ex vivo Preparacja izolowanych szkieletowych mikronaczyń do badania reaktywności naczyniowej

Podsumowanie

Opisano preparację ex vivo do izolacji największych tętniczek oporowych mięśnia smukłego w celu badania zarówno reakcji naczyniowych na bodźce naczyniokurczące, jak i oceny podstawowych właściwości strukturalnych za pomocą pasywnej mechaniki ścian.

Streszczenie

Preparat izolowanego mikonaczynia jest preparatem ex vivo, który umożliwia badanie różnych czynników kontrolujących średnicę naczynia, a tym samym opór perfuzyjny^1-5. Jest to klasyczny preparat eksperymentalny, który w dużej mierze został pierwotnie opisany przez Uchidę et al.¹⁵ kilka dziesięcioleci temu. Ten pierwotny opis stał się podstawą technik, które zostały w znacznym stopniu zmodyfikowane i ulepszone, głównie w laboratorium dr. Briana Dulinga na Uniwersytecie Wirgińskim^6-8, a w następnych stronach przedstawiamy aktualne podejście. W tym preparacie jako wybrany mikonaczynie będzie występować tętniczka mięśnia smukłego szczura, jednak podstawową metodę przygotowania można z łatwością zastosować do naczyń izolowanych z niemal każdej innej tkanki lub narządu u różnych gatunków^9-13. Zmiany mechaniczne (tj. wymiarowe) w izolowanych mikonaczyniach można łatwo oceniać w odpowiedzi na szeroki wachlarz bodźców fizjologicznych (np. hipoksja, ciśnienie wewnątrznaczyniowe lub siły ścinające) lub farmakologicznych, co pozwala na zrozumienie elementów mechanistycznych składających się na zintegrowane odpowiedzi w nienaruszonej, choć ex vivo, tkance. Istotność tej metody polega na tym, że umożliwia ona łatwe manipulowanie czynnikami wpływającymi na zintegrowaną regulację średnicy mikonaczynia, pozwalając jednocześnie na kontrolę wielu oddziaływań z innych źródeł, w tym m.in. ciśnienia wewnątrznaczyniowego (miogennego), unerwienia autonomicznego, czynników hemodynamicznych (np. naprężenia ścinającego), bodźców zależnych lub niezależnych od śródbłonka, wpływów hormonalnych i miąższowych. W odpowiednich warunkach eksperymentalnych i przy założeniu właściwych celów, może to stanowić przewagę nad preparatami tkanek/narządów in vivo lub in situ, które nie pozwalają na tak łatwą kontrolę szerszych zmiennych systemowych.

Głównym ograniczeniem tej preparacji jest w zasadzie konsekwencja jej zalet. Z definicji zachowanie tych naczyń jest badane w warunkach, w których usunięto wiele z najistotniejszych czynników regulujących opór naczyniowy, w tym czynniki neuronalne, humoralne, metaboliczne itp. W związku z tym badaczowi zaleca się unikanie nadinterpretacji i ekstrapolacji danych zebranych przy użyciu tej preparacji. Innym istotnym problemem w odniesieniu do tej preparacji jest fakt, że bardzo łatwo można uszkodzić komponenty komórkowe, takie jak wyściółka śródbłonkowa lub naczyniowa mięśnie gładkie, co może wprowadzić zmienne źródła błędów. Wysoce zaleca się, aby poszczególni badacze stosowali odpowiednie pomiary w celu zapewnienia jakości preparacji, zarówno na początku eksperymentu, jak i okresowo w trakcie trwania protokołu.

