Ocena ekspresji i żywotności GFP za pomocą cytometru obrazowego Tali

Summary

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać testy żywotności komórek i ekspresji fluorescencji za pomocą cytometru Tali opartego na obrazie.

Abstract

Informacje o pojedynczych komórkach i populacji są zwykle uzyskiwane za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak te dwie metody dostarczają różnych informacji. Cytometria przepływowa dostarcza ilościowych wieloparametrycznych informacji o cechach fizycznych i barwieniu lub ekspresji, ale nie pozwala na wizualizację. Samodzielna mikroskopia fluorescencyjna dostarcza danych wizualnych, ale nie pozwala na proste pomiary ilościowe¹.

Cytometria oparta na obrazie wypełnia lukę między tymi dwiema metodami, umożliwiając szybką wizualizację i jednoczesną analizę ilościową tysięcy komórek w heterogenicznych populacjach². W tym miejscu przedstawiamy metodę wykonywania testów żywotności komórek i ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) przy użyciu cytometru Tali opartego na obrazie³. Instrument Tali to 3-kanałowa (jasne pole, zielona fluorescencja, czerwona fluorescencja) platforma testowa, która oferuje kilka zalet w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną. Cytometr Tali jest tańszy, zajmuje mniej miejsca na stole, wymaga mniej konserwacji, a przepływ pracy został uproszczony, dzięki czemu obsługa i analiza są znacznie prostsze i szybsze. Cytometr Tali jest w stanie wykonać szereg testów opartych na komórkach zawiesinowych, w tym ekspresję GFP i białka czerwonej fluorescencji (RFP), apoptozę^4-6 i analizę żywotności komórek z jodkiem propidyny (PI)^7-11.

Tutaj pokazujemy użycie instrumentu Tali do przeprowadzenia testu żywotności komórek w komórkach wykazujących ekspresję GFP. Komórki transdukowane GFP są barwione przy użyciu zestawu Tali Viability Kit - Dead Cell Red. Komórki są następnie pipetowane do szkiełka do analizy komórkowej Tali i ładowane do cytometru. Obrazy jasnego pola, czerwonej fluorescencji i zielonej fluorescencji są rejestrowane i analizowane przy użyciu algorytmów specyficznych dla testu. Następnie generowane są histogramy w celu wyświetlenia wielkości komórki, intensywności fluorescencji PI i intensywności fluorescencji GFP. Parametry te można następnie ustawić na progu, aby skupić się na określonej populacji komórek.

Porównanie obok siebie cytometru opartego na obrazie Tali i tradycyjnej cytometrii przepływowej pokazuje, że te dwie metody dostarczają porównywalnych danych dotyczących żywotności komórek i ekspresji białek. Jednak instrument Tali dostarcza dodatkowych informacji wizualnych o populacji komórek, których nie można uzyskać za pomocą cytometru przepływowego.

Protocol

1. Barwienie komórek za pomocą Tali Viability Kit - Odczynnik do Dead Cell Red

1. Rozpocznij tę procedurę od komórek U2OS (American Type Culture Collection), które zostały transdukowane za pomocą CellLight Nucleus-GFP *BacMam 2.0*. (Uwaga: Komórki można również odwirować i ponownie zawiesić w podłożu lub PBS).
2. Aby zabarwić martwe komórki za pomocą PI, przenieś 100 μl komórek do nowej probówki do mikrowirówki. Należy pamiętać, że dla tego testu zalecane jest stężenie 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ komórek/ml, chociaż stężenie nie musi być dokładne.
3. Następnie, aby zabarwić martwe komórki, dodaj 1 μl odczynnika Tali Dead Cell Red na bazie PI. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Inkubuj odczynnik Tali Dead Cell Red i mieszaninę komórek w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1-5 minut.
4. Po inkubacji należy natychmiast przystąpić do analizy próbki za pomocą cytometru obrazowego Tali.

