Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Podsumowanie

W niniejszym artykule wideo opisujemy zastosowanie nowego modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki wirusem prostego typu I.

Streszczenie

Zapalenie rogówki wywołane wirusem opryszczki jest jedną z najcięższych patologii związanych z wirusem opryszczki prostego typu 1 (HSV-1). Obecnie zapalenie rogówki wywołane opryszczką jest główną przyczyną ślepoty pochodzenia rogówkowego oraz ślepoty związanej z infekcjami w krajach rozwiniętych. Typowy obraz zapalenia rogówki wywołanego opryszczką obejmuje infekcję nabłonka rogówki, a niekiedy głębszych warstw zrazika i śródbłonka rogówki, co prowadzi do trwałych patologii rogówki, takich jak bliznowacenie, ścieńczenie i zmętnienie ¹.

Zakażenia rogówki wirusem HSV-1 bada się tradycyjnie w dwóch typach modeli eksperymentalnych. Model in vitro, w którym hodowane monowarstwy komórek nabłonka rogówki są zakażane w szalce Petriego, zapewnia prostotę, wysoki stopień powtarzalności, krótki czas trwania eksperymentów oraz stosunkowo niskie koszty. Z kolei model in vivo, w którym zwierzęta, takie jak króliki lub myszy, są inokulowane bezpośrednio do rogówki, oferuje wysoce zaawansowany system fizjologiczny, ale wiąże się z wyższymi kosztami, dłuższym czasem trwania badań, koniecznością opieki nad zwierzętami oraz większym stopniem zmienności.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową demonstrację nowego modelu ex vivo infekcji nabłonka rogówki wirusem HSV-1, który łączy zalety modeli in vitro oraz in vivo. Model ex vivo wykorzystuje nienaruszone rogówki utrzymywane w kulturze organotypowej i zainfekowane HSV-1. Zastosowanie modelu ex vivo pozwala na wyciąganie wniosków o wysokim stopniu zgodności fizjologicznej, a jednocześnie jest on stosunkowo tani i wymaga nakładów czasu porównywalnych z modelem in vitro.

Protokół

Wszystkie odczynniki i sprzęt zostały zakupione w formie sterylnej lub wysterylizowane przed przystąpieniem do procedury. Niniejszy artykuł opisuje etapy przygotowania modelu ex vivo, zaczynając od oczyszczonego z tkanek okołogałkowych oka. W naszych eksperymentach wykorzystujemy świeże całe gałki oczne młodych (8-12 tyg.) królików albinosów (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Ponadto stosujemy rogówki ludzkie pozyskane z lokalnego banku tkanek oka. W przypadku samodzielnego wykonywania enukleacji należy zadbać o to, aby podczas procedury nie uszkodzić rogówki ani limbusa. Protokoły enukleacji u królików można znaleźć w innej literaturze ².

Część 1: Wycięcie guzika rogówkowo-twardówkowego

1. Namocz wąski pasek gazy w PBS i owiń go wokół gałki ocznej, aby ułatwić jej trzymanie podczas procedury.
2. Za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie styczne w twardówce, około 0.5 cm od limbusa.
3. Użyj ostrych nożyczek, aby poszerzyć nacięcie i całkowicie wyciąć fragment rogówki i twardówki (tzw. guzik rogówkowo-twardówkowy).
4. Po wyizolowaniu fragmentu rogówki i twardówki, delikatnie oddziel tęczówkę, trzymając krawędź twardówki pęsetą. Należy unikać uszkodzenia śródbłonka oraz wywierania nadmiernego nacisku na rogówkę.

