Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji mikrowstrzykiwanych cząsteczek i ich eukariotycznych celów subkomórkowych

Podsumowanie

Technika CLEM została dostosowana do analizy ultrastrukturalnej morfologii błon, organelli i struktur subkomórkowych, na które wpływają mikroiniekcyjne cząsteczki. Metoda ta łączy w sobie potężne techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii elektronowej, aby umożliwić rozdzielczość od milimetrowej do wielonanometrowej. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań.

Streszczenie

Komórka eukariotyczna opiera się na złożonych, wysoce regulowanych i funkcjonalnie odrębnych przedziałach związanych z błoną, które zachowują biochemiczną polarność niezbędną do prawidłowego funkcjonowania komórki. Zrozumienie, w jaki sposób enzymy, białka i składniki cytoszkieletu rządzą i utrzymują tę biochemiczną segregację, ma zatem ogromne znaczenie. Zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek do lokalizacji i/lub zaburzania przedziałów subkomórkowych przyniosło bogactwo wiedzy i pogłębiło naszą wiedzę na temat regulacji komórkowej. Techniki obrazowania, takie jak mikroskopia fluorescencyjna i konfokalna, sprawiają, że ustalenie pozycji fluorescencyjnie znakowanej małej cząsteczki jest stosunkowo proste, jednak rozdzielczość bardzo małych struktur jest ograniczona ¹.

Z drugiej strony, mikroskopia elektronowa ujawniła szczegóły morfologii subkomórkowej w bardzo wysokiej rozdzielczości, ale jej statyczna natura utrudnia pomiar wysoce dynamicznych procesów z precyzją ^2,3. Tak więc połączenie mikroskopii świetlnej z mikroskopią elektronową tej samej próbki, nazwane korelacyjną mikroskopią światła i elektronową (CLEM) ^4,5, zapewnia podwójne korzyści ultraszybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością mikroskopii elektronowej ⁶. Ta potężna technika została wdrożona do badania wielu aspektów biologii komórki ^5,7. Od samego początku procedura ta zwiększyła naszą zdolność do rozróżniania architektur subkomórkowych i morfologii w wysokiej rozdzielczości.

Tutaj prezentujemy uproszczoną metodę wykonywania szybkiej mikroiniekcji, a następnie CLEM (Rys. 1). Procedura mikroiniekcji CLEM może być stosowana do wprowadzania określonych ilości małych cząsteczek i/lub białek bezpośrednio do cytoplazmy komórek eukariotycznych i badania efektów od rozdzielczości milimetrowej do wielonanometrowej (ryc. 2). Technika ta opiera się na mikroiniekcji komórek wyhodowanych na laserowo trawionych szkiełkach nakrywkowych z siatką przymocowanych do dna naczyń z żywymi komórkami i obrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Lokalizacja komórki (komórek) będącej przedmiotem zainteresowania jest ułatwiona dzięki wzorowi siatki, który można łatwo przenieść, wraz z interesującymi komórkami, na żywicę Epon używaną do immobilizacji próbek i sekcji przed analizą mikroskopową (ryc. 3). Nakładanie obrazów fluorescencyjnych i elektromagnetycznych pozwala na określenie lokalizacji subkomórkowej oraz wszelkich zmian morfologicznych i/lub ultrastrukturalnych wywołanych przez badaną cząsteczkę mikroiniekcji (ryc. 4). Technika ta jest podatna na punkty czasowe od ≤5 s do kilku godzin, w zależności od charakteru mikrowstrzykiwanej próbki.

Protokół

1. Hodowla komórek ssaków

1. Normalna nerka szczura (NRK), unieśmiertelniony rak szyjki macicy (HeLa) lub inne odpowiednie linie komórkowe ssaków są hodowane w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , na szkiełkach nakrywkowych z siatki fototrawionej przymocowanych do szalek z żywymi komórkami (patrz Tabela 1 dla każdego odczynnika lub aparatury używanej w tym protokole) w DMEM + 10% FBS i 1% Pen / Strep. Należy podjąć środki ostrożności w celu utrzymania sterylnego środowiska podczas pracy z hodowanymi komórkami ssaków.
2. W zależności od osi czasu eksperymentu (0-5 godzin vs 1-2 dni po wstrzyknięciu) zbieg komórek powinien być dostosowany odpowiednio do ~50% lub ~25%.

