Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3703

⸱

25 czerwca 2012

 ,  , 
1Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Myszy transgeniczne okazały się niezwykle użyteczne w przypisywaniu funkcji fizjologicznych konkretnym genom. W związku z tym badania ogólne, a w szczególności studia funkcjonalne dróg oddechowych, przeszły znaczący zwrot w stronę modeli mysich. W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły badań skurczu tchawicy in vitro w celu oceny funkcji mięśni gładkich w drogach oddechowych myszy.

Streszczenie

Myszy transgeniczne i knockout stanowią potężne narzędzia w badaniu fizjologii i patofizjologii dróg oddechowych1,2. Tensometria in vitro izolowanych preparatów tchawicy okazała się użytecznym testem odpowiedzi skurczowej mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM) u myszy modyfikowanych genetycznie. Te preparaty tchawicy in vitro są stosunkowo proste, zapewniają silną odpowiedź i zachowują zarówno funkcjonalne cholinergiczne zakończenia nerwowe, jak i reakcje mięśniowe, nawet po długiej inkubacji.

Tensometria tchawicy zapewnia również funkcjonalny test do badania różnych szlaków sygnalizacyjnych wtórnych przekaźników, które wpływają na skurcz mięśni gładkich. Skurcz w tchawicy jest pośredniczony głównie przez przywspółczulne nerwy cholinergiczne, które uwalniają acetylocholinę na ASM (Rycina 1). Głównymi receptorami acetylocholiny w ASM są receptory muskarynowe M2 i M3, które są odpowiednio receptorami sprzężonymi z Gi/o i Gq3,4,5. Receptory M3 wywołują skurcz poprzez sprzężenie z Gq w celu aktywacji fosfolipazy C, zwiększenia produkcji IP3 oraz zależnego od IP3 uwalniania wapnia z siateczki sarkoplazmatycznej3,6,7. Uważa się, że sygnalizacja M2/Gi/o nasila skurcze poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej, co prowadzi do obniżenia poziomu cAMP5,8,9,10. Szlaki te stanowią tak zwane „sprzężenie farmako-skurczowe” mięśni gładkich dróg oddechowych11. Dodatkowo sygnalizacja cholinergiczna poprzez receptory M2 (modulowana przez sygnalizację M3) obejmuje szlaki, które depolaryzują ASM, co z kolei aktywuje wapniowe kanały typu L zależne od napięcia (Rycina 1) i napływ wapnia (tzw. „sprzężenie wzbudzenie-skurcz”)4,7. Bardziej szczegółowe przeglądy szlaków sygnalizacyjnych kontrolujących skurcz dróg oddechowych można znaleźć w literaturze4,12. Powyższe szlaki wydają się być zachowane u myszy i innych gatunków. Jednak tchawice myszy różnią się od innych gatunków w niektórych szlakach sygnalizacyjnych. Najbardziej prominentny jest brak odpowiedzi skurczowej na histaminę i adenozynę13,14, które są dobrze znanymi modulatorami ASM u ludzi i innych gatunków5,15.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokoły izolacji pierścieni tchawicy mysiej oraz pomiaru ich zdolności skurczowej in vitro. Zawarto opisy konfiguracji sprzętu, izolacji pierścieni tchawicy oraz pomiarów skurczowych. Przedstawiono przykłady wywoływania skurczów pośrednio za pomocą stymulacji nerwów wysokim stężeniem potasu oraz bezpośrednio poprzez depolaryzację mięśni ASM w celu aktywacji napięciowo zależnego napływu wapnia (1. wysokie K+, Rysunek 1). Dodatkowo zaprezentowano metody stymulacji samych nerwów z wykorzystaniem stymulacji polem elektrycznym (2. EFS, Rysunek 1) lub bezpośredniej stymulacji mięśni ASM przy użyciu egzogennego neurotransmitera dodanego do kąpieli (3. egzogenny ACH, Rysunek 1). Ta elastyczność i łatwość przygotowania sprawiają, że model izolowanego pierścienia tchawicy jest niezawodnym i funkcjonalnym testem dla wielu kaskad sygnalizacyjnych uczestniczących w skurczu mięśni gładkich dróg oddechowych.

Protokół

1. Wyposażenie

Główne elementy urządzenia do pomiaru skurczu przedstawiono schematycznie na Rysunku 2A).