2. Przeprowadzanie testu żywotności komórek za pomocą cytometru opartego na obrazie Tali

1. Cytometr Tali wykorzystuje jednorazowe plastikowe szkiełka do analizy komórkowej Tali, które specjalnie pasują do cytometru i mogą pomieścić dwie próbki o pojemności 25 μl w oddzielnych zamkniętych komorach (A i B). Podczas obsługi zjeżdżalni należy zawsze trzymać ją za boki.
2. Aby załadować szkiełko, należy powoli odpipetować 25 μl próbki do obszaru ładowania próbki w kształcie półksiężyca, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków ani rozprysków wstecznych. Nie napełniaj nadmiernie ani niedostatecznie.
3. W tym przypadku komórki kontrolne (niebarwione, nietransdukowane) są ładowane do komory A, a barwione komórki wykazujące ekspresję GFP są ładowane do komory B. Próbka kontrolna pomoże określić poziom autofluorescencji podczas analizy danych.
4. Aby wykonać test żywotności, dotknij GFP/RFP na ekranie głównym cytometru. Opcje testu pojawią się po prawej stronie. Wybierz GFP + Viability.
5. Następnie, aby nazwać przykładową serię, naciśnij przycisk Nazwij teraz. Następnie, korzystając z ekranu dotykowego, wpisz nazwę przykładowej serii i naciśnij Zapisz. (Uwaga: Wybierz opcję Nazwij później, aby automatycznie przypisać nazwę dla każdej serii próbek według daty i godziny).
6. Po nazwaniu próbki cytometr Tali automatycznie przejdzie do ekranu Pomiar. Naciśnij kartę Tło w prawej dolnej połowie ekranu Miara.
7. Następnie, trzymając próbkę kontrolną (A) skierowaną od cytometru, włóż szkiełko do portu ładowania, aż się zatrzyma. Nie używaj siły.
8. Na ekranie tła dotknij opcji Naciśnij, aby wstawić nową niezabarwioną kontrolkę komórki. Szkiełko zostanie automatycznie wciągnięte do cytometru, a na ekranie zostanie wyświetlony obraz komórek na żywo.
9. Za pomocą pokrętła ostrości ustaw komórki w odpowiedniej płaszczyźnie view. Komórki powinny być jednolicie ciemne z jasną aureolą wokół każdej komórki (ryc. 1, po lewej).
10. Komórki mogą być niedostatecznie policzone, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, tak że granice komórek nie są dobrze zdefiniowane (Rysunek 1, Środek). Komórki mogą być przeliczone, gdy mają jasne środki i ciemne obrysy (ryc. 1, po prawej).
11. Aby lepiej wyświetlić populację komórek podczas ustawiania ostrości, przesuń czerwony przycisk wskaźnika powiększenia na 4X lub 16X.
12. Po ustawieniu ostrości na komórkach dotknij opcji Naciśnij, aby uruchomić kontrolę niebarwionych komórek, aby zmierzyć fluorescencję tła.
13. Cytometr automatycznie przechwyci i przeanalizuje obrazy próbki. Przechwycenie i przeanalizowanie obrazów w trybie domyślnym (9 obrazów) zajmuje około 1 minuty.
14. Miniatury każdego pola widzenia są wyświetlane w takiej postaci, w jakiej są przechwytywane, a pasek postępu zapewnia ciągłą aktualizację. Po zakończeniu przechwytywania obrazu cytometr automatycznie wysuwa szkiełko i dostarcza dane z analizy przechwyconych obrazów.
15. Zapisane dane zostaną wyświetlone w menu rozwijanym zakładki Tło na cytometrze. Próbka kontrolna w tle zostanie przypisana do takiej samej nazwy, jak nazwa nadana eksperymentowi, i zostanie zaimportowana z menu rozwijanego. Uwaga: Jeśli kontrola w tle nie jest uruchomiona, cytometr automatycznie przypisuje próg fluorescencji. Można to zmienić ręcznie po wykonaniu testu.
16. Aby uruchomić transdukowaną próbkę wybarwioną PI, wyjmij szkiełko z cytometru, odwróć je i włóż ponownie tak, aby transdukowana próbka była odwrócona od przyrządu.
17. Naciśnij kartę Próbka, a następnie dotknij opcji Naciśnij, aby wstawić nową próbkę. Gdy obraz pojawi się na ekranie, użyj pokrętła regulacji obrazu, aby ustawić ostrość komórek jak poprzednio. Następnie dotknij opcji Naciśnij, aby uruchomić próbkę.
18. Po zakończeniu przechwytywania obrazu dane z analizy pojawiają się na karcie Próbka, a cytometr automatycznie wysuwa szkiełko.
19. Szkiełko do analizy komórkowej Tali należy zutylizować jako odpad niebezpieczny biologicznie. Szkiełka do analizy komórkowej Tali nie mogą być ponownie użyte.

