Tworzenie przejściowych porów błony komórkowej za pomocą standardowej drukarki atramentowej

Podsumowanie

Opis metod używanych do konwersji drukarki HP DeskJet 500 na biodrukarkę. Drukarka jest w stanie przetwarzać żywe komórki, co powoduje przejściowe pory w membranie. Pory te można wykorzystać do wprowadzania małych cząsteczek, w tym fluorescencyjnej G-aktyny, do drukowanych komórek.

Streszczenie

Bioprinting ma szeroki zakres zastosowań i znaczenia, w tym inżynierię tkankową, bezpośrednie terapie komórkowe i mikrofabrykację biosensorów. ^1-10 Ostatnio termiczny druk atramentowy jest również używany do transfekcji genów. ^8,9 Wykazano, że proces termicznego druku atramentowego tymczasowo zakłóca błony komórkowe bez wpływu na ich żywotność. Przejściowe pory w błonie można wykorzystać do wprowadzenia cząsteczek, które w przeciwnym razie byłyby zbyt duże, aby przejść przez błonę, do cytoplazmy komórki. ^8,9,11

Zastosowanie, które tutaj demonstrujemy, to wykorzystanie termicznego druku atramentowego do wprowadzania fluorescencyjnie znakowanych monomerów g-aktyny do komórek. Zaletą stosowania termicznego druku atramentowego do wstrzykiwania cząsteczek do komórek jest to, że technika ta jest stosunkowo łagodna dla komórek. ^{8, 12} Wykazano, że żywotność komórek po wydrukowaniu jest podobna do standardowych metod powlekania komórek^1,8. Ponadto druk atramentowy może przetwarzać tysiące komórek w ciągu kilku minut, co jest znacznie szybsze niż ręczne mikroiniekcja. Wykazano, że pory powstałe w wyniku drukowania zamykają się w ciągu około dwóch godzin. Istnieje jednak ograniczenie wielkości porów utworzonych (~10 nm) przy tej technice drukowania, co ogranicza technikę do wstrzykiwania komórek z małymi białkami i/lub cząstkami. ^8,9,11

Standardowa drukarka HP DeskJet 500 została zmodyfikowana, aby umożliwić drukowanie komórkowe. ^{3, 5, 8} Zdjęto pokrywę drukarki, a mechanizm podawania papieru został ominięty za pomocą dźwigni mechanicznej. Stworzono stolik umożliwiający umieszczenie preparatów mikroskopowych i nakrywkowych bezpośrednio pod głowicą drukującą. Wkłady atramentowe zostały otwarte, atrament został usunięty i zostały one oczyszczone przed użyciem z ogniwami. Wzór drukarski został stworzony za pomocą standardowego oprogramowania do rysowania, które następnie sterowało drukarką za pomocą prostego polecenia drukowania. Fibroblasty 3T3 hodowano do konfluencji, trypsynizowano, a następnie ponownie zawieszano w buforze fosforanowym soli fizjologicznej z rozpuszczalnymi, znakowanymi fluorescencyjnie monomerami g-aktyny. Zawiesinę komórek pipetowano do wkładu atramentowego, a linie komórek drukowano na szklanych szkiełkach okładkowych mikroskopu. Żywe komórki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a aktynę znaleziono w całej cytoplazmie. Włączenie aktyny fluorescencyjnej do komórki pozwala na obrazowanie krótkotrwałej dynamiki cytoszkieletu i jest przydatne w szerokim zakresie zastosowań. ^13-15

Protokół

1. Konwersja HP DeskJet 500

Należy zauważyć, że ta technika powinna działać z wieloma komercyjnymi drukarkami atramentowymi. Jednak starsze drukarki zwykle działają lepiej, ponieważ używają wkładów atramentowych z dyszami o większej średnicy, które nie zapychają się tak łatwo. Ponadto starsze drukarki mają tendencję do używania mechanicznych czujników podawania papieru, które są łatwiejsze do obejścia. Drukarki z czujnikami optycznymi można oszukać, ale przy użyciu małego paska papieru na dalszej krawędzi drukarki podczas każdego cyklu, ale jest to nieco trudniejsze niż system mechaniczny do "oszukania". Obecnie dostępne na rynku drukarki, które działają najlepiej, mają niską rozdzielczość (DPI).

