Tworzenie przejściowych porów w błonie komórkowej przy użyciu standardowej drukarki atramentowej

Podsumowanie

Opis metod wykorzystanych do przekształcenia drukarki HP DeskJet 500 w biodrukarkę. Drukarka jest zdolna do przetwarzania żywych komórek, co powoduje powstanie przejściowych porów w błonie. Pory te mogą być wykorzystane do wprowadzania małych cząsteczek, w tym fluorescencyjnej G-aktyny, do wydrukowanych komórek.

Streszczenie

Biodruk znajduje szerokie zastosowanie i ma duże znaczenie w wielu obszarach, w tym w inżynierii tkankowej, terapiach opartych na bezpośrednim wprowadzaniu komórek oraz w mikrofabrykacji biosensorów.^1-10 Niedawno druk termiczny atramentowy został wykorzystany również do transfekcji genów.^8,9 Wykazano, że proces termicznego druku atramentowego powoduje tymczasowe przerwanie ciągłości błon komórkowych bez wpływu na żywotność komórek. Przejściowe pory w błonie mogą być wykorzystane do wprowadzania do cytoplazmy komórki cząsteczek, które w innym przypadku byłyby zbyt duże, aby przeniknąć przez błonę.^8,9,11

Prezentowana tutaj aplikacja dotyczy wykorzystania termicznego druku atramentowego do wprowadzania fluorescencyjnie znakowanych monomerów g-aktyny do komórek. Zaletą stosowania termicznego druku atramentowego do wstrzykiwania cząsteczek do komórek jest fakt, że technika ta jest stosunkowo łagodna dla komórek.^{8, 12} Wykazano, że żywotność komórek po drukowaniu jest zbliżona do żywotności przy standardowych metodach wysiewu komórek^1,8. Ponadto druk atramentowy pozwala na opracowanie tysięcy komórek w ciągu kilku minut, co jest znacznie szybsze niż ręczna mikroiniekcja. Wykazano, że pory powstałe w wyniku drukowania zamykają się w ciągu około dwóch godzin. Istnieje jednak ograniczenie wielkości tworzonego poru (~10 nm) w tej technice drukowania, co ogranicza możliwość wstrzykiwania do komórek niewielkich białek i/lub cząsteczek. ^8,9,11

Standardową drukarkę HP DeskJet 500 zmodyfikowano w celu umożliwienia drukowania komórek.^{3, 5, 8} Usunięto obudowę drukarki, a mechanizm podawania papieru pominięto za pomocą dźwigni mechanicznej. Stworzono stolik umożliwiający umieszczenie szkiełek i szkiełek nakrywkowych bezpośrednio pod głowicą drukującą. Wkładniki z tuszem otwarto, usunięto z nich tusz i oczyszczono przed użyciem do drukowania komórek. Wzór druku przygotowano w standardowym programie graficznym, który następnie sterował drukarką za pomocą prostej komendy drukowania. Fibroblasty 3T3 hodowano do konfluencji, poddano trypsynizacji, a następnie zawieszono w soli fizjologicznej z rozpuszczalnymi, fluorescencyjnie znakowanymi monomerami g-aktyny. Zawiesinę komórkową wprowadzono pipetą do wkładnika, a następnie linie komórek wydrukowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Żywe komórki obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, stwierdzając obecność aktyny w całej cytoplazmie. Wbudowanie fluorescencyjnej aktyny do komórki umożliwia obrazowanie krótkotrwałej dynamiki cytoszkieletu i jest przydatne w szerokim zakresie zastosowań.^13-15

Protokół

1. Przystosowanie drukarki HP DeskJet 500

Należy zauważyć, że technika ta powinna działać z wieloma komercyjnymi drukarkami atramentowymi. Jednak starsze drukarki mają tendencję do lepszego działania, ponieważ wykorzystują wkłady z dyszami o większej średnicy, które nie zapychają się tak łatwo. Ponadto starsze drukarki zazwyczaj posiadają mechaniczne czujniki podawania papieru, które łatwiej jest ominąć. Drukarki z czujnikami optycznymi można oszukać, stosując mały pasek papieru na dalekiej krawędzi drukarki podczas każdego cyklu, jednak jest to nieco trudniejsze niż w przypadku systemu mechanicznego. Obecnie dostępne w sprzedaży drukarki, które sprawdzają się najlepiej, mają niską rozdzielczość (DPI).

