$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC)
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Wyizolować tłuszcz okołonerkowy i najądrza szczura i przemyć go sterylnym buforowanym roztworem soli Hanka (HBSS) zawierającym 1% płodową surowicę bydlęcą (FBS), jak opisano wcześniej6.
- Zmielić tkankę i przenieść 1-2 g do 25 ml HBSS zawierającego 1% FBS do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
- Zebrać swobodnie unoszącą się warstwę tkanki tłuszczowej i przenieść do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml i potraktować 25 ml kolagenazy typu II (200 U/ml) w HBSS przez 45 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (125 obr./min).
- Ostrożnie usuń frakcję ciekłą (poniżej warstwy oleju i tłuszczu) i przefiltruj kolejno przez nylonowy filtr siatkowy 100 μm i 70 μm. Odwirować filtrat o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i dwukrotnie przemyć osad 25 ml HBSS.
- Zawiesić osad komórkowy w 50 ml pożywki wzrostowej (MesenPRO RS Basal Podłoże) uzupełnionej suplementem wzrostu MesenPRO RS, antybiotyko-przeciwgrzybiczym (100 U/ml penicyliny G, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B) oraz 2 mM L-glutaminy i komórek pipetowych do 2 kolb T75 (25 ml / kolbę).
- Hodowla ASC w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C (we wszystkich doświadczeniach stosuje się pasaż 2-4 ASC).
2. Przygotowanie mikrosfer chitozanu (CSM)
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- CSM są przygotowywane w procesie emulgowania woda w oleju wraz z techniką koacerowania jonowego przy użyciu naszego poprzedniego protokołu6. Emulgować wodny roztwór chitozanu (6 ml chitozanu 3% w/v w 0,5 M kwasie octowym) w 100 ml mieszaniny fazy olejowej składającej się z oleju sojowego, n-oktanolu (1:2 v/v) i 5% emulgatora monooleinianu sorbitanu (zakres 80), stosując jednocześnie mieszanie napowietrzne (1700 obr./min) i mieszanie magnetyczne (1000 obr./min) w przeciwnych kierunkach. Ta podwójna metoda mieszania zapewnia, że micele utworzone wcześnie przed sieciowaniem mogą pozostać w roztworze i nie osiadać na dnie. Ponadto mieszadło magnetyczne pomaga w deagregacji chitozanu podczas tworzenia i sztywnienia miceli.
- Mieszaninę miesza się w sposób ciągły przez około 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnej emulsji typu woda w oleju. Sieciowanie jonowe rozpoczyna się od dodania 1,5 ml 1% w/v wodorotlenku potasu w n-oktanolu co 15 minut przez 4 godziny (łącznie 24 ml).
- Po zakończeniu reakcji sieciowania należy powoli zdekantować fazę olejową mieszaniny zawierającej CSM i natychmiast dodać kulki do 100 ml acetonu. Umyj kulki acetonem, aż faza olejowa zostanie całkowicie usunięta.
- Wysuszyć odzyskane kulki w eksykatorze próżniowym i przeanalizować bez dalszej obróbki. Średnią wielkość cząstek CSM, pole powierzchni na miligram oraz jednostkę objętości sześciennej określono za pomocą analizatora wielkości cząstek.
- W przypadku kolejnych eksperymentów należy trzykrotnie przemyć CSM sterylną wodą, aby usunąć resztki soli i wysterylizować alkoholem bezwodnym.
3. Określanie liczby wolnych grup aminokwasowych w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Określ liczbę wolnych grup aminowych obecnych w CSM po sieciowaniu jonowym za pomocą testu kwasu trinitro benzenosulfonowego (TNBS) Bubinsa i Ofnera7. Inkubować 5 mg mikrosfer z 1 ml 0,5% roztworu TNBS w szklanej probówce o pojemności 50 ml przez 4 godziny w temperaturze 40 °C i hydrolizować z dodatkiem 3 ml 6N HCl w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
- Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i wyekstrahować wolny TNBS, dodając 5 ml wody dejonizowanej i 10 ml eteru etylowego.
- Ogrzać 5 ml porcji fazy wodnej do temperatury 40 °C w łaźni wodnej przez 15 minut w celu odparowania pozostałości eteru, schłodzić do temperatury pokojowej i rozcieńczyć 15 ml wody.
- Zmierzyć absorbancję przy długości fali 345 nm za pomocą spektrofotometru, używając roztworu TNBS bez chitozanu w stanie ślepej próby oraz chitozanu użytego do przygotowania CSM w celu określenia całkowitej liczby grup aminowych. Oszacuj liczbę wolnych grup aminowych CSM w stosunku do chitozanu.
4. Ładowanie ASC w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Zrównoważyć 5 mg wysterylizowanego CSM z sekcji 2.5 w sterylnym HBSS przez noc i dodać do wkładki z membranową płytką hodowlaną o wielkości porów 8 μm (płytka 24-dołkowa).
- Po tym, jak CSM osiądzie na membranie, ostrożnie zassać HBSS i dodać 300 μl pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki i 700 μl pożywki wzrostowej na zewnątrz wkładki.
- Zawiesić ASC w odpowiednim stężeniu (1 x 104 do 4 x 104) w 200 μl pożywki wzrostowej i wysiewać nasiona nad CSM wewnątrz wkładki płytki hodowlanej. Końcowa objętość podłoża we wkładzie hodowlanym, po wysianiu, wynosi 500 μL.