2. Mikroiniekcja

1. Przygotuj pożądane białko, DNA lub małe cząsteczki w wybranym buforze, w zależności od jego podatności na hodowlę komórkową, do końcowej objętości ~50 μl. Do mikrowstrzykiwanych komórek dołącza się obojętne barwniki fluorescencyjne, takie jak Texas Red lub Cascade Blue; Wybór barwnika iniekcyjnego i sondy fluorescencyjnej powinien mieć nienakładające się na siebie długości fal wzbudzenia i emisji. Stężenie cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania potrzebnej do mikroiniekcji należy określić empirycznie, a fluorescencyjne barwniki śledzące są powszechnie stosowane w stężeniu 0,5-1,0 mg / ml. Zazwyczaj rodamina lub inny fluorofor jest kowalencyjnie przyłączany do interesującej Cię cząsteczki za pomocą komercyjnego zestawu, jednak w zależności od czułości można zastosować inne metody wykrywania. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Krytyczne zagadnienia poniżej.
2. Przefiltrować wtryskiwacz (~50 μl) przez filtr odśrodkowy 0,22 μm. Filtry odśrodkowe są preferowane w stosunku do filtracji próżniowej i/lub strzykawkowej, które mają powiązane martwe objętości.
3. Aby wytworzyć igłę do mikroiniekcji, pipety ze szkła borokrzemianowego są wyciągane za pomocą flamingowo-brązowego ściągacza do mikropipet zgodnie z wytycznymi producenta. Alternatywnie, igły do mikroiniekcji można kupić u dostawców, w tym od Eppendorf, który produkuje igły do mikroiniekcji femtotip.
4. Ostrożnie odpipetować 4 μl iniekcji do nieuszkodzonej końcówki igły do mikroiniekcji za pomocą Eppendorf 20 Femtotips. Upewnij się, że w wyciągniętej igle do mikroiniekcji nie ma pęcherzyków powietrza. Załaduj igłę do mikroiniekcji do ramienia mikromanipulatora wstrzykiwacza Eppendorf FemptoJet Injectman podłączonego do mikroskopu odwróconego. Aby uzyskać dobrą recenzję procedury mikroiniekcji, czytelnik jest kierowany do poprzedniego artykułu ⁸ Journal of Visualized Experiments.
5. Umieść naczynie z żywymi komórkami ze szkiełkiem nakrywkowym w kratkę i hodowanymi komórkami w uchwycie naczynia odwróconego mikroskopu Zeiss. Znajdź komórki rosnące w blaszce fototrawionej i zanotuj alfanumeryczny identyfikator siatki, który będzie używany we wszystkich kolejnych krokach. Najlepiej umieścić komórki na środku szkiełka nakrywkowego, ponieważ kolejne kroki ograniczą przenoszenie próbki na krawędziach szkiełka nakrywkowego.
6. Ręcznie opuść ramię iniekcyjne na miejsce nad szkiełkiem nakrywkowym i za pomocą joysticka mikromanipulatora i elementów sterujących, opuść igłę iniekcyjną w dół, aż końcówka delikatnie dotknie powierzchni hodowanych komórek i naciśnij 'Limit, aby zapobiec przemieszczaniu się igły poza ten punkt, a tym samym pękaniu delikatnego ciągniętego szkła borokrzemianowego. Wszystkie inne aspekty mikroiniekcji komórek są wykonywane zgodnie z instrukcją obsługi Eppendorf FemtoJet InjectMan. Technika mikroiniekcji została niedawno wykorzystana do zrozumienia poszczególnych wydzielanych białek wirulencji przez bakterie ⁹.
7. Mikrowstrzyknij co drugą komórkę w wybranej siatce. Przy komórkach rosnących w ~50% konfluencji, można spodziewać się ~80 komórek na siatkę 600^μm2 (przykład pokazany na rys. 3A). Dlatego po kontroli fluorescencji i mikroskopii elektronowej będzie n ~ 30-40 komórek eksperymentalnych i kontrolnych.
8. Umieść naczynie z żywymi komórkami z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek ssaków na żądany czas, zgodnie z konfiguracją doświadczalną. Alternatywnie można przejść bezpośrednio od mikroiniekcji do analizy mikroskopii poklatkowej, aby poczekać na pojawienie się określonych struktur subkomórkowych przed utrwaleniem.

