Artykuł metodologiczny

Cytometria przepływowa z użyciem zablokowanych kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (LNA flow-FISH): metoda detekcji bakteryjnych małych RNA

27K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3655

⸱

10 stycznia 2012

 , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano nową metodę wysokoprzepustową, która umożliwia detekcję i względną kwantyfikację ekspresji małego RNA oraz mRNA z pojedynczych komórek bakteryjnych przy użyciu sond z zablokowanymi kwasami nukleinowymi oraz cytometrii przepływowej połączonej z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ.

Streszczenie

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) jest potężną techniką stosowaną do wykrywania i lokalizacji specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych w środowisku komórkowym. W celu zwiększenia przepustowości metodę FISH można połączyć z cytometrią przepływową (flow-FISH), co umożliwia wykrywanie docelowych sekwencji kwasów nukleinowych w tysiącach poszczególnych komórek. W rezultacie flow-FISH oferuje wyraźną przewagę nad metodami wykrywania kwasów nukleinowych opartymi na lizatach lub analizach zbiorczych, ponieważ każda komórka jest traktowana jako niezależna obserwacja, co pozwala na przeprowadzenie silniejszych analiz statystycznych i analizy wariancji. Cechy te sprawiły, że metody FISH i flow-FISH znajdują zastosowanie w wielu różnych obszarach, a ich użyteczność została z powodzeniem wykazana w określaniu długości telomerów1,2, identyfikacji komórkowej i ekspresji genów3,4, monitorowaniu replikacji wirusów w zainfekowanych komórkach5 oraz w analizie i enumeracji społeczności bakteryjnych6.

Tradycyjnie specyficzność metod FISH i flow-FISH była zapewniana przez oligonukleotydowe sondy DNA. Jednakże w ostatnim czasie zastąpienie oligonukleotydowych sond DNA analogami kwasów nukleinowych w roli sond FISH i flow-FISH zwiększyło zarówno czułość, jak i specyficzność obu technik, co wynika z wyższych temperatur topnienia (Tm) tych analogów w odniesieniu do naturalnych kwasów nukleinowych7,8. Sondy LNA (Locked Nucleic Acid) są rodzajem analogów kwasów nukleinowych, które zawierają nukleotydy LNA rozmieszczone w sekwencji DNA lub RNA9,10. Wykazano wcześniej, że w połączeniu z metodą flow-FISH sondy LNA przewyższają konwencjonalne sondy DNA7,11 i zostały one z sukcesem wykorzystane do wykrywania eukariotycznego mRNA12 oraz viralnego RNA w komórkach ssaków5.

W niniejszej pracy rozszerzamy te możliwości i opisujemy metodę LNA flow-FISH, która pozwala na swoistą detekcję RNA w komórkach bakteryjnych (Rysunek 1). W szczególności interesuje nas detekcja małych niekodujących RNA regulacyjnych (sRNA), które w ostatnich latach wzbudziły znaczne zainteresowanie, ponieważ stwierdzono, że pełnią one rolę kluczowych elementów regulacyjnych w wielu krytycznych procesach komórkowych13. Jednak narzędzia do badania sRNA są ograniczone, a trudności w wykrywaniu sRNA w komórkach bakteryjnych wynikają częściowo z ich stosunkowo niewielkiego rozmiaru (zazwyczaj od 50 do 300 nukleotydów długości) i niskiej liczności cząsteczek sRNA, a także z ogólnych trudności w pracy z małymi komórkami biologicznymi o zróżnicowanych błonach komórkowych. W tej metodzie opisujemy warunki fiksacji i permeabilizacji, które zachowują strukturę komórek bakteryjnych i umożliwiają penetrację sond LNA, a także etapy amplifikacji sygnału, które pozwalają na swoistą detekcję sRNA o niskiej liczności (Rysunek 2).