Drukarki o wyższej rozdzielczości mają tendencję do łatwiejszego zapychania się. Rozdzielczość HP Deskjet 500 wynosi 300 DPI. Na rynku dostępnych jest wiele drukarek (seria HP Deskjet i inne), które mają rozdzielczość 600 DPI. Ten typ drukarki może być używany tylko przy niewielkim wzroście problemów z zatykaniem dysz, które można złagodzić poprzez staranne czyszczenie (sekcja 3).

1. Zdejmij górną plastikową obudowę drukarki, odblokowując kilka plastikowych klipsów z dolnej podstawy drukarki i powoli podnosząc górną część.
2. Odkręć panel przycisków/wyświetlacza od góry drukarki, pozostawiając go podłączonego do płyty głównej drukarki.
3. Wyczyść wnętrze drukarki, zwłaszcza miejsca, w których spoczywa pojemnik z tuszem i gdzie odbywa się drukowanie.
4. Zlokalizuj zasilające mechanizmy podawania papieru i odłącz je od płyty głównej.
   1. W drukarce HP DeskJet 500 znajdują się one tuż pod tacą papieru po lewej stronie przodu.
5. Zlokalizuj mechanizm wykrywania papieru. Omiń mechanizm, przymocowując sznurek lub drucianą pętlę, która służy jako ręczny uchwyt.
   1. W drukarce HP DeskJet 500 mechanizmem wykrywania papieru jest szara plastikowa dźwignia znajdująca się nad i za mechanizmem drukowania/podawania papieru.
6. Utwórz stolik przed mechanizmem podawania papieru (z którego papier byłby podawany i odkładany), aby sprowadzić żądane slajdy drukowania do poziomu tuż poniżej głowicy drukującej kasety.
   1. W naszych eksperymentach użyto uchwytu do transportu pianki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml z kilkoma szkiełkami mikroskopowymi przyklejonymi taśmą w obszarze drukowania, aby doprowadzić końcowy poziom szkiełek do żądanej wysokości.
7. Aby zachować technikę aseptyczną, drukarkę można umieścić w standardowej szafie na zagrożenia biologiczne lub okapie z przepływem laminarnym.
8. Należy pamiętać, że modyfikacja dostępnej na rynku drukarki atramentowej zwykle powoduje unieważnienie gwarancji producenta drukarki.

2. Konwersja standardowych wkładów atramentowych HP (wkład atramentowy HP 26)

1. Wyjmij kasetę z opakowania, pozostawiając na razie taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą.
2. Ustabilizuj korpus wkładu (część) za pomocą zacisku lub imadła (po prostu mocne trzymanie wkładu ręcznie, zwykle również działało), pozostawiając zieloną górę z dala od wszelkich przeszkód.
3. Za pomocą szczypiec lub klucza nastawnego chwyć zieloną górną część wkładu i przekręć kilka razy w przód iw tył, aż się uwolni.
   1. Nie powinno to wymagać dużej siły, ale górna część nie jest już potrzebna, więc w porządku, jeśli pęknie podczas zdejmowania.
4. Za pomocą śrubokrętów podważ teraz odsłonięty przezroczysty plastikowy element.
   1. Ponownie, nie powinno to wymagać dużej siły, ale nie będzie potrzebne, więc w porządku, jeśli pęknie podczas usuwania.
5. Opróżnij resztki ze zbiornika.
6. Usuń plastikową taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą.
7. Dokładnie przepłucz zbiorniki wodą.
   1. Użyj pipety lub strzykawki, aby przepchnąć wodę przez kanały.
   2. Podczas tego procesu z głowicy drukującej prawdopodobnie wycieknie woda; jest to dopuszczalne i nie powoduje żadnych szkód w działaniu wkładu.
8. Gdy woda jest czysta, pozostaw wkład do wyschnięcia.