3. Mikroskopia fluorescencyjna

1. W razie potrzeby należy wykonać poklatkowe pomiary fluorescencji żywych komórek mikrowstrzykniętych, po czym zastąpić pożywkę 2,5% aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,4) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli jednak pomiary żywych komórek nie są wymagane, wyrzuć pożywkę do wzrostu komórek i utrwal komórki 5 ml 3,7% formaldehydu w 1xPBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odrzucić utrwalacz i zastąpić go 5 ml 1xPBS, przejść do kroku 3.2. Uwaga: bardzo ważne jest, aby nie dodawać aldehydu glutarowego do czasu zakończenia mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Umieść miskę z żywymi komórkami z blaszką nakrywkową z blaszką fototrawioną w kratkę w mikroskopie fluorescencyjnym (konfokalne nie jest wymagane na tym etapie) i zbierz 5-10 obrazów w jasnym polu i obrazów fluorescencyjnych odpowiedniej siatki, aby udokumentować układ komórek (ryc. 4A). Zidentyfikuj te komórki, które zostały mikrowstrzyknięte, używając długości fal wzbudzenia i emisji obojętnego barwnika iniekcyjnego (ryc. 4B). Istotne jest uzyskanie obrazów w różnych powiększeniach (np. 10x i 65x), aby ułatwić identyfikację mikroiniekowanych komórek w kolejnych etapach z udziałem mikroskopii elektronowej.
3. Za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego zbierz stos Z mikrowstrzykniętych komórek w siatce określonej w kroku 2.5 powyżej. Duże powiększenie (100x) jest potrzebne do skorelowania obrazów fluorescencyjnych ze strukturami subkomórkowymi, które zostaną zidentyfikowane w mikroskopii elektronowej.
4. Szkiełka nakrywkowe usuwa się z dna szalek z żywych komórek za pomocą dostępnego w handlu płynu do usuwania szkiełek nakrywkowych i umieszcza się komórką do góry w naczyniu do hodowli komórek pierwotnych zawierającym 5 ml 1xPBS. Szkiełko nakrywkowe jest następnie przetwarzane do mikroskopii elektronowej, jak opisano poniżej.

4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa

1. Zastąp bufor 1xPBS 2 ml 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,4) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dłuższa inkubacja, choć nie jest konieczna, pomoże w utrzymaniu struktur subkomórkowych. Uwaga: sam formaldehyd nie jest wystarczającym utrwalaczem do analizy EM.
2. Usunąć komórki utrwalające i barwiące z dodatkiem 2 ml 1% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanu przez 30 minut, a następnie trzykrotnie przepłukać buforem kakodylanu i na koniec zastąpić cały bufor ddH₂O.
3. Postępując zgodnie ze standardowymi protokołami EM, odwodnić próbkę w stopniowanej (od 70% do 100%) serii etanolu. Przygotuj żywicę Epon i umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na probówce wypełnionej żywicą epon. Pozostawić polimeryzację na 24 godziny w temperaturze 60°C. Umieszczając blaszkę nakrywkową w siatce fototrawioną stroną z komórką do dołu na żywicy Epon, zarówno interesujące komórki, jak i wzór siatki są przenoszone na żywicę Epon podczas polimeryzacji (przykład pokazany na rys. 3B).
4. Usuń szkiełka nakrywkowe z żywicy Epon, szybko zanurzając je w ciekłym azocie i/lub wrzącej wodzie. Sprawdź powierzchnię żywicy pod lornetką do preparacji, aby zlokalizować interesującą nas siatkę (uwaga: wzór siatki zostanie przeniesiony jako odbicie lustrzane). Za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela przytnij blok Epon tak, aby tylko siatka zainteresowania znajdowała się na wierzchołku bloku żywicy epon.
5. Za pomocą ultramikrotomu należy uzyskać seryjne odcinki przyciętego bloku o żądanej grubości (grubość ~70 nm dla konwencjonalnego TEM i grubość ~250 nm dla tomograficznego TEM). Skontrastuj skrawki z octanem uranylu i cytrynianem ołowiu zgodnie ze standardowymi protokołami.

5. Korelacyjny mikroskop świetlny i elektronowy

1. Przenieś interesujące komórki w mikroskopie elektronowym, korzystając z obrazów uzyskanych we wcześniejszych krokach. Po zlokalizowaniu interesujących nas mikrowstrzykniętych komórek użyj konfokalnych obrazów fluorescencyjnych o wysokiej rozdzielczości, aby zidentyfikować obszary w komórce, które były interesujące. Zobrazuj je w wysokiej rozdzielczości za pomocą TEM. Użyj punktów orientacyjnych, takich jak obrzeża komórki i otoczka jądrowa, aby określić, który fluorescencyjny obraz stosu z odpowiada wycinkowi EM.
2. Korzystając z wybranego programu do obrazowania (np. Image J, Adobe Photoshop itp.), zmniejsz krycie obrazu fluorescencyjnego do 50% i nałóż go na obraz TEM, z którym jest związany. Wyrównaj obrazy, dostosowując skalę (pamiętaj o zachowaniu proporcji) i obrót obrazu konfokalnego, aby dopasować go do obrazu TEM. Precyzyjna regulacja kontrastu, ostrości itp. na obrazie fluorescencyjnym może pomóc w wyrównaniu. Uwaga: odkryliśmy, że heterochromatyna, otoczka jądrowa i obrzeża komórki stanowią doskonałe punkty orientacyjne, które pomagają w orientacji tych dwóch obrazów.

