dwukierunkowego ze średnią linii wynoszącą 32 przy prędkości 8 kHz, aby uzyskać obraz o rozdzielczości 512x512 pikseli.
  5. Nabyj obrazy naczyń na trzech różnych kanałach (długość fali wzbudzenia/emisji odpowiednio 488/505-580 nm, 594/605-660 nm i 488/480-495 nm dla FITC/GFP, dekstranu Texas Red oraz odbicia erytrocytów).
  6. Wykonaj obrazy naczyń o różnych średnicach oraz w różnych fazach cyklu serca, aby skompensować fluktuacje. Na obrazach tych smugi powstałe w wyniku ruchu komórek zostaną wykorzystane do ilościowego określenia przepływu krwi 11.

6. Przetwarzanie obrazów i analiza ilościowa mobilności pasożytów z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ

  1. Utwórz wideo w czasie rzeczywistym z sekwencji obrazów wygenerowanej za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca).
  2. Otwórz plik ".lif" w programie ImageJ, zachowując sekwencję "xyzct" i oddzielne kanały.
  3. Zapisz przydatne informacje z pliku metadanych: dblvoxelX-szerokość voxela, dblvoxelY-wysokość voxela, dblvoxelZ-głębokość voxela oraz odstęp czasowy między kolejnymi klatkami Z i między stosami. Informacje te posłużą do kalibracji.
  4. Odejmij autofluorescencję (kanał 2) od obrazów pasożytów GFP (kanał 1). Przefiltruj obrazy za pomocą rozmycia Gaussa (Gaussian Blur=1). Należy pamiętać, że zastosowanie filtru rozmycia Gaussa w obrazach musi zostać zadeklarowane w publikacjach. Zapisz plik jako "animal1_m1_substract.seq".
  5. Utworzono wideo z kolorami kodowanymi względem osi Z jako materiał pomocniczy do ilościowej analizy ruchliwości pasożytów, co ułatwi identyfikację pojedynczych cząsteczek w przypadku cząsteczek szybko poruszających się oraz charakterystykę ruchu w osi Z.
  6. Konwertuj stos do obrazu 5D, gdzie trzeci wymiar to Z, a czwarty to czas. Przypisz inny kolor dla każdej płaszczyzny Z i nałóż je na siebie.
  7. Wykonaj projekcję wszystkich płaszczyzn Z przy użyciu maksymalnej intensywności (maximum intensity) dla wszystkich klatek czasowych, aby utworzyć wideo z kolorami kodowanymi względem Z. Zapisz jako "animal1_m1_Z_color.avi".
  8. Sklasyfikuj i oznakuj wszystkie cząsteczki pojawiające się w pierwszych 10 klatkach czasowych wideo zgodnie z liczbą klatek rezydencji (od 1 do 10). W każdym wideo śledzonych będzie 20 cząsteczek zgodnie z uzyskanymi proporcjami. Łącznie poddano analizie ilościowej 120 pasożytów z 3 zwierząt, wykorzystując sześć filmów z każdego zwierzęcia, reprezentujących różne strefy śledziony.
  9. Z raportuj liczbę klatek rezydencji dla każdej płaszczyzny Z oraz dla całego filmu dla wszystkich cząsteczek przeznaczonych do kwantyfikacji.
  10. Wykonaj ręczne śledzenie cząsteczek w 4D (x,y,z,t) przy użyciu wtyczki MTrackJ (autorstwa E. Meijeringa). Otwórz plik "animal1_m1_substract.seq" jako obraz 5D i ustaw właściwości obrazu, korzystając z wcześniej zapisanych informacji o szerokości, wysokości, głębokości piksela (w μm) i odstępie stosu (w sec). Skonfiguruj ustawienia śledzenia w następujący sposób: "move to next time" oraz "apply local cursor-bright centroid/25x25pixel". Skonfiguruj wyświetlanie: "show origin", "show image", "show active track", "show only tracks present in current channels", "show only track point at current time".
  11. Dodaj ścieżkę (track) dla każdej cząsteczki. Uwzględnij ruch w osi Z tylko wtedy, gdy przemieszczenie jest większe niż 6 μm (średnica przeciętna dla pRBC). Śledź cząsteczkę przez maksymalnie 100 klatek.
  12. Zapisz współrzędne x, y, z i t zmierzone ze ścieżki jako "animal1_m1_p1".xls.
  13. Pomiary przemieszczenia (D=SQRT((xfinal-xinital)2+(yfinal-yinital)2+(zfinal-zinital)2); długość drogi (P=Σn=0→final SQRT((xn+1-xn)2+(yn+1-yn)2+(zn+1-zn)2) gdzie n oznacza każdą śledzoną pozycję; średnią prędkość i czas rezydencji można obliczyć, korzystając z wartości współrzędnych x,y,z,t śledzonych i skalibrowanych zgodnie z zapisanymi danymi. Kierunkowość cząsteczek definiuje się jako iloraz przemieszczenia do długości drogi, gdzie wartości bliskie 1 wskazują ruch ukierunkowany, a wartości bliskie 0 wskazują ruch ograniczony 12. Dołączono wzór obliczeń.