Część 2: Wprowadzenie rogówki do hodowli organotypowej

1. Wypreparowane rogówki hoduje się w podłożu Minimum Essential Medium (MEM) uzupełnionym o niezbędne aminokwasy (Non-Essential Amino Acids) (1X), L-glutaminę (2 mM), penicylinę (200 U/ml) oraz streptomycynę (200 μg/ml). W razie potrzeby można dodać środek przeciwgrzybiczy, np. amfoterycynę.
2. Przygotować 1% roztwór agarozy w podłożu hodowlanym i utrzymywać go w temperaturze 55 °C.
3. Dokładnie wypłukać rogówkę w sterylnym PBS zawierającym penicylinę (200 U/ml) i streptomycynę (200 μg/ml).
4. Umieścić rogówkę stroną nabłonkową do dołu w dołku sterylnej płytki z dołkami.
5. Dodać podłoże z agarozą do wklęsłości śródbłonkowej rogówki w ilości wystarczającej do jej całkowitego wypełnienia. Odczekać ok. 1 min, aż agaroza stężeje.
6. Umieścić rogówkę wraz z podtrzymującym ją rusztowaniem żelowym stroną nabłonkową do góry w 35 mm naczyniu do hodowli tkanek i dodać podłoże hodowlane tak, aby pokryło powierzchnię nabłonkową.
7. Rogówkę można w ten sposób hodować przez ponad tydzień, wymieniając podłoże co 48 hr.

Część 3: Zakażenie HSV-1 i leczenie eksperymentalnymi lekami

1. Do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm dodać 1 ml pożywki zawierającej pożądaną ilość wirusa. Zazwyczaj przeprowadzamy infekcję dawką 1x10⁴ PFU szczepu KOS HSV-1 na rogówkę. Miana naszych zapasów są określane poprzez wykonanie testów plackowych na monowarstwach komórek CV-1.
2. Umieścić rogówkę wraz z rusztowaniem agarozowym stroną nabłonkową do dołu w pożywce zawierającej wirusa.
3. Umieścić rogówkę w inkubatorze do hodowli tkanek w celu infekcji przez 1 hr, wykonując okresowe kołysanie co 10-15 min.
4. Po 1 hr odessać pożywkę zawierającą wirusa i przepłukać 2-3 razy PBS w celu usunięcia pozostałych cząsteczek wirusa.
5. Umieścić rogówkę z powrotem w poprzedniej pozycji i dodać świeżą pożywkę hodowlaną, aby pokryć powierzchnię nabłonka.
6. Zabiegi eksperymentalne można rozpocząć przed lub po infekcji, w zależności od charakteru eksperymentu.
7. Pożywkę hodowlaną wymieniać co 48 hr.

Część 4: Pobieranie próbek

1. Pożywka do analizy testu plackowego. Dokładnie wymieszać pożywkę i użyć jej natychmiast do testu plackowego lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego zastosowania w przypadku pobierania próbek w różnych punktach czasowych.
2. DNA, RNA, białka lub komórki z nabłonka rogówki
   1. Usunąć rusztowanie agarowe i dokładnie wypłukać rogówkę za pomocą PBS.
   2. Wyciąć pierścień tkanki twardówki z rogówki, aby upewnić się, że pobrany zostanie wyłącznie materiał z nabłonka rogówki.
   3. Za pomocą skalpela zeskrobać komórki nabłonka rogówki do odpowiedniego buforu, zależnie od rodzaju izolowanego materiału. Do izolacji DNA i RNA stosujemy odpowiednio zestaw DNeasy Blood & Tissue Kit oraz RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Do zbierania lizatów białkowych stosujemy bufor Laemmli. Do analizy cytometrycznej komórek nabłonka rogówki wstępnie inkubujemy rogówki w niewielkiej ilości trypsyny w celu poluzowania komórek, a następnie oddzielamy je skalpelem do trypsyny. Ponieważ skrobactwo nabłonka rogówki nie daje jednakowej ilości tkanki, ważne jest uwzględnienie odpowiednich kontroli podczas analizy próbek. W badaniach qRT-PCR jako transkrypty referencyjne wykorzystujemy 18S rRNA, w qPCR gen GAPDH jako gen referencyjny, a w analizach Western blot nukleolinę jako kontrolę ilościową (loading control).
3. Próbki tkankowe do immunohistochemii lub immunofluorescencji
   1. Usunąć rusztowanie agarowe i dokładnie wypłukać rogówkę za pomocą PBS.
   2. W zależności od celu eksperymentalnego, wykorzystać rogówkę do przygotowania bloku tkanki w parafinie lub bloku tkanki mrożonej, zgodnie z instrukcją w filmie. Przy przygotowywaniu przekrojów tkanki rogówki stosujemy standardowe procedury.

