Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że wielopotencjalne komórki macierzyste są niezwykle użyteczne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej1-3. Jednakże, aby efektywnie wykorzystać te komórki do regeneracji tkanek, należy wziąć pod uwagę szereg zmiennych. Zmienne te obejmują: całkowitą objętość i powierzchnię miejsca implantacji, właściwości mechaniczne tkanki oraz mikrośrodowisko tkankowe, w tym stopień unaczynienia i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. W związku z tym materiały stosowane do dostarczania tych komórek muszą być biokompatybilne, o określonym składzie chemicznym, przy jednoczesnym zachowaniu wytrzymałości mechanicznej naśladującej tkankę gospodarza. Materiały te muszą być również przepuszczalne dla tlenu i substancji odżywczych, aby zapewnić korzystne mikrośrodowisko do adhezji i proliferacji komórek. Chitozan, kationowy polisacharyd o doskonałej biokompatybilności, może być łatwo modyfikowany chemicznie i wykazuje wysokie powinowactwo do wiązania się z makrocząsteczkami in vivo4-5. Chitozan naśladuje część glikozaminoglikanową macierzy zewnątrzkomórkowej, co pozwala mu pełnić funkcję podłoża dla adhezji, migracji i proliferacji komórek. W niniejszym badaniu wykorzystujemy chitozan w formie mikrosfer do dostarczenia komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) do trójwymiarowego rusztowania opartego na kolagenie6. W celu uzyskania maksymalnej liczby załadowanych komórek określono optymalny stosunek komórek do mikrosfer w odniesieniu do czasu inkubacji i gęstości komórek. Po wysianiu komórek ASC na mikrosfery chitozanowe (CSM), zostają one osadzone w rusztowaniu kolagenowym i mogą być utrzymywane w kulturze przez dłuższy czas. Podsumowując, niniejsze badanie przedstawia metodę precyzyjnego dostarczania komórek macierzystych w obrębie trójwymiarowego rusztowania biomateriałowego.
Protokół
1. Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego (ASC)
Uwaga: Wszystkie procedury były wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Wyizolować tkankę tłuszczową okołonerkową i nadjądrzową szczura, a następnie przemyć ją sterylnym buforem Hanksa (HBSS) zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą6.
- Rozdrobić tkankę, przenieść 1-2 g do probówki o pojemności 50 mL zawierającej 25 mL HBSS z 1% FBS i odwirować przy 500 g przez 8 min w temperaturze pokojowej.
- Zebrać wolno pływającą warstwę tkanki ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Główną przeszkodą w terapii opartej na komórkach macierzystych jest opracowanie wydajnych metod dostarczania komórek do określonych obszarów w celu ich regeneracji. Ze względu na zmienność między pacjentami, rodzaj tkanki, rozmiar i głębokość uszkodzenia, metodologia dostarczania komórek macierzystych musi być ustalana indywidualnie dla każdego przypadku. Chociaż osadzanie komórek macierzystych w macierzy i dostarczanie ich do miejsca rany wydaje się kolejnym logicznym podejściem w inżynierii tkankowej, nadal istnieją pe.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak konfliktów interesów finansowych.
Zastrzeżenia
Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako oficjalne ani odzwierciedlające stanowisko Departamentu Obrony lub rządu USA. Autorzy są pracownikami rządu USA, a niniejsza praca została przygotowana w ramach ich oficjalnych obowiązków. Wszystkie prace były wspierane przez US Army Medical Research and Materiel Command. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem przeanalizowanym i zatwierdzonym przez Institutional Review Board przy US Army Medical Research and Materiel Command oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem.
Podziękowania
D.O.Z. otrzymał wsparcie w ramach grantu przyznanego przez The Geneva Foundation. S.N. otrzymał wsparcie w ramach grantu na stypendium podoktorskie z Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Materiał zużywalny |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclone | SH30071.03 | Materiał zużywalny |
| Kolagenaza typu II | Sigma-Aldrich | C6685 | Materiał zużywalny |
| Filtr z nylonowej siatki 70-μm | BD Biosciences | 352350 | Materiał zużywalny |
| Filtr z nylonowej siatki 100-μm | BD Biosciences | 352360 | Materiał zużywalny |
| System pożywek wzrostowych MesenPRO | Invitrogen | 12746-012 | Materiał zużywalny |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Materiał zużywalny |
| Kolba do hodowli tkankowych T75 | BD Biosciences | 137787 | Materiał zużywalny |
| Chitozan | Sigma-Aldrich | 448869 | Materiał zużywalny |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 320099 | Materiał zużywalny |
| N-oktanol | Acros Organics | 150630025 | Materiał zużywalny |
| Sorbitanu monooleinian | Sigma-Aldrich | S6760 | Materiał zużywalny |
| Wodorotlenek potasu | Sigma-Aldrich | P1767 | Materiał zużywalny |
| Aceton | Fisher Scientific | L-4859 | Materiał zużywalny |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Materiał zużywalny |
| Kwas trinitrobenzenosulfonowy | Sigma-Aldrich | P2297 | Materiał zużywalny |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | 320331 | Materiał zużywalny |
| Eter etylowy | Sigma-Aldrich | 472-484 | Materiał zużywalny |
| Wkładki do płytek do hodowli tkankowych 8-μm | BD Biosciences | 353097 | Materiał zużywalny |
| Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | Materiał zużywalny |
| Odczynnik MTT | Invitrogen | M6494 | Materiał zużywalny |
| Dimetylosulfoksyd | Sigma-Aldrich | D8779 | Materiał zużywalny |
| Zestaw do znakowania komórek Qtracker (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Materiał zużywalny |
| Kolagen typu 1 | Travigen | 3447-020-01 | Materiał zużywalny |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S8045 | Materiał zużywalny |
| 12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych | BD Biosciences | 353043 | Materiał zużywalny |
| Wirówka | Eppendorf | 5417R | Sprzęt |
| Mieszadło orbitalne | New Brunswick Scienctific | C24 | Sprzęt |
| Inkubator z nawilżaniem i atmosferą 5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Sprzęt |
| Mieszadło z napędem górnym | IKA | Visc6000 | Sprzęt |
| Mieszadło magnetyczne | Corning | PC-210 | Sprzęt |
| Suszarka próżniowa | – | – | Sprzęt |
| Analizator wielkości cząstek | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Sprzęt |
| Kąpiel wodna | Fisher Scientific | Isotemp210 | Sprzęt |
| Spektrofotometr | Beckman Coulter Inc. | Spektrofotometr UV/Vis Beckman Coulter DU800 | Sprzęt |
| Mieszadło Vortex | Diagger | 3030a | Sprzęt |
| Czytnik mikropłytek | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Sprzęt |
| Mikroskop świetlny/fluorescencyjny | Olympus Corporation | IX71 | Sprzęt |
| Mikroskop konfokalny | Olympus Corporation | Skanujący mikroskop konfokalny laserowy FV-500 | Sprzęt |
| Skaningowy mikroskop elektronowy | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Sprzęt |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | JEOL | JEOL 1230 | Sprzęt |
Bibliografia
- Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
- Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
- Pountos, I., Giannoudis, P. V. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