Drukarki o wyższej rozdzielczości mają tendencję do częstszego zapychania się. Rozdzielczość drukarki HP Deskjet 500 wynosi 300 DPI. Na rynku dostępnych jest wiele drukarek (z serii HP Deskjet i inne), które mają rozdzielczość 600 DPI. Tego typu drukarki można stosować przy niewielkim wzroście problemów z zapychaniem się dysz, co można zniwelować poprzez staranne czyszczenie (sekcja 3).

1. Zdejmij górną plastikową obudowę drukarki, odblokowując kilka plastikowych zatrzasków w dolnej podstawie urządzenia i powoli podnosząc górną część do góry.
2. Odkręć panel przycisków/wyświetlacza z góry drukarki, pozostawiając go podłączonym do płyty głównej urządzenia.
3. Oczyść wnętrze drukarki, szczególnie obszary, w których spoczywa kartridż z tuszem oraz miejsca, w których odbywa się druk.
4. Zlokalizuj kable doprowadzające zasilanie do mechanizmów podawania papieru i odłącz je od płyty głównej.
   1. W modelu HP DeskJet 500 znajdują się one tuż poniżej tacy papieru, po lewej stronie z przodu.
5. Zlokalizuj mechanizm wykrywania papieru. Omiń ten mechanizm, mocując sznurek lub pętlę z drutu, która będzie służyć jako ręczny uchwyt do pociągania.
   1. W modelu HP DeskJet 500 mechanizm wykrywania papieru to szara plastikowa dźwignia znajdująca się powyżej i za mechanizmem drukowania/podawania papieru.
6. Stwórz platformę przed mechanizmem podawania papieru (w miejscu, z którego papier byłby pobierany i w którym byłby składany), aby podnieść wybrane szkiełka do druku na poziom tuż poniżej głowicy drukującej kartridża.
   1. W naszych eksperymentach wykorzystano piankowy uchwyt transportowy do probówek wiriówek 15 mL, w którym w obszarze druku przyklejono taśmą kilka szkiełek mikroskopowych, aby osiągnąć pożądaną wysokość końcową szkiełek.
7. W celu zachowania zasad aseptyki drukarkę można umieścić w standardowej komorze bezpieczeństwa biologicznego lub w blatowej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
8. Należy pamiętać, że modyfikacja dostępnej komercyjnie drukarki atramentowej zazwyczaj powoduje utratę gwarancji producenta.

2. Przerabianie standardowych wkładów z tuszem HP (czarny wkład z tuszem HP 26)

1. Wyjmij wkład z opakowania, pozostawiając na razie taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą.
2. Ustabilizuj korpus wkładu (część czarna) za pomocą zacisku lub imadła (zazwyczaj wystarczy również mocne przytrzymanie wkładu ręką), tak aby zielna górna część była wolna od przeszkód.
3. Używając kombinerek lub klucza nastawnego, chwyć zielną górną część wkładu i skręcaj nią kilka razy w przód i w tył, aż się oddzieli.
   1. Nie powinno to wymagać dużej siły, jednak górna część nie jest już potrzebna, więc jej uszkodzenie podczas usuwania jest dopuszczalne.
4. Używając śrubokrętów, podważ i usuń odsłonięty przezroczysty plastikowy element.
   1. Ponownie, nie powinno to wymagać dużej siły, ale element ten nie będzie potrzebny, więc jego uszkodzenie podczas usuwania jest dopuszczalne.
5. Opróżnij pozostałą zawartość zbiornika.
6. Usuń plastikową taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą.
7. Dokładnie przepłucz zbiorniki wodą.
   1. Użyj pipety lub strzykawki, aby przepchnąć wodę przez kanały.
   2. W trakcie tego procesu woda prawdopodobnie będzie wyciekać z głowicy drukującej; jest to zjawisko dopuszczalne i nie wpływa na funkcjonalność wkładu.
8. Gdy woda będzie czysta, pozostaw wkład do wyschnięcia.

