$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Komórka eukariotyczna opiera się na złożonych, wysoce regulowanych i funkcjonalnie odrębnych przedziałach związanych z błoną, które zachowują biochemiczną polarność niezbędną do prawidłowego funkcjonowania komórki. Zrozumienie, w jaki sposób enzymy, białka i składniki cytoszkieletu rządzą i utrzymują tę biochemiczną segregację, ma zatem ogromne znaczenie. Zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek do lokalizacji i/lub zaburzania przedziałów subkomórkowych przyniosło bogactwo wiedzy i pogłębiło naszą wiedzę na temat regulacji komórkowej. Techniki obrazowania, takie jak mikroskopia fluorescencyjna i konfokalna, sprawiają, że ustalenie pozycji fluorescencyjnie znakowanej małej cząsteczki jest stosunkowo proste, jednak rozdzielczość bardzo małych struktur jest ograniczona 1.
Z drugiej strony, mikroskopia elektronowa ujawniła szczegóły morfologii subkomórkowej w bardzo wysokiej rozdzielczości, ale jej statyczna natura utrudnia pomiar wysoce dynamicznych procesów z precyzją 2,3. Tak więc połączenie mikroskopii świetlnej z mikroskopią elektronową tej samej próbki, nazwane korelacyjną mikroskopią światła i elektronową (CLEM) 4,5, zapewnia podwójne korzyści ultraszybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością mikroskopii elektronowej 6. Ta potężna technika została wdrożona do badania wielu aspektów biologii komórki 5,7. Od samego początku procedura ta zwiększyła naszą zdolność do rozróżniania architektur subkomórkowych i morfologii w wysokiej rozdzielczości.
Tutaj prezentujemy uproszczoną metodę wykonywania szybkiej mikroiniekcji, a następnie CLEM (Rys. 1). Procedura mikroiniekcji CLEM może być stosowana do wprowadzania określonych ilości małych cząsteczek i/lub białek bezpośrednio do cytoplazmy komórek eukariotycznych i badania efektów od rozdzielczości milimetrowej do wielonanometrowej (ryc. 2). Technika ta opiera się na mikroiniekcji komórek wyhodowanych na laserowo trawionych szkiełkach nakrywkowych z siatką przymocowanych do dna naczyń z żywymi komórkami i obrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Lokalizacja komórki (komórek) będącej przedmiotem zainteresowania jest ułatwiona dzięki wzorowi siatki, który można łatwo przenieść, wraz z interesującymi komórkami, na żywicę Epon używaną do immobilizacji próbek i sekcji przed analizą mikroskopową (ryc. 3). Nakładanie obrazów fluorescencyjnych i elektromagnetycznych pozwala na określenie lokalizacji subkomórkowej oraz wszelkich zmian morfologicznych i/lub ultrastrukturalnych wywołanych przez badaną cząsteczkę mikroiniekcji (ryc. 4). Technika ta jest podatna na punkty czasowe od ≤5 s do kilku godzin, w zależności od charakteru mikrowstrzykiwanej próbki.