Protokół

1. Sondy LNA i projekt eksperymentu

  1. Zaprojektuj sondy LNA będące odwrotnymi komplementami transkrybowanego sRNA/mRNA lub zamów ich projekt na stronie www.exiqon.com. W przypadku skorzystania z opcji projektu na zamówienie, sekwencja będzie znana, ale wzór rozmieszczenia modyfikacji LNA nie. Dodanie każdego resztu LNA do oligonukleotydu DNA lub RNA powoduje wzrost Tm o wartość od 2 do 10 °C dla dupleksu hybrydyzacyjnego LNA-RNA14. Idealnie zaprojektowane sondy LNA powinny mieć długość od 20 do 25 nukleotydów (dłuższe sondy są trudniejsze do syntezy) i Tm w zakresie 85-90 °C dla hybrydyzacji z RNA.
  2. Po zaprojektowaniu sekwencji użyj BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi lub porównaj sekwencję sondy z lokalną bazą danych, aby upewnić się, że sonda jest specyficzna wyłącznie dla badanego sRNA/mRNA.
  3. Zamawiając sondę LNA, dodaj modyfikację biotin-TEG na końcu 5' oligonukleotydu LNA. Biotynylacja jest niezbędna do barwienia po hybrydyzacji za pomocą koniugatu streptawidyna-barwnik. Jeśli jest to konieczne, modyfikację tę można dodać na końcu 3', jednak dodanie jej na końcu 5' jest tańsze i powinno zapewnić wyższe wydajności.
  4. W metodzie należy uwzględnić trzy kontrole negatywne: (i) kontrolę „bez LNA”, w której podczas etapu hybrydyzacji nie dodaje się sondy LNA, (ii) kontrolę „bez barwnika”, w której sonda LNA hybrydyzuje z docelowym sRNA, ale zdarzenie hybrydyzacji nie jest wykrywane z powodu braku barwnika fluorescencyjnego, oraz (iii) kontrolę „sRNA/mRNA nieekspresyjnego”, w której wykorzystuje się sondę LNA celującą w nieistniejące lub nieekspresyjne sRNA w celu monitorowania hybrydyzacji niespecyficznej.
  5. Specyficzna sonda LNA użyta w tym przypadku jest komplementarna do sRNA CsrB i ma sekwencję 5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3' (monomery LNA zapisano wielkimi literami).
  6. Po otrzymaniu liofilizowanego LNA, rozpuść go w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 50 μg/mL i przechowuj w alikwotach 10-20 μL w temperaturze -20 °C.

Roztwory

  • 8% paraformaldehyd (pfa), 10% kwas octowy w PBS: zmieszać 1 mL 32% pfa, 400 μL kwasu octowego, 400 μL 10X PBS, pH = 7.4 oraz 2,2 mL wody wolnej od nukleaz. W przypadku mrożenia, przygotować jednorazowe alikwoty w temperaturze -20°C bez dodatku kwasu octowego.
  • 60% roztwór siarczanu dekstranu: dodać 6,0 g siarczanu dekstranu do 50 mL probówki stożkowej i dopełnić wodą do końcowej objętości 10 mL. Podgrzewać mieszaninę w kąpieli wodnej do 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia siarczanu dekstranu (może to zająć 1-2 h). W trakcie procesu rozpuszczania może być konieczne dodanie dodatkowej wody w celu utrzymania objętości 10 mL. Rozdzielić 60% roztwór siarczanu dekstranu na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

