Ocena ekspresji GFP i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego Tali

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób wykonywania testów żywotności komórek oraz ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru obrazowego Tali.

Streszczenie

Informacje na poziomie pojedynczych komórek oraz całej populacji są zazwyczaj pozyskiwane za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Te dwie metody dostarczają jednak odmiennych danych. Cytometria przepływowa zapewnia ilościowe, wieloparametryczne informacje o charakterystyce fizycznej, barwieniu lub ekspresji, lecz nie umożliwia wizualizacji. Z kolei samodzielna mikroskopia fluorescencyjna dostarcza danych wizualnych, ale nie pozwala na bezpośrednie pomiary ilościowe¹.

Cytometria obrazowa wypełnia lukę między tymi dwiema metodami, umożliwiając szybką wizualizację oraz jednoczesną analizę ilościową tysięcy komórek w populacjach heterogenicznych². Przedstawiamy tutaj metodę przeprowadzania analizy żywotności komórek oraz ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) przy użyciu cytometru obrazowego Tali³. Urządzenie Tali to 3-kanałowa (pole jasne, fluorescencja zielona, fluorescencja czerwona) platforma analityczna do użytku laboratoryjnego, która oferuje szereg zalet w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną. Cytometr Tali jest tańszy, zajmuje mniej miejsca na blacie, wymaga mniejszej konserwacji, a uproszczony przepływ pracy sprawia, że obsługa i analiza są znacznie prostsze i szybsze. Cytometr Tali umożliwia przeprowadzanie różnorodnych analiz w zawiesinach komórkowych, w tym analizę ekspresji GFP i czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), apoptozy^4-6 oraz żywotności komórek z użyciem jodku propidyny (PI)^7-11.

W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie urządzenia Tali do przeprowadzenia testu żywotności komórek wykazujących ekspresję białka GFP. Komórki przetransdukowane białkiem GFP są barwione przy użyciu zestawu Tali Viability Kit - Dead Cell Red. Następnie komórki są przenoszone pipetą na slajd do analizy komórkowej Tali i umieszczane w cytometrze. Przechwytywane są obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej, które następnie analizowane są za pomocą algorytmów specyficznych dla danego testu. W kolejnym kroku generowane są histogramy obrazujące wielkość komórek, intensywność fluorescencji PI oraz intensywność fluorescencji GFP. Parametry te mogą być następnie poddane progowaniu w celu wyodrębnienia konkretnej populacji komórek.

Porównanie zestawione obok siebie cytometru obrazowego Tali oraz tradycyjnej cytometrii przepływowej wykazuje, że obie metody dostarczają porównywalnych danych dotyczących żywotności komórek i ekspresji białek. Jednak instrument Tali dostarcza dodatkowych informacji wizualnych na temat populacji komórek, których nie można uzyskać za pomocą cytometru przepływowego.

Protokół

1. Barwienie komórek za pomocą zestawu Tali Viability Kit - odczynnik Dead Cell Red

1. Procedurę rozpoczynamy od użycia komórek U2OS (American Type Culture Collection), które zostały transdukowane za pomocą CellLight Nucleus-GFP *BacMam 2.0*. (Uwaga: Komórki można również odwirować i zawiesić ponownie w medium lub PBS).
2. Aby zabarwić martwe komórki jidkiem PI, przenieś 100 μL zawiesiny komórek do nowej probówki do mikrocentryfugi. Należy pamiętać, że dla tego testu zalecane jest stężenie od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ cells/mL, choć stężenie nie musi być dokładne.
3. Następnie, w celu zabarwienia martwych komórek, dodaj 1 μL odczynnika Tali Dead Cell Red opartego na PI. Krótko wymieszaj na wortexie. Inkubuj mieszaninę odczynnika Tali Dead Cell Red i komórek w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 1-5 minut.
4. Po inkubacji niezwłocznie przystąp do analizy próbki na cytometrze obrazowym Tali Image-Based Cytometer.