3. Ustawianie progów i bramek

1. Po uruchomieniu próbki można teraz zastosować progi do próbki, aby skupić się na określonej populacji komórek. W tym miejscu dostosujemy progi, aby określić procent żywych i martwych komórek w komórkach transdukowanych GFP.
2. Na karcie Próbka wyświetlana jest liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP, żywych i martwych komórek wykazujących ekspresję GFP, całkowita żywotność, średni rozmiar komórki, liczba zliczonych komórek i stężenie komórek.
3. Ponadto u dołu ekranu wyświetlane są wykresy histogramu przedstawiające rozmiar komórki, zieloną fluorescencję i czerwoną fluorescencję (PI).
4. Aby ustawić bramkę rozmiaru komórki, dotknij miniatury Rozmiar komórki, aby otworzyć histogram rozmiaru komórki. Podczas gdy hodowane komórki rzadko zawierają szczątki, inne próbki mogą zawierać szczątki, które są większe lub mniejsze niż komórki.
5. Aby wykluczyć te zanieczyszczenia, przesuń niebieskie przyciski na suwaku, aby wykluczyć zarówno duże, jak i małe wydarzenia. Następnie dotknij opcji Zastosuj, aby ponownie przeanalizować dane i zaktualizować wyniki.
6. Następnie, aby dodać fluorescencję GFP do analizy, dotknij miniatury histogramu GFP, aby ją otworzyć. Przesuń niebieski pasek, aby ustawić próg po prawej stronie najciemniejszego szczytu, używając próbki kontrolnej jako przewodnika.
7. Dzięki temu analiza może obejmować komórki GFP dodatnie, ale wykluczać komórki autofluorescencyjne. Autofluorescencja jest często obserwowana, gdy cząsteczki biologiczne w komórkach są wzbudzone.
8. Dotknij Zastosuj, aby potwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce Próbka powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji.
9. Następnie, aby oddzielić komórki barwione PI od autofluorescencji, naciśnij miniaturę histogramu PI, aby otworzyć histogram PI.
10. Również w tym przypadku pik próbki kontrolnej zostanie wyświetlony na histogramie jako szary pik. Czerwony pik to fluorescencja próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako pik najbliższy wartości 0 RFU na tym cytometrze.
11. Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski przycisk na pasku suwaka, aby dostosować próg, aby wykluczyć pik reprezentujący fluorescencję tła, używając szarego piku z próbki kontrolnej jako odniesienia. Dotknij Zastosuj, aby potwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu.
12. Następnie, aby wizualnie potwierdzić, że każda komórka jest prawidłowo przypisana, wybierz przechwycone pole widzenia do przeglądu, naciskając miniaturę obrazu na karcie Powiększenie, a następnie naciskając kartę Warstwy.
13. Następnie naciśnij przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz przechwycony przez ten konkretny kanał. Naciśnij ponownie ten sam przycisk, aby usunąć warstwę z wyświetlacza; lub, aby nałożyć warstwy, dotknij przycisku Wiele warstw.
14. Aby określić, w jaki sposób komórki są zliczane przez określony kanał, kliknij Okręgi. Komórki, które zostały zliczone tylko przez kanał jasnego pola, które nie wyrażają fluorescencji, zostaną zakreślone na niebiesko. Oznacza to, że ta konkretna komórka jest aktywna (tj. PI ujemna).
15. Komórki wykazujące ekspresję GFP będą widoczne w kanale GFP i zostaną zakreślone na zielono. Martwe komórki zabarwione na czerwono martwych komórek będą widoczne w kanale PI i zostaną zakreślone na czerwono.
16. Komórki zliczone zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym zostaną zakreślone na żółto, co oznacza, że komórka wyraża GFP, ale jest również zabarwiona PI i dlatego jest martwa.
17. Od czasu do czasu na ekranie pojawią się czarne kółka, są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, ale zostały wykluczone z analizy na podstawie rozmiaru komórki.
18. Kontynuuj dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, wykonując czynności opisane powyżej, aż każda komórka wyrażająca fluorescencję zostanie zakreślona odpowiednim kolorem.
19. Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w zakładce dane. Cytometr Tali może przechowywać pliki danych z około 500 próbek.
20. Każdy plik zapisany w zakładce danych jest dostępny do ponownej analizy. Wybierając plik z zakładki Dane, zostanie on otwarty, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne.
21. W celu archiwizacji danych i generowania raportów dane przechowywane w cytometrze można przesłać do komputera za pomocą dysku USB.