2. Fixacja

  1. Zabierz 1x108 komórek bioluminescencyjnych Vibrio campbellii lub badanych bakterii i przenieś je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Ta ilość komórek zapewnia wystarczający materiał wyjściowy dla czterech próbek flow-FISH (jednej próbki ze specyficzną sondą LNA i trzech kontroli negatywnych). Należy zebrać dodatkowe alikwoty do probówek 1,5 mL, jeśli konieczne jest przetestowanie innych gatunków sRNA/mRNA.
  2. Osadź komórki bakteryjne przez wirowanie przy 2300 x g przez pięć minut. Usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj komórki w 400 μL 1X PBS.
  3. Do mieszaniny dodaj 400 μL roztworu 8% paraformaldehydu (pfa) i 10% kwasu octowego w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (1X PBS), wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 25 °C, mieszając raz po pięciu minutach. Wszystkie inkubacje, chyba że zaznaczono inaczej, przeprowadzane są w ogrzewanym stojaku na probówki. Roztwór pfa powinien być przygotowany na świeżo lub użyty z zamrożonych alikwotów po dodaniu kwasu octowego. Paraformaldehyd jest utrwalaczem sieciującym, który pomaga zachować morfologię komórek i zatrzymać wewnątrzkomórkowe RNA.
  4. Osadź komórki z tej mieszaniny przez wirowanie przy 4500 x g przez dwie minuty i usuń nadsącz za pomocą pipety. Wszystkie kolejne kroki wymagające wirowania powinny być wykonywane przy tych samych ustawieniach (7K, 2 min). Należy pamiętać, że po wirowaniu nadsącze powinno być usuwane za pomocą pipety, a nie przez zlanie.
  5. Przemyj komórki dwukrotnie 400 μL 1X PBS i resuspenduj końcowy osad komórkowy w 400 μL 1X PBS. Komórki są teraz utrwalone i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w 400 μL 1X PBS do siedmiu dni.

3. Obróbka piroWEglanem dwuetylowym

  1. Przygotować 400 μL 0,1% roztworu piroweglanu diethylu (DEPC) w 1X PBS (do każdej próbki przeznaczonej do badania wymagane jest 400 μL tego roztworu, należy zatem odpowiednio przeskalować objętość). Roztwór DEPC należy przygotować na świeżo z roztworu zapasowego DEPC. Obróbka DEPC inaktywuje RNazy poprzez karbetoksylację i zmniejsza sygnał tła.
  2. Do każdej próbki utrwalonych komórek bakteryjnych dodać 400 μL 0,1% roztworu DEPC i dokładnie wymieszać za pomocą pipety. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25°C przez 12 minut. Przemyć komórki dwukrotnie 400 μL 1X PBS, odwirować komórki (7K, 2 min) i usunąć supernatant.

4. Permeabilizacja

  1. Dodaj 1,0 mg lizozymu do 1 mL buforu Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0), aby uzyskać roztwór o stężeniu 1,0 mg/mL. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Dodaj 800 μL roztworu lizozymu (1 mg/mL) do komórek, wymieszaj dokładnie za pomocą pipety i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 30 minut, okresowo mieszając. Odwiruj komórki (7K, 2 min) i usuń nadsącz. Lizozym działa jako odczynnik permeabilizujący poprzez hydrolizę peptydoglikanu obecnego w ścianach komórkowych bakterii.
  2. Przygotuj roztwór proteinazy K o stężeniu 3,0 μg/mL w buforze TE. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem z roztworu zapasowego proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL, przechowywanego w temperaturze -20 °C. Proteinaza K jest serynową proteazą, która trawi różne białka i zwiększa dostępność sond oraz odczynników do RNA.
  3. Dodaj 800 μL roztworu proteinazy K (3,0 μg/mL) do osadu komórkowego i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety. Inkubuj w temperaturze 25 °C przez 15 minut, mieszając na wortexu w połowie czasu inkubacji.
  4. Odwiruj komórki (7K, 2 min), usuń nadsącz i przemyj komórki raz 400 μL 1X PBS. Po usunięciu nadsączu z płukania, resuspenduj komórki w 400 μL 1X PBS i przenieś po 100 μL zawiesiny do czterech nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Odwiruj komórki (7K, 2 min) i usuń nadsącz.