7. Obliczanie objętościowego przepływu krwi

  1. Objętościowy przepływ krwi szacuje się jako Q=V*π*Dv2/4, gdzie V to prędkość erytrocytów w przekroju poprzecznym, a Dv to średnica światła naczynia 11.
  2. Aby obliczyć V, należy za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzyć kąty (θ) pięciu smug cząsteczek wykazujących jasne odbicie (RBC) oraz czterech smug cząsteczek wykazujących zieloną fluorescencję (pRBC-GFP) na każdym obrazie xt. Średnicę światła naczynia należy zmierzyć na obrazie xy.
  3. Prędkość wyraża się następnie wzorem V=1/tan(θ)*De/Dv, aby znormalizować dane względem średnicy erytrocytów (De=6 μm) oraz średnicy światła naczynia.
  4. Należy przeprowadzić analizę ilościową minimum trzech naczyń o różnych średnicach oraz pięciu obrazów xt dla każdego naczynia.

8. Analiza statystyczna

  1. W analizie statystycznej należy przedstawić kierunkowość, średnią prędkość oraz czas przebywania w formie rozkładów gęstości i zastosować test równości median w programie STATA (IC10), aby ocenić różnice między dwiema liniami pasożytów.

9. Reprezentatywne wyniki

Obrazowanie intravitalne pasożytów GFP w śledzionie wykazało różnice w mobilności pomiędzy dwoma szczepami pasożytów. Analiza ilościowa parametrów mobilności pojedynczych pasożytów wskazała na zmniejszoną prędkość, brak kierunkowości oraz wydłużony czas przebywania pasożytów u myszy zainfekowanych szczepem 17X. Ponadto objętościowy przepływ krwi w naczyniach nie różnił się pomiędzy szczepami 7. Procedura techniczna przedstawiona jest na Rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia ogólny widok prawidłowej śledziony myszy po wstrzyknięciu RBC znakowanych FITC, wraz z powiększeniem miazgi czerwonej oraz naczynia (Rysunek 1B, powiększenie 1 i 2, odpowiednio). Układ naczyniowy uwidoczniono poprzez wstrzyknięcie Dekstranu-Texas Red 70 kDa wraz z kontrastem refleksyjnym erytrocytów. Do uzyskania informacji o obrazowanym organie można wykorzystać inne barwniki fluorescencyjne podsumowane w Tabeli 1, takie jak Hoechst (Rysunek 1C, 1D).

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pasożytów szczepów 17XL i 17X przedstawiono w Filmach 1 i 2, przy czym niektóre 17X-pRBC (Film 2) wykazują zachowanie typu rolling-circle. Ilościowa analiza parametrów mobilności została przeprowadzona poprzez śledzenie poszczególnych pasożytów z wykorzystaniem obrazów kolorowych kodowanych w osi Z. Rysunek 2A przedstawia projekcję Z stosu kolorowego kodowanego w osi Z, na której zakreślona cząsteczka wydaje się poruszać w różnych płaszczyznach. Rysunek 2B i 2C przedstawiają trajektorie różnych pasożytów odpowiednio w przypadku zakażenia szczepem 17X oraz 17XL. Wyniki kierunkowości i czasu przebywania wszystkich przeanalizowanych cząsteczek przedstawiono odpowiednio na mapach rozkładu gęstości populacji pasożytów na Rysunkach 2D i 2E. Aby monitorować przepływ krwi w śledzionie za pomocą mikroskopii wewnątrzorganizowej, zmierzono smugi uzyskane na obrazach xt w centralnym świetle naczyń, wynikające z ruchu erytrocytów, w celu obliczenia prędkości 11. Obrazy przedstawiają skan xy naczynia (Rysunek 2F) wraz z odpowiadającym mu skanem liniowym xt (Rysunek 2G).