3. Czyszczenie wkładu z tuszem

1. Aby zapewnić czystość środowiska druku, wkład inkustowy należy oczyścić przed i po użyciu.
   1. Pomaga to również zapobiegać krystalizacji soli i innych materiałów biologicznych we wkładzie, co mogłoby doprowadzić do powstania zatorów.
2. Zanurz wkład całkowicie w zlewce z wodą dejonizowaną i poddaj działaniu ultradźwięków przez 15 minut przed i po drukowaniu.
3. Po sonikacji wyjmij wkład z wody i wytrzęś nadmiar cieczy.
4. Spryskaj wnętrze wkładu 70% etanolem, aby zapewnić bardziej aseptyczne warunki.
   1. Upewnij się, że etanol całkowicie odparował przed dodaniem roztworu biotuszowego do druku.

4. Przygotowanie zawiesiny komórkowej - „bioatramentu”

1. Hoduj komórki do momentu przygotowania do pasażowania.
   1. W przypadku fibroblastów 3T3: wysiej komórki na kolby T-75 w zagęszczeniu około 1,3x10⁴ komórek/cm² w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z 10% FBS (płytka cielęca). Hoduj komórki przez dwa dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.
2. Przygotuj roztwór zapasowy fluorescencyjnej g-aktyny o stężeniu 50 μg/ml w buforze fosforanowym (PBS).
3. Przeprowadź pasażowanie komórek.
   1. W przypadku fibroblastów 3T3: usuń medium z kolby i wypłucz dwukrotnie za pomocą PBS. Przykryj komórki 5 ml 0,25% trypsyny z EDTA i inkubuj przez 5 minut.
   2. Dodaj 5 ml świeżego medium, przenieś zawiesinę komórkową pipetą do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przy 1000 rpm przez 5 minut. Odessaj zużyte medium.
4. Resuspenduj komórki w PBS z roztworem zapasowym fluorescencyjnej g-aktyny, aby przygotować biotusz.
   1. Biotusz powinien mieć końcowe stężenie g-aktyny 10 μg/ml oraz stężenie komórek 1x10⁵ komórek/ml. Stężenie to zostało zoptymalizowane w celu ograniczenia liczby komórek w kropli oraz zapobiegania zapychaniu się głowicy drukarki.⁸
   2. Należy pamiętać, że 250 μl biotuszu wystarcza do wydrukowania trzech szkiełek nakrywkowych z wzorem przedstawionym na Rysunku 2.

5. Biodruk

1. Włączyć urządzenie i pozwolić drukarce się rozgrzać.
2. Umieścić wybraną powierzchnię do druku (w tym przypadku szkiełka podstawowe 22 mm x 22 mm) w centrum stolika przygotowanego w kroku 1.6.
3. Utworzyć plik z wzorem druku.
   1. Otworzyć program Microsoft Word (lub dowolne inne oprogramowanie graficzne) i narysować pożądany wzór.
   2. Wybrać odpowiedni wzór druku do nanoszenia komórek w przygotowanym pliku.
4. Napełnić przygotowany wkład pożądaną zawiesiną komórkową.
   1. Nanieść zawiesinę do małego okrągłego otworu na dnie komory wkładu. Użyć około 100-120 μl roztworu. Wielkość wydrukowanej kropli wynosi około 130 picoliterów.⁸
5. Wydrukować plik za pomocą drukarki HP Deskjet 500.
   1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, mniejsze wzory należy wydrukować wielokrotnie (5 razy), zmieniając liczbę kopii w programie do edycji tekstu.
6. Drukarka ponownie się rozgrzeje, a następnie wkład przemieści się do „pozycji gotowości”.
7. Gdy wkład znajdzie się w pozycji gotowości (nieco na lewo od otworu na kroplę tuszu poniżej i pozostanie w tym miejscu), należy pociągnąć w górę drut mechanizmu podawania papieru, co powinno rozpocząć druk.
   1. W przypadku wydruku wielu kopii, mechanizm podawania papieru musi być zwalniany po każdym cyklu lub wydrukowanej stronie. Wkład powróci wówczas do „pozycji gotowości”, a drut mechanizmu podawania papieru należy ponownie unieść.
8. Drukarka naniesie wzór na szkiełko podstawowe umieszczone w centrum stolika drukarskiego w kroku 5.2 (patrz Rysunek 2).

6. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne wyniki całego procesu konwersji standardowej, dostępnej w sprzedaży drukarki HP Deskjet 500 z wykorzystaniem standardowych wkładów z serii HP 26 pozwolą na stworzenie urządzenia zdolnego do drukowania zawiesin komórkowych dla wielu typów analiz, o których wspomniano wcześniej. Gotowa drukarka po konwersji przedstawiona jest na Rysunku 3, z etapem drukowania służącym do umieszczania szkiełek nakrywkowych mikroskopu. Drukarka ta może być użyteczna w analizach w wielu dziedzinach, w tym między innymi w: mechanice pojedynczych komórek, inżynierii tkankowej, transfekcji genów, mikrowzorcowaniu biosensorów oraz bezpośrednich terapiach komórkowych. ^{1-10, 16-22}

W niniejszym przykładzie zmodyfikowano drukarkę HP Deskjet 500 oraz wkłady z tuszem z serii HP 26 do celów biodrukowania. Przy wykorzystaniu tej konfiguracji drukarki oraz bioatramentu składającego się z zawiesiny fibroblastów w roztworze monomeru g-aktyny, komórki zostały wydrukowane na szklanych szkiełkach przedmiotowych do mikroskopu. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki wydrukowanych fibroblastów, w których widoczne są wbudowane fluorescencyjne monomery aktyny. Wyniki uzyskano w kontrolowanym środowisku aseptycznym, w którym komórki drukowano w formie konfigurowalnych wzorów.

Wzorzec użyty w tym przykładzie został stworzony w programie Microsoft Word (Rysunek 2). Wzorzec ten pozwolił na utworzenie ciągłej linii z roztworu drukującego na większości powierzchni szkiełka przedmiotowego. Rysunek 4 przedstawia linię prostą, w której biotusze i komórki są nanoszone jednocześnie. Należy zauważyć, że bezpośrednio po drukowaniu następuje wzrost fluorescencji tła, ponieważ roztwór biotuszu, w którym zawieszone są komórki, zawiera wolne, nadmiarowe fluorescencyjne monomery aktyny. Fluorescencja tła ta znacznie maleje po dodaniu do komórek pożywki wzrostowej (Rysunek 1), co pozwala na wypłukanie nadmiaru monomeru z podłoża.

Rycina 1. Reprezentatywne obrazy fibroblastów 3T3 3 godziny po wydrukowaniu za pomocą zmodyfikowanej drukarki atramentowej. Wnętrze komórek wykazuje wbudowane monomery aktyny znakowane fluorescencyjnie. Paski skali reprezentują 50 μm.

Rysunek 2. Projekt zastosowany do drukowania bioatramentu.

Rysunek 3. Drukarka po konwersji z platformą ze styropianu. Pomarańczowy przewód w środku omija czujnik dźwigni podawania papieru.

Rycina 4. Reprezentatywny obraz fibroblastów 3T3 wydrukowanych w zlokalizowanej strefie drukowania. Obraz mikroskopowy wykonany 5 minut po drukowaniu przy 20-krotnym powiększeniu.

Rysunek 5. Obraz fluorescencyjny (powiększenie 40x) wykonany 3 godziny po druku, przedstawiający fibroblast z zinternalizowanymi fluorescencyjnymi monomerami aktyny. Pasek skali odpowiada 50 μm.

Rysunek 6. Mikroskopia fluorescencyjna (powiększenie 20x) komórki wykonana 15 minut po wydruku. Obraz przedstawia zarówno g-aktynę (zielony), jak i jądro komórkowe (niebieski). Od lewej do prawej: g-aktyna z Alexa Fluor 488, jądro z DAPI oraz nałożenie obu obrazów.