6. Uwagi krytyczne

1. Aby znacznie pomóc w zlokalizowaniu wstrzykniętej małej cząsteczki, znacznik fluorescencyjny, taki jak rodamina lub fluoresceina, może być kowalencyjnie przymocowany za pomocą dostępnych na rynku zestawów. Dodatkowe informacje uzyskuje się poprzez ektopową ekspresję fluorescencyjnego subkomórkowego białka markerowego przed mikroiniekcją. Dlatego ważny jest wybór fluoroforów i obojętnego barwnika śledzącego mikroiniekcje.
2. Do mikroiniekcji należy wybierać komórki, które przylegają do środka szkiełka nakrywkowego i unikać wybierania siatki blisko krawędzi. To przedstawi największe prawdopodobieństwo, że interesujące komórki zostaną przeniesione do żywicy Epon używanej do mikroskopii elektronowej.
3. Zbieg komórek jest ważny, ponieważ w pełni zlewająca się płytka bardzo utrudni identyfikację mikroiniekowanych komórek w mikroskopie elektronowym. Raczej komórki nasienne tak, że osiągają ~50% konfluencji w dniu krótkiego eksperymentu, lub ~25% konfluencji w dniu dłuższego (1-2 dniowego) eksperymentu. Wykorzystaj położenie i kształt komórek, a także pustą przestrzeń jako punkty orientacyjne, aby zorientować obraz mikroskopii elektronowej.
4. Grubość konfokalnego plastra optycznego powinna być dostosowana do potrzeb eksperymentu i dlatego powinna być wyznaczona empirycznie ¹⁰.
5. Utrwalacze formaldehyd i aldehyd glutarowy powinny być najwyższej dostępnej jakości. Formaldehyd utrwala komórki, zachowując jednocześnie właściwości fluorescencyjne zarówno białek, jak i małych cząsteczek fluorescencyjnych (takich jak rodamina lub FITC). Nie zachowa jednak struktur, które umożliwią wysoką rozdzielczość EM. Aldehyd glutarowy w wysokim stopniu zachowuje błony i struktury subkomórkowe do analizy EM, ale znacznie utrudnia fluorescencję. Dlatego dwuetapowa fiksacja ma kluczowe znaczenie zarówno dla mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektromagnetycznej. Etap wiązania formaldehydu można pominąć w przypadku wykonywania pomiarów żywych komórek, ponieważ końcowe utrwalanie można przeprowadzić przez obróbkę aldehydem glutarowym.

7. Reprezentatywne wyniki

Ta procedura daje możliwość dostarczenia interesującej cząsteczki bezpośrednio do eukariotycznej cytoplazmy komórkowej i monitorowania jej lokalizacji i/lub wpływu na architekturę komórkową i organellerową od milimetrowej do wielonanometrowej rozdzielczości. Schematyczną ilustrację konfiguracji i procedury doświadczalnej przedstawiono na rysunku 2. Technika ta polega na mikroiniekcji komórek wyhodowanych na szkiełku nakrywkowym z laserowo trawionym szkłem (ryc. 3A), które po mikroskopii konfokalnej jest w stanie przenieść zarówno interesujące komórki, jak i wzór siatki do żywicy Epon (ryc. (zob. pkt 3B).

Typowa procedura mikroiniekcji CLEM daje obrazy fluorescencyjne i mikrofotografie elektronowe, które po skorelowaniu pozwalają zarówno na lokalizację subkomórkową, jak i analizę ultrastrukturalną. Komórkom wyhodowanym na szkiełku nakrywkowym z siatką fototrawioną w kratkę wstrzykuje się mikroiniekcję interesującej ich cząsteczki, po czym uzyskuje się obrazy w jasnym polu (ryc. 4A). Obojętny barwnik śledzący jest wprowadzany w celu odróżnienia komórek mikroiniekowanych od komórek bez mikroiniekcji (ryc. 4B). Konfokalne stosy z uzyskuje się za pomocą fluoroforu lub innego identyfikatora dołączonego do mikroiniekcji małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania (ryc. 4C). Próbka jest utrwalana aldehydem glutarowym i przetwarzana do mikroskopii elektronowej. Mikrofotografie elektronowe są uzyskiwane i nakładane na komórki, którym odpowiadają (ryc. 4D). Obszary, w których występują sygnały fluorescencyjne, są badane bardziej szczegółowo przy większym powiększeniu (rys. 4E).