Protokół

1. Przed eksperymentem

1. Przed dniem eksperymentu szklane rurki kapilarne o wymiarach odpowiednich dla stacji są wyciągane w celu utworzenia mikropipet (można użyć wyciągarki poziomej lub pionowej). Średnicę końcówki można łatwo dostosować w zależności od izolowanego naczynia, choć zazwyczaj stosujemy zakres średnic od 50-150 μm. Następnie są one wyginane do konfiguracji odpowiedniej dla stacji mikronaczyniowej po podgrzaniu nad płomieniem butanowym. Końcówki mikropipet są fizycznie łamane (za pomocą precyzyjnej pęsety) do przybliżonej średnicy odpowiadającej badanemu mikronaczyniu i mogą być szlifowane lub polerowane do odpowiednich kształtów, zgodnie z wymogami konkretnego zastosowania. W celu uzyskania szczegółowego i wyczerpującego przeglądu tych procedur, czytelnika odsyła się do publikacji Davis et al.¹⁶. Następnie dwie mikropipety umieszcza się naprzeciw siebie w uchwytach do pipet komory mikronaczyniowej. Muszą one być zorientowane tak, aby końcówki znajdowały się w tej samej płaszczyźnie pionowej i poziomej wewnątrz komory naczyniowej.
   Komora mikronaczyniowa użyta w niniejszym opracowaniu (Ryciny 1 i 2) została wykonana na zamówienie przez pana Davida Eicka w Katedrze Fizjologii w Medical College of Wisconsin (http://www.phys.mcw.edu/ oraz www.eicktech.com). Jednakże dostępne są w sprzedaży również inne konfiguracje komór mikronaczyniowych, z których bardzo powszechne są te opracowane przez Living Systems Instrumentation (http://www.livingsys.com/) oraz IonOptix (http://www.ionoptix.com/). Przy korzystaniu z tych innych systemów konieczne może być użycie mikroskopu odwróconego zamiast konwencjonalnego mikroskopu prostego, choć zależy to od konkretnego eksperymentu i wymagań sprzętowych. Użycie mikroskopów odwróconych byłoby preferowane w przypadku protokołów eksperymentalnych wymagających obrazowania fluorescencyjnego lub konfokalnego.
2. Należy przygotować fizjologiczny roztwór soli (PSS; opisany poniżej) i upewnić się, że pH jest ustawione na poziomy odpowiednie dla konkretnych warunków eksperymentalnych (typowe jest pH 7,38-7,42, co mieści się w zakresie fizjologicznym). Roztwór PSS można przygotować wcześniej i przechowywać w lodówce, ale przed użyciem należy sprawdzić jego pH w odpowiedniej temperaturze. PSS może zawierać albuminę, jeśli wymaga tego badacz lub specyficzne protokoły, choć nie jest to powszechnie obowiązkowe.
3. Cyfrowe suwmiary wideo używane do pomiaru średnicy naczynia powinny zostać skalibrowane przy użyciu hemocytometru lub mikrometrycznego okularnika. Dla dokładnej kalibracji kluczowe jest, aby mikrometr znajdował się w tej samej płaszczyźnie co mikropipety dopływowe/odpływowe w komorze naczyniowej.
4. Należy przygotować pętle wiążące do mocowania mikronaczynia do pipet, tak aby były łatwo dostępne do późniejszego użycia. Można je łatwo wykonać z nici chirurgicznej okulistycznej 8-0 lub cieńszej. Pojedyncze pętle można przygotować wcześniej i przechowywać w przykrytej szalce Petriego na małym pasku odklejonej taśmy wokół szkiełka przedmiotowego do momentu użycia (zapobiegnie to ich zagubieniu). (Rycina 3).