Reprezentatywne wyniki

Większość metod dostępnych do badania komórek w hodowlach tkankowych można łatwo dostosować do użytku w rogówkach zainfekowanych HSV-1 ex vivo. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki dla kilku najczęstszych technik stosowanych w badaniu infekcji HSV-1 – qPCR (Rysunek 1D), qRT-PCR (Rysunek 1B), Western blot (Rysunek 1F), test plackowy (Rysunek 1C) oraz immunofluorescencję tkankową (Rysunek 1E).

Rysunek 1. Analiza rogówek zainfekowanych HSV-1 ex vivo. (A) Schematyczny opis modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki HSV-1. (B-F) Analiza rogówek zainfekowanych metodą opisaną w niniejszym artykule wideo. Wypreparowane rogówki królicze zainfekowano dawką 1x10⁴ PFU/rogówkę szczepu KOS HSV-1 i hodowano w obecności (PAA) lub w przypadku kontroli (Mock) wobec braku kwasu fosfonooctowego (400 μg/ml), znanego inhibitora replikacji HSV. (B) Całkowite RNA pobrano w określonych punktach czasowych, a transkrypcję wirusową oceniono metodą qRT-PCR z użyciem starterów dla polimerazy HSV-1. Jako referencję zastosowano startery przeciwko 18S rRNA. n=3. Słupki błędów oznaczają ± SEM. (C) Po 48 hpi pobrano pożywkę hodowlaną, a produkcję cząsteczek zakaźnych oceniono za pomocą testu plackowego na monowarstwach CV-1. (D) Po 48 hpi pobrano całkowite DNA, a replikację genomu wirusa oceniono w teście qPCR z użyciem starterów dla genomu HSV-1. Jako referencję zastosowano startery przeciwko GAPDH. n=3. Słupki błędów oznaczają ± SEM. (E) Rogówki z grupy kontrolnej (Mock) zamrożono gwałtownie po 48 hpi, wykonano ich przekroje i przeanalizowano metodą pośredniej immunofluorescencji pod kątem obecności wczesnego białka wirusowego (ICP8) w zainfekowanym nabłonku. Jądra komórkowe wybarwiono Höchst 33258. (F) Lizaty białkowe pobrano po 48 hpi, a ekspresję białka wirusowego (ICP0) oceniono za pomocą metody Western blot. Do zapewnienia równego obciążenia próbek wykorzystano test BCA. hpi = godziny po infekcji.

Dyskusja

W niniejszym artykule wideo opisujemy metodę badania ostrej infekcji nabłonka rogówki przez HSV-1 w modelu ex vivo. Model ten stanowi przydatny etap pośredni między modelami in vitro a in vivo, ponieważ umożliwia fizjologicznie dokładną walidację wyników uzyskanych w hodowlach komórkowych, a tym samym ogranicza liczbę koniecznych eksperymentów na zwierzętach. Ponadto model ex vivo stwarza wyjątkową i nieocenioną okazję do badania infekcji herpesem nabłonka w nienaruszonych rogówkach

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Minimum Essential Medium (MEM)	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Niezbędne aminokwasy niekluczowe (roztwór 100x)	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-Glutamina	Mediatech, Inc.	25-005-CI
Sód penicyliny G	Sigma-Aldrich	P3032
Siarczan streptomycyny	Sigma-Aldrich	S9137
Agaroza	Invitrogen	15510-027
Bufor fosforanowo-solny (PBS)	Przygotowano w laboratorium	N/A
Trypsyna EDTA (1x)	Mediatech, Inc.	25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Bufor Laemmliego	Przygotowano w laboratorium	N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Tissue-Tek	4583
Całe oczy królika (młode)	Pel-Freez Biologicals	41211-2
Ludzkie rogówki i całe oczy	Lokalny dostawca	N/A
Porcelanowa płytka do nakraplania 12-dołkowa	Avogadro’s Lab Supply	1877
Szalka do hodowli tkanek 35 mm	Falcon BD	353001
6-dołkowa płytka do hodowli komórek	Greiner Bio-One	657160
Krioforma (Cryomold) Intermediate	Tissue-Tek	4566