Rysunek 1. Kalendarium zabiegu mikroiniekcji CLEM. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej, pomiary mikroiniekcji i fluorescencji mogą być wykonane tego samego dnia. Przygotowanie próbki do mikroskopii elektronowej jest najbardziej czasochłonne ze względu na długie etapy inkubacji i trwa 2-3 dni. Analizę TEM i korelację sygnałów fluorescencyjnych z obrazami z mikroskopii elektronowej można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.

Rysunek 2. Ogólna ilustracja procedury mikroiniekcji CLEM. Krok 1: Zlokalizuj komórki rosnące na szkiełku nakrywkowym z laserowo trawioną szkłem i mikroiniekcji cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Krok 2: Uchwyć zarówno obrazy w jasnym polu, jak i konfokalne fluorescencyjne stosy komórek z mikrowstrzykniętymi mikroiniekcjami. Krok 3: Przygotuj szkiełko nakrywkowe do analizy EM i zatop w żywicy Epon. Korzystając z przeniesionego wzoru siatki, przytnij blok tak, aby interesujące komórki znajdowały się na wierzchołku. Krok 4: Wycinaj odcinki szeregowe za pomocą ultramikrotomu. Krok 5: Skoreluj obrazy fluorescencyjne z obrazami EM.

Rysunek 3. Wzór siatki ułatwia identyfikację interesujących komórek. Panel A przedstawia mikroiniekcję komórek wyhodowanych do ~50% zbieżności; zwróć uwagę na identyfikator siatki aK. Podziałka wynosi 100 μm. Panel B pokazuje przeniesiony wzór siatki z szkiełka nakrywkowego na spolimeryzowany blok żywicy Epon, który zostanie przecięty szeregowo po zidentyfikowaniu siatki zainteresowania w mikroskopie preparacyjnym. Panel C pokazuje przeniesiony wzór siatki w ramach przygotowań do przekroju. Zwróć uwagę, że przenoszony wzór siatki jest odwrócony na bloku żywicy; Podziałka wynosi 1200 μm.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji, korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej. Panel A przedstawia mikrofotografię w jasnym polu komórek NRK rosnących na laserowo trawionym szkiełku nakrywkowym z siatką; strzałki wskazują dwie komórki, które są wizualizowane przez CLEM w panelach C-D. Panel B pokazuje fluorescencję obojętnego barwnika śledzącego, w tym przypadku Cascade Blue, używanego do identyfikacji komórek, które zostały mikrowstrzyknięte. Panel C pokazuje nakładanie się jasnego pola i sygnaturę fluorescencyjną małej cząsteczki znakowanej rodaminą. Dwie pokazane tutaj komórki są oznaczone strzałkami w panelach A i B. Panel D reprezentuje CLEM jasnego pola, mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej; grot strzałki wskazuje punkt fluorescencyjny zobrazowany w większym powiększeniu w panelu E. Podziałki są następujące: Panele A i B, 100 μm; C & D, 50 μm; E, 100 nm.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda umożliwia bezpośrednie dostarczanie oczyszczonych białek, kwasów nukleinowych lub małych cząsteczek do cytoplazmy eukariotycznej i zapewnia analizę w ultra wysokiej rozdzielczości dzięki korelacji mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Zastosowanie tej metody jest proste, ale solidne i może być wykonywane we własnym zakresie przy użyciu wielu istniejących obiektów podstawowych i/lub odpowiednio wyposażonych laboratoriów mikroskopii elektronowej. Technika ta jest również podatna na żywe ko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fot– Szkiełko nakrywkowe i płytka z żywymi komórkami	MatTek Corp.	P35G-2-14-CGRD
Texas Red	Invitrogen	D3329
Cascade Blue	Invitrogen	D7132
Zestaw do etykietowania rodaminy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53002
0,22 μ m Jednostka filtracji odśrodkowej	EMD Pipety	UFC30GV00
	Sutter Instrument Co.	BF100-50-10
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Użyj programu #4 po wykonaniu testu rampy
System mikroiniekcji FemtoJet	Eppendorf	Injectman NI2
Płyn do usuwania szkiełek nakrywkowych	MatTek Corp.	PDCF OS 30
Transmisyjny mikroskop elektronowy Technai	FEI	Technai G2 BioTWIN Ultramicrotombe
	Leica Microsystems	EM UC6