2. Dzień eksperymentu

1. Należy włączyć całe urządzenie pomocnicze i sprawdzić jego prawidłowe działanie. Obejmuje to stół antywibracyjny/pływający i cyrkulacyjną łaźnię wodną (ustawioną tak, aby zapewnić odpowiednią temperaturę w kąpieli naczyniowej – zazwyczaj 37 °C), wszystkie przetworniki ciśnienia oraz pompę odpływową komory naczyniowej (Rysunek 1A i 1B). Należy włączyć gazy do równoważenia w komorze naczyniowej oraz w zbiornikach z perfuzatem i superfuzatem.
2. Należy napełnić wszystkie zbiorniki, rurki i komory roztworem PSS. Linia perfuzyjna prowadząca do pipety dopływowej musi być całkowicie wypełniona, aby uniknąć obecności pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać i uszkodzić śródbłonek naczyniowy (Rysunek 1C). W razie potrzeby należy użyć strzykawki, aby delikatnie przepchnąć PSS przez całą pipetę, upewniając się, że jest ona całkowicie pełna i nie ma w niej żadnych zatorów, które mogłyby utrudnić przepływ perfuzatu. Ciśnienie dopływu powinno być utrzymywane w rozsądnych granicach, aby uniknąć uszkodzenia przetworników ciśnienia.

3. Izolacja mikronaczyń

1. Po znieczuleniu zwierzęcia, od którego pobierane jest mikronaczynie, należy wyizolować odpowiednie naczynie zgodnie z procedurami najlepiej dostosowanymi do badanego układu naczyniowego. W niektórych przypadkach może to wymagać usunięcia całego organu (np. w przypadku mikronaczyń mózgowych lub wieńcowych), natomiast w innych naczynia można pobierać bezpośrednio od znieczulonego zwierzęcia (np. z mięśni). Przykład orientacji naczynia w mięśniu smukłym przedstawiono na Rysunku 4. Przed usunięciem naczynia pęsetą lub małymi suwmiarkami należy oszacować jego długość in vivo. Przed pobraniem naczynia ze zwierzęcia/organu bardzo pomocne może być wykonanie końcowej kontroli, aby upewnić się, że komora naczyniowa jest gotowa i funkcjonuje prawidłowo (w tym wszystkie pętle wiążące znajdują się na swoich miejscach).
2. Naczynie należy usunąć ze zwierzęcia/organu, chwytając jego zewnętrzną stronę na jednym z końców cienką pęsetą i przecinając wzdłuż długości naczynia, aż zostanie ono uwolnione, zachowując szczególną ostrożność, aby uniknąć szarpania lub ciągnięcia naczynia. Po uwolnieniu należy je niezwłocznie umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 mL wypełnionej PSS, nie puszczając przy tym naczynia. Pozwala to zapamiętać orientację, tak aby kierunek perfuzji w kąpieli był identyczny z kierunkiem przepływu krwi u zwierzęcia.