2. Wykonywanie testu żywotności komórek przy użyciu cytometru obrazowego Tali

1. Cytometr Tali wykorzystuje jednorazowe plastikowe płytki do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, które są specjalnie dopasowane do cytometru i mogą pomieścić dwie próbki o objętości 25 μL w oddzielnych, zamkniętych komorach (A i B). Podczas manipulowania płytką należy ją zawsze trzymać za krawędzie.
2. Aby załadować płytkę, należy powoli nalać pipetą 25 μL próbki do półksiężycowatego obszaru ładowania, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza ani odpryski. Nie należy przepełniać ani niedopełniać komory.
3. W tym przypadku w komorze A ładuje się komórki kontrolne (niebarwione, nietransdukowane), a w komorze B komórki barwione wykazujące ekspresję GFP. Próbka kontrolna pomoże określić poziom autofluorescencji podczas analizy danych.
4. Aby przeprowadzić test żywotności, należy dotknąć opcji GFP/RFP na ekranie głównym cytometru. Po prawej stronie pojawią się opcje testu. Należy wybrać GFP + Viability.
5. Następnie, aby nazwać serię próbek, należy nacisnąć Name Now. Następnie, korzystając z ekranu dotykowego, wpisać nazwę serii próbek i nacisnąć Save. (Uwaga: Wybierz Select Name Later, aby automatycznie przypisać nazwę dla każdej serii próbek na podstawie daty i godziny).
6. Po nazwaniu próbki cytometr Tali automatycznie przejdzie do ekranu Measure. Należy nacisnąć kartę Background w dolnej prawej części ekranu Measure.
7. Następnie, trzymając próbkę kontrolną (A) od strony przeciwnej do cytometru, należy wsunąć płytkę do portu ładowania, aż zostanie zatrzymana. Nie należy używać siły.
8. Na ekranie tła należy dotknąć Press to Insert New Unstained Cell Control. Płytka zostanie automatycznie wciągnięta do cytometru, a na ekranie wyświetli się obraz komórek w czasie rzeczywistym.
9. Za pomocą pokrętła ostrości należy ustawić komórki w odpowiedniej płaszczyźnie widzenia. Komórki powinny być jednolicie ciemne z jasną aureolą wokół każdej z nich (Rysunek 1, lewo).
10. Komórki mogą zostać niedoszacowane, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, przez co granice komórek nie są dobrze zdefiniowane (Rysunek 1, środek). Komórki mogą zostać przeszacowane, gdy mają jasne centra i ciemne obwody (Rysunek 1, prawo).
11. Aby lepiej widzieć populację komórek podczas ustawiania ostrości, należy przesunąć czerwony przycisk wskaźnika Zoom na 4X lub 16X.
12. Po ustawieniu ostrości komórek należy dotknąć Press to Run Unstained Cell Control, aby zmierzyć fluorescencję tła.
13. Cytometr automatycznie zarejestruje i przeanalizuje obrazy próbki. Przechwycenie i analiza obrazów w domyślnym trybie (9 obrazów) trwa około 1 minuty.
14. Miniatury każdego pola widzenia są wyświetlane w miarę ich rejestrowania, a pasek postępu zapewnia aktualizację w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu rejestracji obrazów cytometr automatycznie wysuwa płytkę i przedstawia dane z analizy zarejestrowanych obrazów.
15. Zapisane dane zostaną wyświetlone w menu rozwijanym karty Background w cytometrze. Próbce kontrolnej tła zostanie przypisana ta sama nazwa, co eksperymentowi, i zostanie ona zaimportowana do menu rozwijanego. Uwaga: Jeśli kontrola tła nie zostanie przeprowadzona, cytometr automatycznie przypisze próg fluorescencji. Można go zmienić ręcznie po przeprowadzeniu testu.
16. Aby zbadać transdukowaną próbkę barwioną PI, należy wyjąć płytkę z cytometru, obrócić ją i ponownie włożyć z transdukowaną próbką skierowaną od strony przeciwnej do instrumentu.
17. Należy nacisnąć kartę Sample, a następnie dotknąć Press to Insert New Sample. Gdy obraz pojawi się na ekranie, należy użyć pokrętła regulacji obrazu, aby ustawić ostrość komórek jak wcześniej. Następnie należy dotknąć Press to Run Sample.
18. Po zakończeniu rejestracji obrazów dane z analizy pojawią się w karcie Sample, a cytometr automatycznie wysunie płytkę.
19. Używaną płytkę Tali Cellular Analysis Slide należy zutylizować jako odpad biologiczny. Płytek Tali Cellular Analysis Slides nie można używać ponownie.