3. Czyszczenie wkładu atramentowego

1. Aby utrzymać czyste środowisko drukowania, wkład atramentowy należy czyścić przed i po użyciu.
   1. Pomaga to również uniknąć krystalizacji soli i innego materiału biologicznego we wkładzie , który mógłby powodować zatory wodne.
2. Całkowicie zanurz wkład w zlewce pełnej wody dejonizowanej i poddaj sonizacji przez 15 minut przed i po drukowaniu.
3. Po sonikacji wyjmij wkład z wody i wytrząśnij nadmiar wody.
4. Rozpyl 70% etanolu do wkładu, aby stworzyć bardziej aseptyczne środowisko.
   1. Upewnij się, że etanol wyschł przed dodaniem roztworu do drukowania biotuszem.

4. Wykonywanie zawiesiny komórek - "Bioink"

1. Hoduj komórki, aż będą gotowe do przejścia.
   1. Dla fibroblastów 3T3: Komórki nasienne na kolbach T-75 w ilości około 1,3x10⁴ komórek/^cm2 w pożywce Dulbeccos Modified Eagles (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Hodować komórki przez dwa dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Przygotować fluorescencyjny roztwór podstawowy g-aktyny o stężeniu 50 μg/ml w roztworze buforowym fosforanu (PBS).
3. Komórki przejściowe.
   1. Dla fibroblastów 3T3: Wyjąć pożywkę z kolby i dwukrotnie przepłukać PBS. Przykryj komórki 5 ml 0,25% trypsyny+EDTA i inkubuj przez 5 minut.
   2. Dodać 5 ml świeżej pożywki i odpipetować zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut. Odsysać zużyte podłoże.
4. Ponownie zawiesić komórki w PBS za pomocą fluorescencyjnego roztworu podstawowego g-aktyny, aby utworzyć biotusz.
   1. Biotusz powinien mieć końcowe stężenie g-aktyny 10 μg/ml i stężenie komórek 1x10⁵ komórek/ml. Stężenie to zostało zoptymalizowane, aby ograniczyć ilość komórek na kroplę i zatkanie głowicy drukarki. ⁸
   2. Należy zauważyć, że z 250 μl biotuszu drukowane są trzy szkiełka nakrywkowe ze wzorem pokazanym na rysunku 2.

5. Drukowanie biologiczne

1. Włącz zasilanie i pozwól drukarce się rozgrzać.
2. Umieść żądaną powierzchnię nadruku (tutaj używamy szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 mm x 22 mm) na środku stołu montażowego przygotowanego w kroku 1.6.
3. Utwórz plik wzorca drukowania.
   1. Otwórz program Microsoft Word (lub dowolne inne oprogramowanie do rysowania) i narysuj żądany wzór.
   2. Wybierz żądany wzór wydruku do wydrukowania komórkowego w gotowym pliku.
4. Załaduj przygotowany wkład żądaną zawiesiną komórek.
   1. Zawiesinę pipety do małego okrągłego dołka na dnie komory wkładu. Użyj około 100-120 μl roztworu. Wydrukowany rozmiar kropli to około 130 pikolitrów. ⁸
5. Wydrukuj plik za pomocą drukarki HP Deskjet 500.
   1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wielokrotnie drukować mniejsze wzory (5), zmieniając żądaną liczbę kopii w edytorze tekstu.
6. Drukarka ponownie się rozgrzeje, a następnie wkład przesunie się do "pozycji gotowości".
7. Gdy kaseta znajdzie się w pozycji gotowości (nieco na lewo od kropli atramentu znacznie poniżej i tam pozostaje), pociągnij do góry przewód mechanizmu podawania papieru i powinno rozpocząć się drukowanie.
   1. W przypadku wielu kopii wydruku mechanizm podawania papieru będzie musiał zostać zwolniony po każdym cyklu lub każdej wydrukowanej stronie. Kaseta powróci wtedy do pozycji "gotowości", a drut mechanizmu podawania papieru powinien zostać ponownie podniesiony.
8. Drukarka będzie drukować na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na środku stolika drukowania w kroku 5.2 (patrz Rysunek 2).

6. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne wyniki całego procesu konwersji standardowych, gotowych do użycia HP Deskjet 500, standardowych kartridży HP serii 26 stworzą drukarkę z możliwością drukowania rozwiązań komórkowych dla wielu typów analiz, jak wspomniano wcześniej. Ukończona drukarka po konwersji jest pokazana na rysunku 3, z etapem drukowania, na którym należy umieścić szkiełko nakrywkowe mikroskopu. Drukarka może być przydatna w analizie w wielu dziedzinach, w tym między innymi: mechanice pojedynczych komórek, inżynierii tkankowej, transfekcji genów, mikrowzorcach biosensorów i bezpośrednich terapiach komórkowych. ^{1-10, 16-22}

W tym przykładzie drukarka HP Deskjet 500 i wkłady atramentowe HP serii 26 zostały zmodyfikowane do biodruku. Korzystając z tej konfiguracji drukarki z biotuszem składającym się z zawiesiny komórek fibroblastów w roztworze monomeru g-aktyny, komórki wydrukowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych mikroskopu. Rysunek 1 ilustruje reprezentatywne wyniki drukowanych komórek fibroblastów, które wykazują włączone fluorescencyjne monomery aktyny. Wyniki uzyskano w kontrolowanym środowisku aseptycznym, w którym komórki zostały wydrukowane w konfigurowalnych wzorach.

Wzorzec użyty w tym przykładzie został utworzony w programie Microsoft Word (Rysunek 2). Wzór ten utworzył ciągłą linię roztworu drukującego na większości szkiełka mikroskopowego. Rysunek 4 przedstawia linię prostą, w której biotusz i komórki są wzajemnie osadzane. Należy zauważyć, że bezpośrednio po wydrukowaniu następuje wzrost fluorescencji tła, ponieważ roztwór biotuszu, w którym zawieszone są komórki, zawiera wolny nadmiar fluorescencyjnych monomerów aktyny. Ta fluorescencja tła znacznie zmniejsza się po dodaniu pożywki wzrostowej do komórek (ryc. 1), która wypłukuje nadmiar monomeru z substratu.

Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy fibroblastów 3T3 3 godziny po wydrukowaniu przy użyciu zmodyfikowanej drukarki atramentowej. Wnętrze komórek wykazuje wbudowane, znakowane fluorescencyjnie monomery aktyny. Podziałka skali wynosi 50 μm.

Rysunek 2. Projekt używany do drukowania biotuszu.

Rysunek 3. Drukarka po konwersji ze stopniem styropianowym. Pomarańczowy przewód pośrodku omija czujnik dźwigni podawania papieru.

Rysunek 4. Reprezentatywny obraz fibroblastów 3T3 wydrukowanych w zlokalizowanej strefie drukowania. Obraz mikroskopowy wykonany 5 minut po wydrukowaniu przy 20-krotnym powiększeniu.

Rysunek 5. Obraz fluorescencyjny (powiększenie 40x) wykonany 3 godziny po wydrukowaniu, przedstawiający fibroblasty z internalizowanymi fluorescencyjnymi monomerami aktyny. Podziałka skali reprezentuje 50 μm.

Rysunek 6. Mikroskopia fluorescencyjna (20-krotne powiększenie) komórki wykonana 15 minut po wydrukowaniu. Na zdjęciu widać zarówno g-aktynę (kolor zielony), jak i jądro (kolor niebieski). Od lewej do prawej: g-aktyna z Alexa Fluor 488, jądro z DAPI i nakładka obu.