5. Hybrydyzacja

  1. Przygotować 100 μL buforu do hybrydyzacji (HB) dla każdej próbki. Bufor HB składa się z 50% formamid (objętościowo), 10% siarczanu dekstranu (masowo; dodać 16,7 μL 60% roztworu siarczanu dekstranu na każde 100 μL), 1X roztworu Denhardta, 50 mM fosforanu sodu o pH 7,0, 2X cytrynianu sodu (SSC), 20 μg pociętego DNA z plemników łososia (SSSD) oraz 20 μg tRNA drożdżowej.
  2. Każdy z komponentów buforu HB pełni inną funkcję. Formamid obniża temperaturę topnienia dupleksów kwasów nukleinowych, co ułatwia denaturację RNA i minimalizuje uszkodzenia komórek. Siarczan dekstranu jest stosowany jako polimer wykluczający objętościowo w celu skoncentrowania sondy i zwiększenia szybkości hybrydyzacji. Roztwór Denhardta, tRNA drożdżowa i SSSD służą jako czynniki blokujące w celu zredukowania niespecyficznego wiązania.
  3. Do każdej z probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 mL zawierających resuspensję komórek dodać 95 μL HB oraz 5,0 μL specyficznej dla sRNA/mRNA sondy LNA [końcowe stężenie specyficznego LNA 20 pmol] lub wody (dla ujemnej kontroli bez LNA). Na przykład:
    1. Probówka 1 - 95 μL HB + 5,0 μL sondy specyficznej dla sRNA/mRNA
    2. Probówka 2 - 95 μL HB + 5,0 μL sondy specyficznej dla sRNA/mRNA (ujemna kontrola „bez barwnika”)
    3. Probówka 3 - 95 μL HB + 5,0 μL sondy sRNA/mRNA (ujemna kontrola „nieeksprymowanego sRNA/mRNA”)
    4. Probówka 4 - 95 μL HB + 5,0 μL wody (ujemna kontrola „bez LNA”)
  1. Inkubuj wszystkie cztery próbki w temperaturze 60 °C przez 60 minut. Temperatura hybrydyzacji zależy od Tm sondy (sond) LNA i powinna być ustawiona na około 30 °C poniżej przewidywanego Tm dla przyłączania RNA. Zarówno podwyższona temperatura hybrydyzacji, jak i obecność formamidu w buforze HB zapewniają denaturację struktur drugorzędowych sRNA lub mRNA, które są przedmiotem badania.

6. Płukanie po hybrydyzacji

  1. Po hybrydyzacji do mieszaniny dodaj 1,0 mL 0,1X SSC z 0,1% tween-20 (SSCT). Jest to niezbędne, aby umożliwić usunięcie komórek z lepki roztworu hybrydyzacyjnego. Odwiruj komórki w celu uzyskania osadu (7K, 2 min) i usuń nadsącz.
  2. Do osadów komórkowych dodaj 200 μL 50% formamidu, 2X SSC, 0,1% tween-20, wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzejnym.
  3. Do mieszaniny dodaj 1 mL 0,1X SSCT, odwiruj komórki (7K, 2 min) i usuń nadsącz.
  4. Dodaj 500 μL 0,1X SSCT, aby resuspenderć komórki, i inkubuj przez 40 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzejnym. Odwiruj komórki (7K, 2 min) i usuń nadsącz.