Rysunek 7. Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca dwa fibroblasty w układzie liniowym 3 godziny po drukowaniu. Obraz po lewej pokazuje fluorescencyjnie znakowane monomery aktyny wewnątrz komórek. Obraz po prawej jest nałożeniem kanału fluorescencyjnego na obraz tła, aby wykazać, że mimo obecności niektórych zanieczyszczeń na szkiełku (lewy dolny róg), nie wykazują one fluorescencji. Paski skali reprezentują 50 μm; jeśli rozmiar nie jest wskazany, po prawej stronie znajduje się grupa kontrolna niedrukowanych komórek inkubowanych przez 3 godziny z fluorescencyjnie znakowanymi monomerami. Kontrola ta ma na celu wykazanie, że monomery nie mogły przeniknąć przez błonę komórkową bez jej permeabilizacji podczas drukowania komórek.

Dyskusja

Proces przystosowania standardowej biurkowej drukarki atramentowej do biodrukowania nie jest szczególnie trudny. Najbardziej wymagającym krokiem jest ustalenie sposobu obejścia mechanizmu podawania papieru, co zależy od marki i modelu użytej drukarki. Jest to jednak stosunkowo proste, gdy czujnik podawania papieru jest mechaniczny, jak opisano w niniejszym opracowaniu. W przypadku modeli z optycznymi czujnikami podawania konieczne może być zastosowanie innych technik, aby oszukać drukarkę, by „myślała”, że korzysta z papieru; na przykład można przeprowadzić niewielki kawałek papieru przez drukarkę w czasie, gdy ta drukuje na szkiełku przedmiotowym. Obejście mechanizmu podawania papieru jest prawdopodobnie najtrudniejszym etapem wdrażania tych procedur w różnych modelach drukarek.

Podczas konstruowania platformy do utrzymywania szkiełek nakrywkowych podczas drukowania ważne jest zapewnienie odpowiedniego wyrównania i wysokości. Platforma powinna umożliwiać umieszczenie szkiełka nakrywkowego w środku obszaru drukowania. Ponadto powinna ona pozycjonować szkiełko nakrywkowe na odpowiedniej wysokości, aby zapewnić prześwit pozwalający na przejście kartridża drukującego nad szkiełkiem bez jego naruszania. Dokładna wysokość platformy będzie zależeć od modelu drukarki.

Aby zapobiec wypłukaniu wydrukowanych komórek, preparaty bezpośrednio po drukowaniu umieszczono w inkubatorze na około 30 minut w celu umożliwienia adhezji komórek przed dodaniem dodatkowej pożywki do wzrostu komórek. Ponieważ komórki zostały wydrukowane w roztworze zawierającym duże ilości PBS, nie uległy one wysuszeniu i pozostały żywe. Komórki obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby zwizualizować rozkład znakowanych monomerów g-aktyny wewnątrz komórki (Ryciny 1, 5-7). W przypadku drukowania fibroblastów 3T3, Rycina 5 przedstawia reprezentatywny wynik, w którym aktyna powoduje fluorescencję większości komórki, wykazując jednocześnie linie o zwiększonej jasności. Inkorporacja znakowanej fluorescencyjnie g-aktyny do cytoszkieletu jest przydatna w badaniu dynamiki cytoszkieletu i mechaniki komórkowej.^12-15 Ograniczeniem tej techniki jest to, że ma ona zastosowanie wyłącznie do cząsteczek i białek o średnicy mniejszej niż około 10 nm.

Aby upewnić się, że komórki są faktycznie przetwarzane przez przekształconą drukarkę, do bioatramentu dodano DAPI (1:5000 w PBS) w miejsce połowy objętości czystego PBS. Fluorescencyjny barwnik DAPI wiąże się z bogatymi w aminokwasy fragmentami DNA znajdującymi się w jądrze komórkowym. Dlatego DAPI jest przydatnym barwnikiem do obrazowania fluorescencyjnego jąder wydrukowanych komórek. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywny obraz komórki wykazującej fluorescencję zarówno Alexa Fluor 488 (aktyna), jak i DAPI (jądro), wraz z obrazem nałożonym z obu barwnikami. Rysunek 7 ilustruje również, w jaki sposób komórki będą fluorescować po wbudowaniu monomerów g-aktyny, podczas gdy materiał niebiologiczny naniesiony na próbkę nie będzie fluorescował ze względu na brak monomerów g-aktyny.