- Inkubować ASC wysiane na CSM przez 24 godziny w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
5. Określanie procentu obciążenia ASC i żywotności komórek w CSM
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Po inkubacji zebrać CSM obciążony ASC w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, nie naruszając komórek, które migrowały do membrany wkładki.
- Usunąć pozostałą pożywkę i dodać 250 μl świeżej pożywki wzrostowej do probówki.
- Do każdej probówki dodać 25 μl roztworu bromku MTT [3-(4,5-dimetylotiozolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego] (5 mg/ml) i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji usunąć pożywkę, dodać 250 μl sultlenku dimetylu i wirować mieszaninę przez 2-5 minut, aby rozpuścić kompleks formazanu.
- Odwirować CSM przy 2700 x g przez 5 minut i oznaczyć absorbancję supernatantu zmierzoną przy 570 nm, przyjmując 630 nm jako odniesienie.
- Określić liczbę komórek związaną z CSM w stosunku do wartości absorbancji uzyskanej ze znanej liczby żywotnych ASC.
6. Charakterystyka żelu kolagenowego wbudowanego w ASC-CSM
Uwaga: Wszystkie procedury zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
- Zmieszać CSM obciążony ASC (5 mg zawierające ≈ 2 x 104 komórek) z kolagenem typu 1 (7,5 mg / ml) wyekstrahowanym ze ścięgna ogona szczura zgodnie z metodą Bornsteina8 i migotać po dostosowaniu pH do 6,8 za pomocą 2 N NaOH.
- Dodać fibrylowaną mieszaninę kolagenu-ASC-CSM do 12-dołkowej płytki i inkubować przez 30 minut w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Po całkowitym migotaniu inkubować żele collagen-ASC-CSM przez okres do 14 dni w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Uwalnianie i migrację komórek z CSM do żelu obserwowano przy użyciu standardowych technik mikroskopowych.
7. Reprezentatywne wyniki
W obecnym badaniu opracowaliśmy strategię in vitro, polegającą na dostarczaniu komórek macierzystych z mikrosfer chitozanu (CSM) do rusztowania z żelu kolagenowego. Przygotowano porowaty CSM o jednolitej wielkości (175-225 μm średnicy) i składzie, a następnie wykorzystano go jako nośniki komórkowe (ryc. 2). Po inkubacji ASC z CSM, komórki przyczepiły się w stężeniu 2 x 104 komórki/5 mg CSM. Komórki były zdolne do rozprzestrzeniania się w mikrosferze, jednocześnie rozciągając filopodia do porowatych szczelin mikrosfery (ryc. 3). Po zmieszaniu naładowanego komórkami CSM z żelem kolagenowym, komórki natychmiast zaczęły migrować do żeli (ryc. 4).
Tabela 1. Biologiczne zalety stosowania chitozanu i kolagenu w systemie dostarczania komórek macierzystych.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający ogólną strategię podwójnego zastosowania rusztowań kolagenowych obciążonych ASC-CSM. Rysunki 2, 3 i 4 są oznaczone adnotacjami na schemacie, aby pomóc w interpretacji obrazów.
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie przedstawiające proces wysiewu komórek macierzystych do mikrosfer chitozanu. Proces polega na kokulturacji ASC z CSM we wkładce z membranową płytką hodowlaną o wielkości porów 8 μm. Po 24 godzinach mikrosfery są wyjmowane z wkładu i są gotowe do zatopienia w matrycy biomateriałowej.
Rysunek 3. Charakterystyka morfologiczna CSM obciążony ASC. Panel A przedstawia mikroskop świetlny CSM obciążonego ASC, podczas gdy panel B pokazuje to samo pole widzenia nałożone na obraz uzyskany za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. ASC były wstępnie załadowane kalceiną AM (zieloną). Panel C przedstawia obraz SEM niezaładowanej mikrosfery, podczas gdy panel D pokazuje komórki załadowane do mikrosfery (gwiazdki). Obraz TEM w panelu E przedstawia przekrój poprzeczny nieobciążonej mikrosfery. W całej mikrosferze znajduje się wiele porów i szczelin. Panel F przedstawia przeciętą mikrosferę z komórkami (strzałkami) przyczepionymi i rozciągającymi filopodia w szczeliny. Oryginalne powiększenia: A i B = 70X; C = 500x , D = 2 000x; E&F= 2,500x.
Rysunek 4. Migracja ASC z CSM do trójwymiarowego rusztowania kolagenowego. Panele A i B przedstawiają CSM z komórkami migrującymi z mikrosfery do macierzy kolagenowej w dniu 3 (A, strzałki). Panel B pokazuje podobną kulturę po 12 dniach. Obrazy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) są przedstawione w C, D i E. Gwiazdki w C i D pokazują mikrosferę, która została przecięta z komórkami migrującymi z mikrosfery (strzałki). Większe powiększenie panelu D jest przedstawione w panelu E i pokazuje filopodia komórkowe przyczepione do włókien kolagenowych (wstawka). Oryginalne powiększenie: A&B = 100x; C&D = 6,000x; E = 20 000x, wkładka = 150 000x.
Rysunek 5. Schemat przedstawiający szerokie zastosowania CSM w medycynie regeneracyjnej i dostarczaniu leków.