7. Blokowanie i barwienie

  1. Przygotować bufor blokujący (BB) oraz roztwór barwiący ze streptawidyny z barwnikiem. Przygotować roztwór 1X BB z zapasu 5X (dostępny w handlu, patrz Odczynniki). Dla każdego zestawu czterech probówek przygotować 1,2 mL 1X BB.
  2. Dodać 200 μL 1X BB do osadów komórkowych, resuspenderować i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25°C.
  3. Do wykrywania biotynylowanych sond LNA stosuje się barwnik sprzężony ze streptawidyną. Podczas blokowania przygotować roztwór 2 μg/mL DyLight 488 streptawidyny lub innego wybranego sprzężenia barwnik-streptawidyna w 1X BB przez 30 min (dla trzech próbek przygotować 300 μL).
  4. Po inkubacji z 1X BB odwirować komórki (7K, 2 min) i usunąć nadsącz. Dodać 50 μL roztworu streptawidyny z barwnikiem do osadów komórkowych, dokładnie wymieszać i inkubować przez 12 minut w temperaturze 25 °C przy ciągłym mieszaniu na wortexie lub w termomikserze. Dla kontroli „bez barwnika” dodać tylko 50 μL 1X buforu blokującego. W pozostałej części protokołu chronić probówki przed światłem, używając folii aluminiowej.
  5. Przemyć komórki raz 500 μL buforu 0,1X SSCT i raz 400 μL 1X PBS z 0,1% tween-20 (PBST). Odwirować komórki (7K, 2 min) i usunąć nadsącz.
  6. Po wstępnym barwieniu sprzężeniem ze streptawidyną sygnał jest wzmacniany poprzez wprowadzenie biotynylowanego przeciwciała przeciwstreptawidynowego do sprzężenia streptawidyna-barwnik, a następnie ponowne barwienie streptawidyną z barwnikiem, co zwiększa moc sygnału z każdej zhybrydyzowanej sondy LNA (Rysunek 2).
  7. Dodać 100 μL biotynylowanego przeciwciała przeciwstreptawidynowego w stężeniu 1 μg/mL w 1X PBS, resuspenderować komórki i inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut, mieszając sporadycznie. Odwirować komórki (7K, 2 min), usunąć nadsącz i przemyć dwukrotnie 400 μL 1X PBST.
  8. Dodać 50 μL roztworu streptawidyny z barwnikiem (2 μg/mL) do komórek, dokładnie wymieszać i inkubować przez 12 minut w temperaturze 25°C przy ciągłym mieszaniu na wortexie lub w termomikserze. Dla kontroli „bez barwnika” dodać tylko 50 μL 1X buforu blokującego.
  9. Przemyć komórki raz 500 μL buforu 0,1X SSCT i raz 400 μL 1X PBST.
  10. Resuspenderować komórki w 200 μL 1X PBST i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia analizy cytometrycznej. W przypadku mniejszych komórek bakteryjnych ustawić małą prędkość przepływu, aby zmniejszyć rozmiar rdzenia próbkowania. Ponadto, w przypadku cytometrów przepływowych z progami odcięcia dla rozproszonego światła w przód (forward scatter), próg ten należy ustawić jak najniżej, aby zapewnić wykrycie małych komórek bakteryjnych.
  11. Dla detekcji DyLight 488 cytometr przepływowy powinien być wyposażony w laser 488 nm i standardowe filtry emisyjne dla FITC. Należy zebrać co najmniej 2x104 zdarzeń. W celu zapewnienia kompatybilności z cytometrami wyposażonymi w inne lasery, w tym protokole można zastosować inne fluorofory sprzężone ze streptawidyną.

8. Reprezentatywne wyniki

Przykład komórek utrwalonych i permeabilizowanych w sposób efektywny przedstawiono na wykresie kropkowym cytometrii przepływowej w Rysunku 3A. Przy zastosowaniu opisanych powyżej warunków permeabilizacji populacja komórek jest mała i jednorodna, co wskazuje na niewielką liczbę agregatów komórkowych. Przy użyciu wyższych stężeń lizozymu (5 mg/mL) komórki są bardziej podatne na agregację i wykazują zwiększone wartości rozproszenia przedniego (forward scatter), co świadczy o obecności większych cząstek (Rysunek 3B). Przykład danych z cytometrii przepływowej z udanego eksperymentu LNA flow-FISH przedstawiono w Rysunku 4. Histogram wykazuje specyficzne wykrycie docelowego sRNA wraz z trzema kontrolami negatywnymi. Kontrola negatywna „bez barwnika” (no dye) wykazuje najmniejszą fluorescencję, następnie kontrolami tymi są „bez LNA” (no LNA) oraz „nieekspresyjny sRNA” (non-expressed sRNA). Na koniec próbka z sondą LNA specyficzną dla sRNA wykazuje największą fluorescencję. Po zwalidowaniu metody i sond LNA w ten sposób można zaprojektować dodatkowe eksperymenty w celu monitorowania zmian sygnału sRNA w czasie, w odpowiedzi na mutacje lub zróżnicowane warunki hodowli itp.