4. Kanulacja naczynia

1. Umieść naczynie w wypełnionej kąpieli i przeprowadź kanulację końca proksymalnego na pipecie doprowadzającej. Najlepiej wykonać to przy umiarkowanym przepływie perfuzyjnym przez kaniulę (~50 mmHg ciśnienia) i przy użyciu pary precyzyjnych pęset do trzymania każdej strony ściany światła naczynia po stronie proksymalnej (tj. jedna pęseta w każdej dłoni). W naszym laboratorium używamy precyzyjnych pęset firmy Fine Science Tools (http://www.finescience.com/Home.aspx), choć każda odpowiednio wykonana pęseta będzie skuteczna. Nasuń naczynie na końcówki kaniuli i przesuń naczynie po końcówce do punktu, w którym naczynie można zabezpieczyć dwiema pętlami wiążącymi.
2. Zwiększ ciśnienie doprowadzające do ~75 mmHg, aby dodatkowo rozprężyć naczynie i ułatwić kanulację na końcówce pipety odprowadzającej. Przepływ przez naczynie powinien być widoczny jako zaburzenie w zbiorniku z superfuzatem przy dystalnym odpływie naczynia (pod mikroskopem). Przeprowadź kanulację końca dystalnego naczynia na pipecie odprowadzającej i zabezpiecz go dwiema pętlami wiążącymi (te końcowe pętle muszą być założone przed kanulacją; Rysunek 5).
3. Dostrój kaniulę w współrzędnych XYZ tak długo, aż zaburzenia w naczyniu będą minimalne, a naczynie będzie miało długość zbliżoną do tej in vivo. Zwiększ ciśnienie doprowadzające do poziomu zbliżonego do procentowej wartości średniego ciśnienia tętniczego, jakiego normalnie doświadcza ten odcinek naczynia (nasze laboratorium stosuje 80% średniego ciśnienia tętniczego dla dużych tętniczek oporowych mięśnia gracilis⁸).
4. Umieść w kąpieli mały kamień napowietrzający dostarczający odpowiednią mieszaninę gazów i przykryj komorę folią plastikową lub szklaną pokrywą, aby zapobiec rozpryskiwaniu cieczy na soczewkę mikroskopu. Używamy kamienia napowietrzającego dostępnego w sklepach zoologicznych/akwarystycznych o średnicy około 1 cm, choć mniejszy rozmiar również będzie skuteczny. Obecność kamienia napowietrzającego zapewnia stałą dostępność gazu dla naczynia i przedłuża jego żywotność. Kamień ten usuwa się podczas wszystkich okresów pomiarowych (lub tymczasowo przerywa przepływ powietrza przez kamień), aby zapobiec zniekształceniu obrazu. Zwolnij zacisk na pipecie odprowadzającej i pozwól na przepływ przez naczynie przez 30 minut. Okresowo należy zamykać przepływ na przewodzie odprowadzającym, aby sprawdzić, czy naczynie rozwija tonus spoczynkowy. Wszystkie naczynia muszą zostać sprawdzone pod kątem nieszczelności ciśnieniowej na tym etapie. Wycieki będą widoczne po wprowadzeniu do naczynia znanego ciśnienia (zazwyczaj stosujemy 100-120 mmHg) i zamknięciu linii odpływowych, a następnie dopływowych. Jeśli ciśnienie w świetle naczynia jest stabilne, nie ma widocznych wycieków. Jeśli jednak ciśnienie zaczyna spadać, występuje znaczny wyciek, który należy usunąć. Wycieki przy pipetach doprowadzających lub odprowadzających można zazwyczaj skorygować poprzez dodanie dodatkowej pętli zawiązanej wokół naczynia na pipecie. Alternatywnie, jeśli naczynie ma małą boczną odgałęzienie, przez które następuje wyciek, może to upośledzić zdolność naczynia do efektywnego utrzymania ciśnienia i wprowadzić dodatkowe źródło błędu. Taki wyciek można zazwyczaj zamknąć pojedynczą pętlą szwy okulistycznej 10-0. Bardzo skuteczne jest również użycie pojedynczego włókna wyciągniętego ze szwu 6-0 do wykonania pętli wiążącej. Jeśli wycieku nie można zidentyfikować lub skutecznie go nie da się zamknąć (np. odgałęzienie boczne nie ma pnia, a jedynie otwór w ścianie naczynia), może to doprowadzić do przedwczesnego zakończenia eksperymentu i konieczności użycia innego naczynia (zazwyczaj jest to identyczne naczynie w drugiej nodze – lub po przeciwnej stronie, jeśli jest to konieczne – zwierzęcia).
   
   Naczynie powinno równoważyć się w warunkach braku przepływu przez minimum 30 minut. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w warunkach braku przepływu. Gdy naczynie wykształci satysfakcjonujący tonus i spełni kryteria włączenia do danego eksperymentu, jest gotowe do dalszych badań.
   