Sonda fluorescencyjnaLokalizacjaWzbudzenie 1-fotonowe (nm)Wzbudzenie 2-fotonowe (nm)Wykrywana emisja (nm)Ilość / masa myszy
Hoechst 33342Sonda wiążąca DNA, przenikająca przez błony. Po wstrzyknięciu dożylnym znakuje jądra wszystkich komórek (żywych i martwych).405800410-48012.5 g/Kg
Jodek propidynyymSonda wiążąca DNA, nieprzenikająca przez błony. Znakuje jądra komórek z uszkodzoną błoną (komórki apoptotyczne i nekrotyczne).561800570-650250 mg/Kg
Fluorescencyjny dekstran o masie cząsteczkowej 70 000 (FITC, Texas Red)Marker fazy ciekłej zwiększający kontrast osocza.FITC 488 Texas Red 594800500-540
600-650		50 mg/Kg
Fluoresceina sodowaMarker albuminy w fazie ciekłej zwiększający kontrast osocza.488800500-5402 mmol/Kg
Błękit EvansaMarker albuminy w fazie ciekłej zwiększający kontrast osocza.633nd645-70020 mg/Kg
Rodamina R6Sonda życiowa akumulująca się w aktywnych mitochondriach. Po wstrzyknięciu dożylnym znakuje śródbłonk i krążące białe krwinki.561800570-65025 mg/Kg
Fluosfery o średnicy 1 μmKuleczki pochłaniane przez komórki o aktywności fagocytarnej.488800500-540nd
Przeciwciało specyficzne dla łańcucha IIβ fibrynogenu znakowane Alexa488Sonda znakująca łańcuch IIβ fibrynogenu488800500-5400.3 mg/Kg

Tabela 1. Sondy fluorescencyjne do mikroskopii intravitalnej. Witalne barwniki fluorescencyjne o różnych lokalizacjach, które mogą być wykorzystane do znakowania śledziony in vivo. Podano zakresy wzbudzenia/emisji (Exc/em) do stosowania w mikroskopii jednofotonowej (lub dwufotonowej). Wskazana dawka jest rozpuszczona w 0,1-0,2 ml buforu solnego i wstrzyknięta do żyły ogonowej myszy. [nd: nie określono w niniejszym badaniu.

Wielokolorowa mikroskopia fluorescencyjna do obrazowania tkanki nerwowej; konfiguracja mikroskopu optycznego; szczegóły komórkowe.
Rycina 1. Mikroskopia intravitalna śledziony. A. Konfokalny mikroskop Leica TCS-SP5 z myszą umieszczoną na stoliku mikroskopu. Dolna część śledziony myszy jest odsłonięta i zabezpieczona szkiełkiem nakrywkowym. B. Obraz reprezentatywnego obszaru śledziony zwierzęcia niezinfekowanego, wstrzyknięto któremu RBC znakowane FITC oraz dekstran 70 kDa Texas Red w celu wizualizacji naczyń krwionośnych. Przedstawiono obraz odbicia (żółty), dekstran (niebieski) oraz RBC-FITC (zielony). Powiększenia w białych ramkach przedstawiają obszary krążenia otwartego (1) i krążenia zamkniętego (2). Obszar krążenia otwartego (C) oraz krążenia zamkniętego (D) barwione dekstranem 70 kDa (czerwony) i Hoechst 33342 (niebieski).