Schemat cytometrii przepływowej bakterii; zilustrowane procesy fiksacji, hybrydyzacji i barwienia.
Rycina 1. Przedstawienie ogólnego schematu eksperymentu LNA flow-FISH w celu detekcji bakteryjnego sRNA.

Metoda detekcji kwasów nukleinowych z użyciem biotynylowanych sond LNA; schemat przedstawia kolejne etapy wiązania.
Rysunek 2. Barwienie i amplifikacja sygnału flow-FISH LNA. a) Hybrydyzacja biotynylowanej sondy LNA. b) Barwienie fluorescencyjnym koniugatem streptawidyny DyLight 488. c) Wiązanie biotynylowanego przeciwciała antystreptawidynowego do streptawidyny DyLight 488. Przeciwciało może wiązać streptawidynę poprzez miejsce wiążące antygen lub może być wiązane przez streptawidynę za pomocą swoich reszt biotyny. d) Amplifikacja sygnału poprzez dalsze barwienie fluorescencyjnym koniugatem streptawidyny DyLight 488.

Diagram wykresu kropkowego cytometrii przepływowej przedstawiający analizę danych rozpraszania bocznego względem przedniego, z bramkowaniem populacji komórek.
Rysunek 3. Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej przedstawiające wyniki rozpraszania przedniego względem bocznego dla a) permeabilizacji przy użyciu 1 mg/mL lizozymu i 3 μg/mL proteinazy K oraz b) permeabilizacji przy użyciu 5 mg/mL lizozymu i 3 μg/ml proteinazy K.

Wykres intensywności fluorescencji DyLight 488 przedstawiający liczbę zdarzeń w funkcji fluorescencji przy użyciu cytometrii przepływowej.
Rycina 4. Analiza histogramu wyników flow-FISH z wykorzystaniem LNA. Sygnał fluorescencyjny uzyskany z każdej próbki przedstawiono za pomocą czterech linii: czarna – specyficzna dla sRNA sonda LNA; czerwona – kontrola negatywna „nieeksprymowane sRNA”; niebieska – kontrola negatywna „brak LNA”; fioletowa – kontrola negatywna „brak barwnika”.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda LNA flow-FISH została zastosowana do wykrycia ekspresji sRNA z Gram-ujemnej morskiej bakterii Vibrio campbellii, której ekspresja została wcześniej potwierdzona za pomocą profilowania ekspresji opartego na mikromacierzach oraz reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją16. Do tej pory wykorzystywaliśmy tę metodę do monitorowania ekspresji różnych rodzajów RNA (np. trans-kodowanych sRNA, sRNA modulujących aktywność białek, rybo przełączników oraz mRNA). W związku z tym jesteśmy przekonani, że metoda ta jest elastyczna i może być stosowana do wykrywania dowolnych sRNA lub mRNA oraz może zostać zmodyfikowana do użytku w dowolnym gatunku bakterii lub typie komórek. Jeśli w przypadku innych typów komórek konieczna jest modyfikacja tego protokołu, najważniejszą zmienną, którą należy rozważyć pod kątem manipulacji, jest etap permeabilizacji. Na przykład przy modyfikowaniu opisanych tutaj warunków permeabilizacji należy przetestować zmiany stężeń lizozymu i proteinazy K. Stwierdziliśmy, że podwojenie lub potrojenie ilości lizozymu i proteinazy K spowodowało znaczące zmiany w wynikach LNA flow-FISH. Ponadto podczas testowania dodatkowych warunków permeabilizacji należy analizować komórki pod kątem agregacji, utraty komórek oraz najlepszego możliwego stosunku sygnału fluorescencyjnego do tła. Stopień agregacji komórek można badać za pomocą mikroskopii i/lub cytometrii przepływowej. W cytometrii przepływowej agregaty komórkowe przejawiają się jako „ogony” na wykresie kropkowym rozproszenia przedniego (forward scatter) względem bocznego (side scatter), a prawidłowa metoda permeabilizacji zminimalizuje ten efekt. Metoda ta nadaje się również do multipleksowego wykrywania sRNA bez istotnych modyfikacji opisanego protokołu, ponieważ podczas etapu hybrydyzacji można dodać dodatkowe sondy LNA znakowane innymi haptenami, takimi jak digoksygenina, a następnie wykryć je za pomocą przeciwciała anty-digoksygeninowego i wtórnego sprzężenia przeciwciało-fluorofor. Obecnie jedynym ograniczeniem, z jakim się spotkaliśmy przy tej metodzie, jest brak możliwości wygenerowania wystarczającego sygnału z nisko eksponowanych gatunków sRNA; trwają prace nad określeniem progu detekcji (w bezwzględnej liczbie kopii na komórkę).