  1. Kąpiel tkankowa. Kąpiel tkankowa utrzymuje natleniony roztwór fizjologiczny w podwyższonej temperaturze. W przypadku pierścieni tchawicy myszy stosujemy kąpiel tkankową o pojemności 10 ml, która posiada płaszcz wodny do cyrkulacji roztworu grzewczego, spiekaną szklaną dyszę do napowietrzania tlenem (mieszanina 95%/5% O2/CO2) oraz porty wlotowe i wylotowe do wymiany roztworów. Zapas roztworu PSS jest przechowywany z ciągłym bąbelkowaniem mieszaniny 95%/5% O2/CO2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C (nie pokazano). Podczas wymiany roztworu, PSS jest pompowany z rezerwuaru do wlotu kąpieli tkankowej (dolny port) z prędkością około 100 ml na minutę, aby umożliwić stosunkowo szybką wymianę. Wylot roztworu odbywa się przez port przelewowy (górny port), co pozwala na utrzymanie stałej objętości (~10 ml) w kąpieli tkankowej podczas wymiany. Do pompowania ciepłej wody przez płaszcz kąpieli tkankowej (w celu utrzymania 37 °C) używamy cyrkulatora grzewczego Haake. Kąpiele tkankowe można nabyć od wielu dostawców; występują w różnych rozmiarach i typach, aby dostosować się do potrzeb badawczych eksperymentatora.
  2. Przetwornik siły. Aby zmierzyć napięcie izometryczne, fragment tchawicy jest nawleczony na L-kształtne końce dwóch prętów ze stali nierdzewnej (Rycina 2A). Należy zadbać o użycie rodzaju stali nierdzewnej kompatybilnej z materiałem biologicznym. Górny pręt jest połączony za pomocą klipsa z izometrycznym przetwornikiem siły. Dolny pręt trzyma tchawicę w stałej pozycji i jest zamocowany na mikrometrze w celu regulacji napięcia pasywnego i/lub długości mięśnia. Skurcz tchawicy generuje napięcie na przetworniku siły, które jest przekształcane w sygnał napięciowy w przedwzmacniaczu. Dolny pręt może być również skonfigurowany tak, aby zawierać dwie prostokątne płytki platynowe (w odstępie 4 mm), które flankują tchawicę (Rycina 2B). Płytki platynowe są podłączone do stymulatora Grass S88, który umożliwia przyłożenie pola elektrycznego do tchawicy. Odsłonięte przewody i luty są pokryte Sylgardem (Sylgard 184 Silicone Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI), aby zapobiec wymywaniu metali do roztworu kąpieli.
  3. Przetwornik A/C, komputer i oprogramowanie do akwizycji danych. Sygnały z przedwzmacniaczy są rejestrowane w systemie MacLab 8 A/D. Jest to starsza wersja obecnie stosowanego sprzętu ADInstrument Powerlab. Używamy programu Chart (ADInstruments), który pozwala na ciągłe rejestrowanie napięcia przez cały czas trwania eksperymentu. Generowanie napięcia przez mięśnie tchawicy jest dość powolne, dlatego uznajemy, że akwizycja 100 punktów na sekundę jest wystarczająca. Pomiar napięcia jest kalibrowany za pomocą znanych ciężarków (do 5 g) przed każdym eksperymentem. Podobne systemy są dostępne u innych dostawców (np. BioPac, GW Instruments).