4. Reprezentatywne wyniki:

Cytometr oparty na obrazie Tali został użyty do zmierzenia poziomu ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach, które zostały transdukowane za pomocą konstruktu ekspresji GFP BacMam 2.0 ukierunkowanego na jądro. Transdukowano cztery reprezentatywne typy komórek (U2OS, 293MSR, HEKn i CHO-S). W przypadku tych linii komórkowych liczba komórek, które wykazywały ekspresję GFP, została zgłoszona przez cytometr Tali i porównana z danymi z tych samych próbek analizowanych na cytometrze przepływowym. Dodatkowo komórki barwiono odczynnikiem Dead Cell Red przy użyciu zestawu Tali Viability Kit w celu identyfikacji populacji martwych komórek zarówno na cytometrze Tali, jak i na cytometrze przepływowym.

Graficzne reprezentacje na rysunku 2 pokazują procent całej populacji dla każdego typu komórki, która wyrażała GFP. Dane te pokazują, że cytometr Tali generuje dane porównywalne z danymi generowanymi przez cytometr przepływowy.

Rysunek 1. Komórki powinny być odpowiednio skoncentrowane przed analizą. Szkiełka Tali Cellular Analysis ze stężeniami komórek odpowiednimi do analizy (zalecane są 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ komórek). (PO LEWEJ) Komórki, na których fokus jest wyostrzony, są jednolicie ciemne w całej komórce, z jasną aureolą wokół każdej komórki. (ŚRODEK) Komórki mogą być niedoliczane, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, a komórki mają niezdefiniowane granice (PO PRAWEJ) Komórki mogą być przeliczone, gdy mają jasne środki i ciemne obwód.

Rysunek 2. Dane dotyczące ekspresji białek fluorescencyjnych z cytometru obrazowego Tali są porównywalne z danymi uzyskanymi za pomocą cytometrii przepływowej. Porównanie obliczonej ekspresji GFP daje wyniki 4 różnych linii komórkowych w komórkach żywotnych.

Discussion

Właśnie szczegółowo opisaliśmy procedurę liczenia żywotności i oceny ekspresji GFP za pomocą cytometru opartego na obrazie Tali. Korzystając z tej samej procedury, cytometr ten jest w stanie wykonać szereg innych testów, w tym: apoptozę, RFP i analizę żywotności komórek przy użyciu komórek nietransdukowanych.

Fluorometryczne testy żywotności komórek, ekspresji genów i apoptozy stały się kluczowymi metodologiami w badaniach biomedycznych^7-12. W przeszłości do uzyskiwania ilościowych i wizualnych informacji o komórkach używano oddzielnego oprzyrządowania. Podczas gdy informacje ilościowe o komórkach w niejednorodnej populacji zostały uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej, informacje wizualne lub jakościowe zostały zebrane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ^1-4. W tym miejscu przedstawiamy technologię, która wypełnia lukę między badaniami populacyjnymi a indywidualnymi komórkami. Za pomocą cytometru opartego na obrazie Tali można jednocześnie zbierać dane ilościowe i wizualne dane komórkowe dotyczące poszczególnych komórek lub populacji komórek. Instrument Tali może być używany do wielu zastosowań, w tym do oceny ekspresji genów, testów apoptozy, badań skuteczności leków i oceny postępu choroby.