3. Ustawianie progów i bramek

1. Po analizie próbki można zastosować progi, aby wyodrębnić konkretną populację komórek. W tym przypadku dostosujemy progi, aby określić procent żywych i martwych komórek wśród komórek transdukowanych GFP.
2. W zakładce Sample wyświetlane są: liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP, żywe i martwe komórki wykazujące ekspresję GFP, całkowita żywotność, średnia wielkość komórek, liczba policzonych komórek oraz stężenie komórek.
3. Dodatkowo w dolnej części ekranu wyświetlane są histogramy przedstawiające wielkość komórek, fluorescencję zieloną oraz fluorescencję czerwoną (PI).
4. Aby ustawić bramkę wielkości komórek, dotknij miniatury Cell Size, aby otworzyć histogram wielkości komórek. O ile w hodowlach komórkowych rzadko występują zanieczyszczenia, o tyle inne próbki mogą zawierać debris większy lub mniejszy od komórek.
5. Aby wykluczyć te zanieczyszczenia, przesuń niebieskie przyciski na pasku suwaka, aby odrzucić zdarzenia zarówno duże, jak i małe. Następnie dotknij Apply, aby ponownie przeanalizować dane i zaktualizować wyniki.
6. Następnie, aby uwzględnić fluorescencję GFP w analizie, dotknij miniatury histogramu GFP, aby go otworzyć. Przesuń niebieski pasek, aby ustawić próg tuż po prawej stronie najniższego piku, korzystając z próbki kontrolnej jako punktu odniesienia.
7. Pozwala to na włączenie do analizy komórek GFP-dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu komórek autofluorescencyjnych. Autofluorescencję często obserwuje się podczas wzbudzenia cząsteczek biologicznych wewnątrz komórek.
8. Dotknij Apply, aby zatwierdzić zmiany i powrócić do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce Sample powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji.
9. Następnie, aby oddzielić komórki barwione PI od autofluorescencji, naciśnij miniaturę PI histogram, aby otworzyć histogram PI.
10. Ponownie, pik próbki kontrolnej zostanie wyświetlony jako szary pik na histogramie. Czerwony pik to fluorescencja próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako pik najbliższy wartości 0 RFU w tym cytometrze.
11. Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski przycisk na pasku suwaka, aby dostosować próg w sposób wykluczający pik reprezentujący fluorescencję tła, używając szarego piku z próbki kontrolnej jako referencji. Dotknij Apply, aby zatwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu.
12. Następnie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe przypisanie każdej komórki, wybierz do przeglądu zarejestrowane pole widzenia, naciskając miniaturę obrazu w zakładce Zoom, a następnie naciskając zakładkę Layers.
13. Następnie naciśnij przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz zarejestrowany w danym kanale. Naciśnij ten sam przycisk ponownie, aby usunąć warstwę z wyświetlania; aby nałożyć warstwy na siebie, dotknij przycisku Multiple Layer.
14. Aby sprawdzić, jak komórki są liczone w danym kanale, dotknij Circles. Komórki, które zostały policzone tylko w kanale jasnego pola i nie wykazują fluorescencji, zostaną obwiedzione niebieskimi okręgami. Wskazuje to, że dana komórka jest żywa (tj. PI-ujemna).
15. Komórki wykazujące ekspresję GFP będą widoczne w kanale GFP i zostaną obwiedzione zielonymi okręgami. Martwe komórki barwione barwnikiem Dead Cell Red będą widoczne w kanale PI i zostaną obwiedzione czerwonymi okręgami.
16. Komórki policzone zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym zostaną obwiedzione żółtymi okręgami; wskazuje to, że komórka wykazuje ekspresję GFP, ale jest również zabarwiona PI, a zatem jest martwa.
17. Okazyjnie na ekranie pojawią się czarne okręgi; są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, ale wykluczone z analizy na podstawie wielkości komórek.
18. Kontynuuj precyzyjne dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, korzystając z opisanych kroków, aż każda komórka wykazująca fluorescencję zostanie obwiedziony okręgiem w odpowiednim kolorze.
19. Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w zakładce danych. Cytometr Tali może przechowywać pliki danych z około 500 analiz próbek.
20. Każdy plik zapisany w zakładce danych jest dostępny do ponownej analizy. Po wybraniu pliku z zakładki Data zostanie on otwarty, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne.
21. Aby zarchiwizować dane i wygenerować raporty, dane przechowywane w cytometrze można przenieść na komputer za pomocą dysku USB.