Rysunek 7. Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca dwa fibroblasty w linii 3 godziny po wydrukowaniu. Obraz po lewej pokazuje fluorescencyjnie znakowane monomery aktyny wewnątrz komórek. Obraz po prawej stronie to nakładka kanału fluorescencyjnego z obrazem tła, aby pokazać, że chociaż na szkiełku mogą znajdować się pewne zanieczyszczenia (lewy dolny róg), nie fluoryzuje. Paski skali reprezentują 50 μm, jeśli rozmiar nie jest wskazany, skrajnie po prawej stronie znajduje się grupa kontrolna niedrukowanych komórek inkubowanych przez 3 godziny z fluorescencyjnie znakowanymi monomerami. Ta kontrola ma na celu wykazanie, że monomery nie mogą przeniknąć przez błonę komórkową bez przepuszczalności błony przez drukowanie komórek.

Dyskusja

Proces konwersji standardowej biurkowej drukarki atramentowej do biodruku nie jest szczególnie trudny. Najtrudniejszym krokiem jest określenie, w jaki sposób ominąć mechanizm podawania papieru, który zależy od marki i modelu używanej drukarki. Jest to jednak stosunkowo proste, gdy czujnik podawania papieru jest mechaniczny, jak opisano tutaj. W przypadku modeli z optycznymi czujnikami podawania może być konieczne zastosowanie innych technik, aby oszukać drukarkę, aby myślała, że używa papieru; Na przykład można przeciągnąć mały kawałek papieru przez drukarkę podczas drukowania na szkiełku mikroskopu. Ominięcie mechanizmu podawania papieru będzie prawdopodobnie najtrudniejszym krokiem w stosowaniu tych procedur do różnych modeli drukarek.

Podczas konstruowania stolika do przytrzymywania szkiełek nakrywkowych do drukowania ważne jest, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie i wysokość. Stolik powinien umożliwiać umieszczenie szkiełka nakrywkowego na środku obszaru drukowania. Ponadto szkiełko nakrywkowe powinno być umieszczone na odpowiedniej wysokości, aby nabój drukujący mógł przejść przez szkiełko bez jego naruszania. Dokładna wysokość stolika będzie zależeć od modelu drukarki.

Aby upewnić się, że wydrukowane komórki nie zostaną zmyte, szkiełka umieszczono w inkubatorze natychmiast po wydrukowaniu na około 30 minut, aby umożliwić przyłączenie komórek przed dodaniem dodatkowych pożywek do wzrostu komórek. Ponieważ komórki zostały wydrukowane w roztworze zawierającym duże ilości PBS, komórki nie wysychały i pozostawały żywotne. Komórki zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby zobrazować rozmieszczenie znakowanych monomerów g-aktyny wewnątrz komórki (ryc. 1, 5-7). Podczas drukowania z fibroblastami 3T3, rycina 5 pokazuje reprezentatywny wynik, w którym aktyna powoduje fluoryzację dużej części komórki, ale pokazuje linie o zwiększonej jasności. Włączenie fluorescencyjnie znakowanej g-aktyny do cytoszkieletu jest przydatne do badania dynamiki cytoszkieletu i mechaniki komórkowej. ^12-15 Ograniczeniem tej techniki jest to, że ma ona zastosowanie tylko do cząsteczek i białek o średnicy mniejszej niż około 10 nm.