   Kryteria włączenia mogą się różnić w zależności od konkretnego protokołu eksperymentalnego i badacza. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy następujące:[
   1. Aktywny tonus >30% (obliczony jako ΔD/ D_max x 100, gdzie ΔD to wzrost średnicy wewnętrznej ściany tętniczki od wartości przy ciśnieniu równoważącym w odpowiedzi na ekspozycję na PSS wolny od Ca²⁺, a D_max to maksymalna średnica zmierzona przy ciśnieniu równoważącym w PSS wolnym od Ca²⁺).
   2. Aktywacja miogenna (utrzymanie lub, co preferowane, redukcja średnicy tętniczki przy zwiększonym ciśnieniu w świetle naczynia) jako wskaźnik żywotnej warstwy mięśni gładkich naczyniowych.
   3. Żywotna wyściółka śródbłonku, co potwierdza gwałtowna odpowiedź rozszerzająca na acetylocholinę (10^-6 M w kąpieli).
   4. W zależności od potrzeb można dodać dodatkowe kryteria włączenia dostosowane do konkretnego protokołu eksperymentalnego, w tym odpowiedzi skurczowe na agoniści adrenergiczni, takie jak fenylefryna (10^-7 M), odpowiedzi rozszerzające na dodatkowe bodźce, takie jak adenozyna (10^-5 M) lub hipoksja (redukcja do 0% O₂ w gazie równoważącym).
5. Następna sekcja jest przykładem „eksperymentu pozorowanego”. Wszystkie wymagane roztwory są przygotowywane w odpowiedni sposób, z uwzględnieniem czynnika rozcieńczenia PSS w komorze naczyniowej. Na przykład w niektórych naszych urządzeniach objętość komory naczyniowej wynosi 20 ml. W związku z tym 20 μl roztworu macierzystego 10^-2 M skutkuje efektywnym stężeniem 10^-5 M w kąpieli komory naczyniowej. Po wyjęciu naczynia, kanulacji, równoważeniu i walidacji opisanej powyżej, eksperyment jest gotowy do rozpoczęcia. Szczegóły, takie jak randomizacja i efektywność zabiegów, są specyficzne dla każdego eksperymentu i zajęłyby zbyt dużo miejsca w opracowaniu. Dlatego nie są one opisane szczegółowo.
   
   Określa się początkowe odpowiedzi kontrolne. Dla przykładu bodźca fizjologicznego, takiego jak aktywacja miogenna (skurcz indukowany ciśnieniem), ciśnienie w świetle naczynia jest losowo zmieniane w żądanym zakresie, a naczyniu daje się odpowiedni czas na reakcję (w tym przypadku byłby to okres 5-7 minut). Dla przykładu bodźca farmakologicznego, takiego jak wyzwanie acetylocholiną, lek jest dodawany do kąpieli z roztworów macierzystych w losowej kolejności. W tym przypadku zazwyczaj stosujemy zakres od 10^-9 do 10^-5 M w kąpieli, a wypłukiwanie definiuje się jako przywrócenie średnicy równoważącej. Ponieważ acetylocholina jest czynnikiem szybko działającym, maksymalne odpowiedzi rozszerzające można łatwo osiągnąć w zaledwie kilka sekund. Inne czynniki (np. peptydy) mogą wymagać znacznie więcej czasu na wywołanie maksymalnej odpowiedzi, co należy wziąć pod uwagę, podobnie jak czas potrzebny na skuteczne wypłukiwanie. Po zebraniu odpowiedzi kontrolnych można wprowadzić do systemu konkretne interwencje, w tym inkubację naczynia z agonistami/antagonistami receptorowymi, czynnikami działającymi na specyficzne kanały jonowe, wywołanie zmienionego ciśnienia w świetle naczynia, różnice w gazach równoważących lub farmakologiczne czynniki ukierunkowane na specyficzne układy enzymatyczne – wymieniając tylko niektóre z najczęstszych interwencji.
   