Ważnym aspektem biodrukowania jest dobór środowiska wodnego stosowanego w bioatramencie. Stwierdzono, że użycie standardowych pośrodków do hodowli komórkowej z dodatkiem surowicy prowadzi do niespójnych wyników. Jest to najprawdopodobniej spowodowane zatykaniem się dysz głowicy drukującej przez białka surowicy. Zastosowanie PBS zwiększyło powtarzalność wydruków oraz liczbę naniesionych komórek. Wadą stosowania PBS jest fakt, że komórki nie powinny pozostawać w zawiesinie przez zbyt długi czas. Niemniej jednak fibroblasty w przedstawionych przykładach tolerowały warunki bioatramentu przez co najmniej godzinę bez zmiany żywotności komórek. Jest to zgodne z wieloma wcześniejszymi doniesieniami, według których komórki drukowane za pomocą mechanizmów termicznego druku atramentowego wykazują wysoki stopień przeżywalności.^2-8

Tę zmodyfikowaną konfigurację drukarki można wykorzystać w zastosowaniach innych niż drukowanie komórek. ^16-22 Białka macierzy, takie jak kolagen lub fibronektyna, mogą być za pomocą tej techniki łatwo drukowane na podłożach, co może być przydatne przy tworzeniu wzorów komórkowych. Na przykład kolagen typu I wydrukowany w formie linii pozwoli na uzyskanie uporządkowanych podłoży kolagenowych, które mogą być wykorzystane w badaniach hodowli komórkowych in vitro.¹⁷ Oprócz białek macierzy inne cząsteczki, w tym czynniki wzrostu, mogą być wiarygodnie lokalizowane na podłożach do badań komórkowych i potencjalnych zastosowań terapeutycznych.¹⁸

Głównym ograniczeniem konstrukcji opisanej w poprzednich krokach jest fakt, że drukarka ta nie jest zdolna do drukowania w więcej niż jednym wymiarze. Ogranicza to potencjalne zastosowania w aplikacjach wzorzystych, takich jak drukowanie rusztowań. Aby umożliwić druk 3D, konieczne jest zastosowanie specjalistycznego stolika. Stolik ten musi posiadać możliwość stopniowej regulacji wysokości w celu warstwowego nanoszenia bioatramentu.

Biodruk wykazuje duży potencjał jako wydajna i kosztowo efektywna metoda inżynierii tkankowej, transfekcji genów, mikrowzorowania oraz wytwarzania mikroarrayów.^{1-12, 16-22} Przyszłe zastosowania tego typu urządzeń są liczne i obejmują m.in.: tworzenie kontrolowanych i ustrukturyzowanych mikrośrodowisk komórkowych, wprowadzanie makromolekuł do cytoplazmy komórek oraz osadzanie komórek na rusztowaniach i strukturach, które nie występują naturalnie lub nie są tworzone w sposób efektywny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Wycofany z produkcji. Zakupiony odnawiany model DEC Trader.
Czarny wkład z tuszem HP 26	Hewlett-Packard	51626A
Aktyna z mięśnia królika, koniugat Alexa Fluor 488, 200 μg	Invitrogen	A12373
Fosforanowy bufor solny (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Podłoże DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3002201
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F4135
Amfoterycyna B	Sigma-Aldrich	A2942	Stosowana w stężeniu 0,5% w pożywkach do hodowli komórkowej
Penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333	Stosowana w stężeniu 0,5% w pożywkach do hodowli komórkowej
Clean Bench z jednokierunkowym przepływem powietrza	Envirco	VLF 797	Opcjonalna obudowa do utrzymania sterylności drukarki