4. Reprezentatywne wyniki:

Cytometr obrazowy Tali został wykorzystany do pomiaru poziomu ekspresji białka fluorescencyjnego w komórkach transdukowanych konstruktem ekspresyjnym GFP BacMam 2.0 nakierowanym na jądro komórkowe. Przetransdukowano cztery reprezentatywne typy komórek (U2OS, 293MSR, HEKn oraz CHO-S). Dla tych linii komórkowych cytometr Tali określił liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP, a wyniki te porównano z danymi z tych samych próbek analizowanych za pomocą cytometru przepływowego. Dodatkowo komórki barwiono odczynnikiem Dead Cell Red z zestawu Tali Viability Kit w celu zidentyfikowania populacji martwych komórek zarówno na cytometrze Tali, jak i na cytometrze przepływowym.

Reprezentacje graficzne na Rysunku 2 przedstawiają procent całkowitej populacji każdego typu komórek, które wykazują ekspresję GFP. Dane te dowodzą, że cytometr Tali generuje wyniki porównywalne z danymi uzyskanymi za pomocą cytometru przepływowego.

Rysunek 1. Przed analizą należy prawidłowo ustawić ostrość obrazu komórek. Slajdy Tali Cellular Analysis z stężeniami komórek odpowiednimi do analizy (zaleca się od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ komórek). (LEWO) Komórki w ostrości są jednorodnie ciemne w całej swojej objętości, z jasną aureolą wokół każdej komórki. (ŚRODEK) Liczba komórek może zostać niedoszacowana, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, a komórki mają nieokreślone granice. (PRAWO) Liczba komórek może zostać przeszacowana, gdy mają one jasne centra i ciemne obwody.

Rycina 2. Dane dotyczące ekspresji białka fluorescencyjnego uzyskane za pomocą cytometru obrazowego Tali są porównywalne z danymi uzyskanymi metodą cytometrii przepływowej. Porównanie obok siebie obliczonych wyników ekspresji GFP w 4 różnych liniach komórkowych w komórkach żywych.

Dyskusja

Właśnie szczegółowo opisaliśmy procedurę wykonywania zliczeń żywotności oraz oceny ekspresji GFP przy użyciu cytometru obrazowego Tali. Zastosowanie tej samej procedury pozwala temu cytometrowi na przeprowadzenie szeregu innych analiz, w tym: oceny apoptozy, ekspresji RFP oraz analizy żywotności komórek w przypadku komórek nietransdukowanych.

Fluorometryczne testy żywotności komórek, ekspresji genów i apoptozy stały się kluczowymi metodologiami w badaniach biomedycznych^7-12. W przeszłości do uzyskiwania ilościowych i wizualnych informacji o komórkach stosowano oddzielną aparaturę. Podczas gdy informacje ilościowe dotyczące komórek w populacji heterogenicznej pozyskiwano za pomocą cytometrii przepływowej, informacje wizualne lub jakościowe gromadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej ^1-4. W niniejszej pracy przedstawiamy technologię, która niweluje lukę między badaniami populacyjnymi a badaniami pojedynczych komórek. Dzięki zastosowaniu cytometru obrazowego Tali, ilościowe dane oraz wizualne dane o pojedynczych komórkach lub populacjach komórkowych mogą być zbierane jednocześnie. Instrument Tali może być wykorzystywany w szeregu zastosowań, w tym do oceny ekspresji genów, testów apoptozy, badań skuteczności leków oraz oceny progresji choroby.