Ilościowa mobilność pasożytów w 4D; mikroskopia, wykresy; analiza przepływu krwi, kierunkowość.
Rycina 2. Ilościowa ocena mobilności pasożytów i przepływu krwi. A-C. Ilościowa analiza ruchu cząsteczek w czterech wymiarach (4D) jest możliwa dzięki zastosowaniu przetwarzania obrazu z kodowaniem kolorystycznym. A. Śledzenie przeprowadzono z wykorzystaniem informacji o głębokości z obrazów kolorystycznie zakodowanych w osi Z, przedstawionych za pomocą maksymalnej projekcji intensywności z pięciu różnych głębokości. Biały prostokąt reprezentuje tę samą cząsteczkę na różnych poziomach Z w jednym punkcie czasowym. Różnice w pozycjach wynikają z odstępów czasowych między akwizycją poszczególnych obrazów Z. Kod głębokości: żółty (0 μm), pomarańczowy (2 μm), różowy (4 μm), niebieski (6 μm), zielony (8 μm). B, C. Projekcje czasowe ruchu cząsteczek, gdzie każdy interwał czasowy został oznaczony kolorem: szarym (0-2,4 s), cyjanowym (2,4-4,8 s), magenta (4,8-7,0 s), czerwonym (7,0-9,4 s) i żółtym (9,4-11,8 s). Biała linia reprezentuje ręczne śledzenie 4D cząsteczek pasożytów GFP linii 17X (11,8 s) (B) i 17XL (4,8 s) (C) przy użyciu programu MTrackJ. D,E. Rozkład gęstości cząsteczek GFP w zależności od wartości kierunkowości (D) oraz czasu przebywania (E). Dane odpowiadają 120 cząsteczkom dla każdej linii pasożytów oraz 100 erytrocytów (RBC) znakowanych FITC z trzech niezależnych eksperymentów, analizowanych testem równości median. Mediany dla 17X/17XL/FITC-RBC wynoszą odpowiednio 0,53/0,75/0,85 (D) oraz 4,61/0,67/0,9 s (E). Różnice między dwiema liniami w (D) i (E) są istotne statystycznie (P < 0,001). Różnice między erytrocytami znakowanymi FITC a pasożytami 17XL nie są istotne statystycznie (P > 0,05). F,G. Pomiary przepływu krwi w śledzionie. Przedstawienie obrazu xy (F) oraz obrazu xt (G) z liniowego skanowania centralnego światła tego samego naczynia (biała linia). Naczynie śledzionowe wykazujące plazmę z dekstranem 70 kDa (czerwony), pRBC (zielony) oraz odbicie od erytrocytów (niebieski).

Filmy 1 i 2. Obrazy z mikroskopii intravitalnej w trybie time-lapse śledziony mysiej zainfekowanej transgenicznymi pasożytami GFP 17XL (1) lub 17X (2) przy parasitemii 10% (projekcja Z-maximum). Autofluorescencję pasożytów i tkanki przedstawiono odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym. Paski skali reprezentują 10 μm, a odstępy czasowe są podane w sek.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Film 1.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Film 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wdrożenie mikroskopii intravitalnej śledziony w tym gryzoniowym modelu malarii otworzyło możliwość badania dynamicznego przechodzenia pasożytów przez ten narząd, który do tej pory, ze względów technicznych, był uważany za „czarną skrzynkę”. W niniejszej pracy dołożono dużych starań, aby dostosować ilościową metodę umożliwiającą analizę porównawczą różnych linii pasożytów na poziomie pojedynczych komórek oraz populacji. W przeciwieństwie do innych tkanek i komórek obrazowanych wcześniej w przebiegu malarii 3,5,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy szczególnie wdzięczni S. Graewe oraz V. Heussler za wstępne przeszkolenie i ciągły wkład w zakres mikroskopii intravitalnej pasożytów malarii, J. Burns za przekazanie transgenicznych pasożytów GFP, A. Bosch (Confocal Unit, CCiT-UB, IDIBAPS) za pomoc w analizie i kwantyfikacji obrazów oraz P. Astola za wsparcie techniczne. Dziękujemy R. Tous i I. Caralt za produkcję wideo. MF jest stypendystą studiów doktoranckich Generalitat de Catalunya. HAP jest profesorem badawczym ICREA. Prace w laboratorium HAP są finansowane przez Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy grantowej N° 242095, przez Prywatną Fundację CELLEX (Katalonia, Hiszpania) oraz przez Hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (SAF2009-07760).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalny Leica TCS-SP5Leica MicrosystemsTCS-SP5 Serial no. 5100000419
Ketamina (Ketolar 50 mg/ml)Pfizer Pharma GmbH631028
Midazolam 15 mg/3 mlNormon838193
Dekstran 70 000 MW, sprzężony z Texas RedMolecular Probes, Life TechnologiesD1830
Izotiocyjanian fluoresceiny, izomer I (FITC)Sigma-AldrichF7250
H–chst 33342Sigma-AldrichH1399
Barwnik GiemsySigma-AldrichGS1Roztwór roboczy w stężeniu 10% w wodzie destylowanej
Super Glue-3 LoctiteLoctite9975-0880

Bibliografia

  1. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
  2. Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
  3. Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
  4. Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
  5. Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
  6. Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
  7. Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
  8. Linden, M. vander, R, A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
  9. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
  10. Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
  11. Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
  12. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  13. Bowdler, A. J. The complete spleen. , Totowa. Humana Press. (2002).
  14. Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
  15. Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
  16. Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
  17. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  18. Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
  19. Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie ledzionyilo ciowe okre lanie przep ywu krwiPlasmodium yoeliitransgeniczne paso yty GFPmikroskopia konfokalnaanaliza w programie ImageJdynamika czerwonej miazgikaniulacja naczy
Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.