   Po odpowiednim czasie na zadziałanie interwencji (co powinno zostać odpowiednio przetestowane), można rozpocząć kolejną rundę zbierania danych. W zależności od konkretnego protokołu eksperymentalnego, na naczynie można nałożyć kolejne interwencje lub usunąć pierwszą (poprzez wypłukiwanie – jeśli jest to możliwe – lub proste usunięcie bodźca fizjologicznego). Gdy naczynie wróci do stanu równoważenia (co należy zweryfikować), można stosować kolejne interwencje w razie potrzeby i zbierać dodatkowe dane. Ogólną procedurę tę kontynuuje się do zakończenia eksperymentu lub do momentu, gdy jakość preparatu naczyniowego spadnie poniżej wcześniej określonych kryteriów progowych (np. odpowiedź na agonistę lub zdolność do wykształcenia wystarczającego tonusu aktywnego). W tym momencie eksperyment zostaje zakończony lub badacz może chcieć zebrać dane niezależne od reaktywności izolowanego naczynia (takie jak mechanika ściany naczynia, którą można zbadać za pomocą identycznej procedury aktywacji miogennej, tyle że przy użyciu naczynia pozbawionego wszelkiego tonusu aktywnego¹⁴).
6. Regularne czyszczenie całego sprzętu jest niezbędne do usuwania osadów soli i zapobiegania wzrostowi niepożądanych organizmów biologicznych. Na koniec każdego dnia eksperymentalnego wszystkie linie i komory muszą zostać co najmniej całkowicie przepłukane z PSS obfitą ilością wody destylowanej lub dejonizowanej i pozostawione do całkowitego wyschnięcia. Co 2-3 dni użytkowania wykonuje się również przemywanie alkoholem etylowym i pozostawia sprzęt do całkowitego wyschnięcia. Na koniec każdego tygodnia regularnego użytkowania wszystkie linie i komory wypełnia się 0,1 M kwasem solnym, pozostawia do „inkubacji” na 30 minut, a następnie całkowicie przepłukuje wodą jak opisano wyżej. Wreszcie, po 2-3 tygodniach ciągłego użytkowania, wszystkie sekcje rurek wymienia się na nowe, a komorę i zbiorniki czyści się 1,0 M HCl, a następnie dokładnie płucze wodą destylowaną/dejonizowaną. W przypadku jakiegokolwiek odbarwienia rurek, widocznego wzrostu w rurkach lub jakimkolwiek elemencie komory/zbiorników, należy je odpowiednio wymienić lub dokładnie wyczyścić. Dzięki regularnemu czyszczeniu i ogólnej konserwacji sprzęt może służyć przez bardzo długi czas. W momencie pisania nasze komory naczyniowe są w 8^tym lub 9^tym roku rutynowego użytkowania i nie doświadczyliśmy z nimi żadnych znaczących problemów.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1A. Na tym rysunku przedstawiono podstawową konfigurację stacji do badania mikronaczyń. A = telewizor do podglądu naczynia; B = suwmiarka cyfrowa; C = strzykawka do przepychania superfuzatu przez pipetę doprowadzającą w razie potrzeby; D = kolumna hydrostatyczna do zmiany ciśnienia dopływu perfuzatu; E = mikroskop; F = komora do mikronaczyń; G = zbiornik z superfuzatem; H = monitor ciśnienia (można dodać kilka zgodnie z potrzebą); I = pompa odpływowa komory do mikronaczyń dla superfuzatu; J = zbiornik z mieszaniną gazów do równoważenia; K = pojemnik na odpady (dla superfuzatu); L = cyrkulacyjny podgrzewacz wody; M = stół antywibracyjny/pływający.

Rysunek 1B. Na tym rysunku przedstawiono powiększony widok ustawienia komory do mikroznaczynia. Na rysunku: E = mikroskop; F = komora do mikroznaczynia; H = monitor ciśnienia (dla uproszczenia pokazano tylko jeden, lecz w razie potrzeby można dodać kilka w różnych miejscach); I = pompa odpływowa komory do mikroznaczynia; N = rurka przymocowana do samego początku pipety doprowadzającej perfuzat (kontynuacja elementu „D” z Rysunku 1A); O = rurka przymocowana do pipety odprowadzającej perfuzat.