Cytometr oparty na obrazie Tali rejestruje i analizuje obrazy jasnego pola, czerwonej fluorescencji i zielonej fluorescencji, umożliwiając uzyskanie informacji o subpopulacjach komórek. Na przykład w tym teście byliśmy w stanie odróżnić martwe komórki od żywych komórek w populacji komórek wykazujących ekspresję GFP za pomocą czerwonego barwnika Dead Cell Red. Zapewnia to dokładność pomiaru żywotnych komórek wykazujących ekspresję GFP i identyfikuje populację komórek, które można wykorzystać do dalszego przetwarzania. Ważne jest, aby pamiętać, że martwe komórki w populacji mogą pochodzić z różnych źródeł, w tym z normalnej śmierci komórki w hodowli lub śmierci komórki spowodowanej warunkami środowiskowymi (np. trypsynizacja lub śmierć wywołana wybraną metodą transfekcji/transdukcji).

Tutaj demonstrujemy zastosowanie cytometru Tali z komórkami U2OS. Podobne metody można wykonać przy użyciu większości komórek ssaków i owadów. Dla każdej linii komórkowej cytometr Tali dostarczył ilościowych danych dotyczących ekspresji GFP, co nie jest możliwe przy oględzinach komórek przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Chociaż wyniki te są porównywalne z cytometrią przepływową, są one zbierane w ułamku czasu. Cytometr jest w stanie dokładnie zliczyć komórki o średnicy od 5 μm do 60 μm, najlepiej w stężeniu 1 x 10⁵ do 1 x 10⁷ komórek/ml.

Ważne jest, aby podkreślić, że większość standardowych protokołów barwienia, w tym opisany tutaj protokół barwienia martwych komórek czerwonych, wykorzystuje jodek propidyny do odróżnienia żywych i martwych komórek. Stanowi to wyzwanie przy ocenie żywotności w komórkach, które zostały przeniknięte w celu barwienia markerów wewnątrzkomórkowych, ponieważ PI zabarwi każdą komórkę z naruszoną błoną. Ponieważ każdy barwnik fluorescencyjny lub białko, które można wykryć za pomocą zielonych lub czerwonych kanałów fluorescencyjnych, można przeanalizować za pomocą cytometru opartego na obrazie Tali, przyszłe badania mogą badać zastosowanie alternatywnych barwników, takich jak barwniki żywotności reaktywnej aminy⁴. Badanie z 2006 roku przeprowadzone przez Perfetto i wsp.¹² stwierdziło, że barwniki te są łatwe w użyciu i powtarzalne w rozróżnianiu populacji żywych i martwych komórek.

Należy pamiętać, że Tali ma ograniczenia w odniesieniu do rodzajów testów, które może wykonać. Na przykład, ponieważ celem wykorzystywanym przez instrument jest 4X, operacje liczenia są ograniczone do większych typów komórek: struktur subkomórkowych, takich jak mitochondria lub pęcherzyki, a komórek bakteryjnych nie można określić ilościowo. Należy również pamiętać, że kanały detekcji w Tali są ograniczone do fluoroforów, które będą wzbudzać się i emitować w kanałach. Podczas gdy sygnały YFP i jasne mCherry mogą być wykrywane, ściemniane sygnały mCherry nie mogą. Wreszcie, Tali analizuje tylko komórki w zawiesinie. Nie będzie dokładnie zliczać komórek przylegających do slajdu. Co więcej, chociaż istnieje ograniczona zdolność do liczenia komórek o nieregularnym kształcie, w tym niektórych drożdży i komórek pierwotnych.

Ponadto przyszłe badania prawdopodobnie będą dotyczyły wykorzystania tego systemu w ocenie ekspresji markerów wewnątrzkomórkowych. Poszczególne barwniki można sprawdzić pod kątem nakładania się widma na sąsiednie kanały za pomocą internetowego narzędzia SpectraViewer (www.invitrogen.com/spectraviewer) firmy Invitrogen. Biorąc pod uwagę nowość tej technologii, pełny zakres zastosowań nie został jeszcze odkryty.

Podsumowując, zademonstrowany tutaj cytometr oparty na obrazie Tali przedstawia nową technologię, która pozwala na jednoczesną wizualizację i analizę populacji komórek, umożliwiając ocenę pojedynczych komórek, a także populacji komórek w kompaktowym formacie z prostym przepływem pracy.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytometr obrazowy Tali	Invitrogen	T10796
Szkiełka do analizy komórkowej Tali, 50 szkiełek	Invitrogen	T10794
Szkiełka do analizy komórkowej Tali, 500 szkiełek	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Zestaw do apoptozy	Invitrogen	A10788
Ogniwa