Cytometr obrazowy Tali rejestruje i analizuje obrazy w jasnym polu, fluorescencji czerwonej i zielonej, co pozwala na uzyskanie informacji o subpopulacjach komórek. Na przykład w tym badaniu, przy użyciu barwnika Dead Cell Red, byliśmy w stanie odróżnić komórki martwe od żywych w populacji komórek wykazujących ekspresję GFP. Zapewnia to dokładność pomiaru żywotnych komórek wykazujących ekspresję GFP i pozwala zidentyfikować populację komórek nadających się do dalszej obróbki. Należy zauważyć, że martwe komórki w populacji mogą pochodzić z różnych źródeł, w tym z naturalnej śmierci komórek w hodowli lub śmierci spowodowanej warunkami środowiskowymi (np. trypsynizacją lub śmiercią wywołaną wybraną metodą transfekcji/transdukcji).

W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie cytometru Tali z użyciem komórek U2OS. Podobne metody można zastosować w przypadku większości komórek ssaków i owadów. Dla każdej linii komórkowej cytometr Tali dostarczył ilościowych danych dotyczących ekspresji GFP, co nie jest możliwe przy wizualnej ocenie komórek za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Choć wyniki te są porównywalne z wynikami cytometrii przepływowej, są one zbierane w znacznie krótszym czasie. Cytometr umożliwia dokładne zliczanie komórek o średnicy od 5 μm do 60 μm, najlepiej przy stężeniu od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ komórek/mL.

Warto zaznaczyć, że większość standardowych protokołów barwienia, w tym opisany tutaj protokół barwienia Dead Cell Red, wykorzystuje jodek propidyny do rozróżnienia komórek żywych i martwych. Stanowi to wyzwanie przy ocenie żywotności komórek, które zostały permeabilizowane w celu barwienia markerów wewnątrzkomórkowych, ponieważ PI zabarwi każdą komórkę z uszkodzoną błoną. Ponieważ każdy barwnik fluorescencyjny lub białko, które można wykryć w kanałach fluorescencji zielonej lub czerwonej, może zostać przeanalizowany za pomocą cytometru obrazowego Tali, w przyszłych badaniach można rozważyć zastosowanie alternatywnych barwników, takich jak barwniki żywotności reaktywne względem grup aminowych⁴. Badanie przeprowadzone w 2006 roku przez Perfetto et al.¹² wykazało, że barwniki te są łatwe w użyciu i powtarzalne w różnicowaniu populacji komórek żywych i martwych.

Należy zwrócić uwagę, że urządzenie Tali posiada ograniczenia w zakresie rodzajów analiz, jakie może przeprowadzać. Na przykład, ponieważ instrument wykorzystuje obiektyw 4X, operacje zliczania są ograniczone do większych typów komórek: nie można ilościowo określić struktur subkomórkowych, takich jak mitochondria lub pęcherzyki, ani komórek bakteryjnych. Należy również pamiętać, że kanały detekcji w Tali są ograniczone do fluoroforów, które wzbudzają i emitują światło w obrębie tych kanałów. O ile silne sygnały YFP i mCherry mogą zostać wykryte, o tyle słabsze sygnały mCherry nie są wykrywalne. Wreszcie, Tali analizuje wyłącznie komórki w zawiesinie. Nie będzie ono dokładnie zliczać komórek przylegających do szkiełka. Ponadto możliwości zliczania komórek o nieregularnym kształcie, w tym niektórych drożdży i komórek pierwotnych, są ograniczone.

Ponadto przyszłe badania prawdopodobnie będą dotyczyć zastosowania tego systemu w ocenie ekspresji markerów wewnątrzkomórkowych. W przypadku poszczególnych barwników można sprawdzić nakładanie się widm z sąsiednimi kanałami, korzystając z narzędzia SpectraViewer firmy Invitrogen dostępnego online (www.invitrogen.com/spectraviewer). Ze względu na nowość tej technologii pełny zakres jej zastosowań nie został jeszcze odkryty.

Podsumowując, zaprezentowany tutaj cytometr obrazowy Tali stanowi nową technologię umożliwiającą jednoczesną wizualizację i analizę populacji komórek, co pozwala na ocenę pojedynczych komórek, jak i całych populacji komórkowych w kompaktowym formacie przy prostym przebiegu pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytometr obrazowy Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Slajdy do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, 50 slajdów	Invitrogen	T10794
Slajdy do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, 500 slajdów	Invitrogen	T10795
Zestaw do oceny żywotności Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Zestaw do oceny żywotności Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Zestaw do wykrywania apoptozy Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
komórki U2OS