Aby upewnić się, że komórki są rzeczywiście przetwarzane przez przekonwertowaną drukarkę, DAPI (1:5000 w PBS) został dodany do biotuszu zamiast połowy objętości czystego PBS. Barwnik fluorescencyjny DAPI wiąże się z bogatymi w aminokwasy częściami DNA znajdującymi się w jądrze. Dlatego DAPI jest użytecznym barwnikiem w obrazowaniu fluorescencyjnym jąder drukowanych komórek. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywny obraz komórki wykazującej zarówno fluorescencję Alexa Fluor 488 (aktyna), jak i DAPI (jądro) z obrazem nakładki obu. Rysunek 7 ilustruje również, w jaki sposób komórki będą fluoryzować po włączeniu monomerów g-aktyny, podczas gdy materiał niebiologiczny, który został zdeponowany w próbce, nie będzie fluoryzował z powodu braku monomerów g-aktyny.

Jednym z ważnych czynników branych pod uwagę przy biodruku jest podłoże wodne używane do produkcji biotuszu. Stwierdzono, że użycie standardowych pożywek do wzrostu komórek z surowicą dało niespójne wyniki. Jest to najprawdopodobniej spowodowane zatkaniem dysz głowicy drukującej przez białka surowicy. Zastosowanie PBS zwiększyło spójność drukowanych wzorów i liczbę zdeponowanych komórek. Jedną z wad stosowania PBS jest to, że komórki nie powinny być pozostawiane w zawiesinie przez dłuższy czas. Jednak fibroblasty w tych przykładach były w stanie tolerować warunki biotuszu przez co najmniej godzinę bez zmian w żywotności komórek. Jest to zgodne z kilkoma wcześniejszymi odkryciami, które informują, że wykazano, że ogniwa drukowane za pomocą termicznych mechanizmów atramentowych mają wysokie wskaźniki żywotności. ^2-8 Rozdział

Ta zmodyfikowana konfiguracja drukarki może być używana do zastosowań innych niż drukowanie komórkowe. ^16-22 Białka macierzy, takie jak kolagen lub fibronektyna, można łatwo wydrukować na podłożach za pomocą tej techniki, co może być przydatne do tworzenia wzorów komórkowych. Na przykład kolagen typu I wydrukowany we wzorach liniowych spowoduje wyrównanie substratów kolagenowych, które można wykorzystać do badań nad hodowlami komórkowymi in vitro . ¹⁷ Oprócz białek macierzy inne cząsteczki, w tym czynniki wzrostu, mogą być wiarygodnie zlokalizowane na podłożach do badań komórkowych i potencjalnych zastosowań terapeutycznych. ^{Rozdział 18}

Głównym ograniczeniem konstrukcji opisanej w powyższych krokach jest to, że ta drukarka nie jest w stanie drukować w więcej niż jednym wymiarze. Ogranicza to potencjał zastosowania w zastosowaniach z wzorami, takich jak drukowanie rusztowań. Aby umożliwić druk 3D, należy użyć specjalistycznego stolika. Stolik musi mieć stopniową regulację wysokości w celu osadzania biotuszu warstwa po warstwie.

Bioprinting okazał się obiecującą metodą wydajnej i opłacalnej metody inżynierii tkankowej, transfekcji genów, mikrowzorów i wytwarzania mikromacierzy. ^{1-12, 16-22} Przyszłe zastosowania tego typu urządzeń są liczne, w tym: tworzenie kontrolowanych i wzorcowych mikrośrodowisk komórkowych, włączanie makrocząsteczek do cytoplazmy komórki oraz osadzanie komórek na rusztowaniach i strukturach, które nie występują naturalnie lub wydajnie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Wycofano z produkcji producenta. Zakupiono odnowiony DEC Trader.
HP 26 wkład atramentowy	Hewlett-Packard	51626A
Aktyna z mięśnia królika, koniugat Alexa Fluor 488, 200 μ g	Invitrogen	A12373
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F4135
Amfoterycyna B	Sigma-Aldrich	A2942	Stosowana w stężeniu 0,5% w pożywkach do hodowli komórkowych
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333	Stosowana w stężeniu 0,5% w pożywkach do hodowli komórkowych
Jednokierunkowy przepływ Clean Bench	Envirco	VLF 797	Opcjonalna obudowa zapewniająca aseptyczność drukarki