Ogólnie rzecz biorąc, metoda LNA flow-FISH umożliwia pomiar ekspresji bakteryjnego sRNA lub mRNA na poziomie pojedynczych komórek w sposób wysokoprzepustowy, co pozwala uzyskać informacje o obecności i względnej liczebności danego gatunku sRNA oraz o stopniu zróżnicowania jego ekspresji w populacji.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była finansowana przez Office of Naval Research ze środków podstawowych US Naval Research Laboratory.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS), pH 7,4Applied BiosystemsAM9625
Woda wolna od nukleaz Applied BiosystemsAM9932(niepoddany działaniu DEPC)
32% paraformaldehydNauki o mikroskopii elektronowejRT 15714Bez zawartości etanolu
Kwas octowyAcros Organics327290010
piroweglan dwuetylowy (DEPC)Sigma-AldrichD5758Przechowywać w warunkach suchych
LizozymSigma-AldrichL2879
Proteinaza K (20 mg/ml)Applied BiosystemsAM2546
FormamidApplied BiosystemsAM9342Dejonizacja, alikwotowanie i mrożenie
Masa cząsteczkowa siarczanu dekstranu > 500,000Sigma-AldrichD8906Podzielić 60% roztwór na alikwoty i zamrozić
Denhardt’roztwór 50X koncentratSigma-AldrichD2532Podział na alikwoty i zamrażanie
Bufor cytrynian sodu 20XApplied BiosystemsAM9770
DNA z plemników łososia (fragmentowane) 10 mg/mLApplied BiosystemsAM9680Aliquotowanie i mrożenie
tRNA drożdżowa (10 mg/ml)Life Technologies15401-011Aliquotowanie i zamrażanie
Tween-20 Sigma-AldrichP9416
5X in situ roztwór blokujący hybrydyzacjęVector LaboratoriesMB-1220
streptawidyna DyLight 488 Vector LaboratoriesSA-5488-1
biotynilowane przeciwciało antystreptawidynoweVector LaboratoriesBA-0500Podział na alikwoty i mrożenie

Bibliografia

  1. Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
  2. Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
  3. Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
  4. Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
  5. Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
  6. Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
  7. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
  8. Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
  9. Obika, S. Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
  10. Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
  11. Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
  12. Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
  13. Waters, L., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136, 615-628 (2009).
  14. Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
  15. Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
  16. Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sondy LNAanaliza ekspresji RNAfiksacja i permeabilizacja kom reketapy amplifikacji sygna umetoda Flow FISHsondy z analogami kwas w nukleinowych

Powiązane artykuły