Rycina 1C. Na tej rycinie przedstawiono najbliższy widok komory mikronaczyniowej. Na rysunku: N = linia perfuzatu (tj. rurka podłączona bezpośrednio do pipety doprowadzającej perfuzat); O = rurka podłączona bezpośrednio do pipety odprowadzającej perfuzat; P = poziome i pionowe regulatory położenia pipety doprowadzającej; Q = odpływ superfuzatu dla kąpieli wodnej (połączony z elementem „I” na Ryciniach 1A i 1B); R = dopływ do kąpieli wodnej pochodzący z rezerwuaru (połączony z elementem „G” na Rycini 1A).

Rycina 2. Na rysunku przedstawiono schematyczny przebieg przepływu płynów i gazów w systemie. Na schemacie: A = dopływ linii superfuzatu PSS; B = linia perfuzatu PSS do pipety dopływowej; C = odpływ superfuzatu PSS z kąpieli do pojemnika na odpady; D = odpływ perfuzatu PSS z pipety odpływowej; E = dopływ podgrzanej wody do płaszcza komory; F = odpływ podgrzanej wody z płaszcza komory.

Rycina 3. Na rysunku przedstawiono poszczególne pętle wiążące wykonane z nici chirurgicznej okulistycznej (widoczne pod mikroskopem dissectingowym z okularami 10x i regulowanym powiększeniem zoom 4,5x; Panel A), które są wykorzystywane w naszej preparatyce, oraz sposób przechowywania wielu pętli wiążących z nici 8-0 i 10-0 na odwróconej taśmie wokół szkiełka przedmiotowego, umieszczonego w przykrytej płytce Petriego (aby uniknąć ich zgubienia; Panel B).

Rysunek 4. Na tym rysunku przedstawiono obraz (widziany przez standardowy mikroskop dissectingowy) tętniczki oporowej mięśnia gracilis przed izolacją chirurgiczną i usunięciem, w celu zapewnienia właściwej orientacji przestrzennej.

Rysunek 5. Rysunek ten przedstawia reprezentacyjny obraz kaniulowanego mikronaczynia. Panel A pokazuje całą długość naczynia, z widocznymi pipetami doprowadzającymi (A) i odprowadzającymi (B) oraz pętlami wiążącymi (C). Panel B prezentuje obraz przy dużym powiększeniu, wyraźnie pokazujący pomiar wewnętrznej średnicy tętniczki za pomocą suwmiarki cyfrowej (w tym przypadku średnica wynosi 112 μm).

Rycina 6. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne obrazy kaniulowanego mikronaczynia po osiągnięciu stanu równowagi. Górny obraz przedstawia naczynie w warunkach kontrolnych, bez stymulacji, przy ciśnieniu równowagi; środkowy obraz przedstawia to samo naczynie po rozszerzeniu wywołanym podaniem acetylocholiny (10^-6 M w kąpieli), a dolny obraz przedstawia to naczynie po skurczu wywołanym podaniem fenylefryny (10^-7 M w kąpieli).

Rycina 7. Na tej rycinie przedstawiono podsumowanie odpowiedzi izolowanego mikronaczynia na: hipoksję (Panel A, obniżenie PO₂ w perfuzacie i superfuzacie w naszym układzie z ~135 mmHg do ~40 mmHg), zwiększające się stężenia acetylocholiny (Panel B) oraz zmiany ciśnienia wewnątrznaczyniowego w warunkach kontrolnych i po inkubacji naczynia w bezwapniowym PSS (Panel C).

Dyskusja

Przedstawiony protokół opisuje izolację, wycięcie i podwójną kanulację mikrońaczynki mięśnia szkieletowego, choć tę ogólną technikę można z łatwością zastosować do większości tkanek. W niniejszym manuskrypcie autorzy użyli terminu „tętniczka” w odniesieniu do naczynia oporowego o średnicy od 70-120 μm w spoczynkowym napięciu aktywnym, które jest również głównym czynnikiem regulującym opór perfuzyjny narządu lub tkanki.

Po wprowadzeniu pewnych modyfikacji system ten może zostać dostosowany do w...