2. Izolacja tchawki

  1. Przed izolacją tkanki przetwornik siły jest kalibrowany za pomocą znanych odważników, a kąpiel tkankowa jest napełniana normalnym roztworem PSS (patrz Tabela I). Wlot powietrza jest regulowany w celu uzyskania lekkiego strumienia O2/CO2.
  2. Optymalne są tchawice z myszy w wieku dwóch miesięcy lub starszych. Można użyć młodszych zwierząt, ale tchawice pobrane od nich wymagają większej wprawy przy montażu na drutach przetwornika siły ze względu na ich niewielki rozmiar. Przed sekcją myszy są głęboko sedowane izofluranem. Odpowiedni poziom sedacji zostaje osiągnięty, gdy uciśnięcie palca pęsetą nie wywołuje reakcji. Myszy są natychmiast uśmiercane poprzez zwichnięcie szyi. Ważna uwaga: Zaobserwowaliśmy, że Avertin (tribromoetanol), środek sedatywny powszechnie stosowany u myszy, wykazuje silne działanie rozluźniające na mięśnie gładkie dróg oddechowych i dlatego nie powinien być stosowany w badaniach nad skurczem tchawicy.
  3. Skórę (i futro) usuwa się od klatki piersiowej do gardła. Żebra są przecinane od podstawy mostka, bocznie (po obu stronach), do górnej części serca. Następnie mostek i żebra są odciągane do przodu, w stronę gardła, aby odsłonić serce/płuca, grasicę, tchawicę (brzusznie) i przełyk (przylegający do tchawicy i znajdujący się grzbietowo względem niej).
  4. Tchawicę wycina się, przecinając ją poniżej rozwidlenia oskrzeli i powyżej gardła. Tchawicę umieszcza się w lodowatym, natlenionym (95/5) roztworze PSS (skład podany w Tabeli I).
  5. Tchawica jest oczyszczana z tkanek otaczających. Podczas czyszczenia tchawicę można trzymać za gardło lub poniżej rozwidlenia. Należy jednak zachować ostrożność, aby nie przykładam pęsety bezpośrednio do samej tchawicy. Do odcinania tkanek otaczających można użyć drobnych nożyczek, ale cięcie powinno być zawsze prowadzone równolegle do tchawicy, aby uniknąć uszkodzeń. Ta część procedury jest ułatwiona, jeśli preparat tchawicy zostanie przypięty poniżej rozwidlenia i powyżej gardła do naczynia powleczonego Sylgardem (Sylgard 184 Silicone Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI).
  6. Po usunięciu tkanek otaczających tchawica jest przecinana poniżej gardła i powyżej rozwidlenia oskrzeli, a następnie delikatnie montowana na drutach przetwornika siły.
  7. Tchawica jest nawleczona na dwa metalowe trzpienie w kształcie litery L (Rysunek 2A). Jeden trzpień jest połączony z przetwornikiem siły i przemieszczenia do ciągłego rejestrowania napięcia izometrycznego. Drugi trzpień jest połączony z mikrometrem. Następnie podnosi się kąpiel tkankową tak, aby tchawica została zanurzona w PSS. Montaż tchawicy powinien być wykonany jak najszybciej, aby zminimalizować czas przebywania tchawicy poza roztworem PSS. Z praktyką montaż tchawicy można przeprowadzić w ciągu jednej minuty, jednak zazwyczaj unikamy przekraczania 3 minut, aby zapobiec utracie żywotności.
  8. Mikrometr jest powoli regulowany, aby uzyskać napięcie pasywne rzędu ~10 mN (~ 1 gram-siły). Optymalne napięcie spoczynkowe zostało określone empirycznie i stwierdzono, że napięcie pasywne ~ 5 - 10 mN skutkuje równoważną, maksymalną odpowiedzią na stymulację wysokim stężeniem potasu. Jest to zgodne z szeregiem innych badań, w których wykorzystano napięcie pasywne w tym zakresie16,17,18. W ciągu pierwszych 5-10 minut napięcie pasywne tchawicy ma tendencję do lekkiego spadku (zjawisko relaksacji naprężeń), a mikrometrem reguluje się napięcie pasywne do poziomu ~10 mN podczas equilibracji. Tchawicy pozwala się na equilibrację przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem prób doświadczalnych.

3. Stymulacja wysokim stężeniem potasu

Po osiągnięciu stanu równowagi tchawicę poddaje się dwukrotnemu wyzwaniu za pomocą roztworu PSS z wysoką zawartością potasu (67 mM KCl, Tabela I). Skurcz zazwyczaj wymaga ~ 5-10 minut do osiągnięcia stanu stacjonarnego, po czym kąpiel tkankowa jest kilkukrotnie płukana normalnym roztworem PSS, aby całkowicie rozluźnić tchawicę. Skurcz wywołany potasem powtarza się po raz drugi, a w razie potrzeby trzeci, aż do uzyskania powtarzalnych skurczów.

4. Skurcz wywołany stymulacją elektryczną

Tchawica jest flankowana przez dwie prostokątne platynowe płytki (elektrody), które umożliwiają stymulację polem elektrycznym (EFS) preparatu. Odpowiedź skurczowa na EFS jest funkcją częstotliwości i napięcia. Wpływają na nią również parametry fizyczne, takie jak powierzchnia elektrod oraz odległość między nimi. Charakterystyka mocy stymulatora również wpływa na odpowiedzi w taki sposób, że przy wyższych napięciach i natężeniach prądu stymulator może osiągnąć swoje maksimum. Charakterystykę każdego systemu EFS należy określić poprzez badanie odpowiedzi skurczowych mięśni przy różnych czasach trwania bodźca, częstotliwościach, napięciach i czasach trwania impulsu. Dla naszej aparatury eksperymentalnej ustaliliśmy, że elektrody oddalone o ~ 4 mm, amplituda stymulacji 44 V (impulsy 0.5 ms) i częstotliwość 30 Hz są optymalne dla uzyskania powtarzalnych, bliskich maksymalnym odpowiedzi skurczowych.

5. Skurcz wywołany stymulacją cholinergiciczną

Reaktywność tchawicy na egzogennie podane związki ocenia się albo poprzez dodanie pojedynczej dawki badanego leku, albo poprzez wielokrotne dodawanie leku w sposób kumulatywny. W przypadku tchawicy w naszym laboratorium rutynowo stosowano karbachol do aktywacji receptorów cholinergicznych, ponieważ w przeciwieństwie do acetylocholiny, karbachol nie jest degradowany przez acetylocholinoesterazę. Właściwy zakres dawka-odpowiedź obejmuje stężenia karbacholu od 10-8 do 10-5 M. Dopasowanie krzywej Log[karbachol]-odpowiedź skurczowa za pomocą równania typu Hilla pozwala na oszacowanie EC50 (połowicznego maksymalnego stężenia efektywnego), które jest miarą wrażliwości skurczu tchawicy na agonistę cholinergiczny 19. Warto zauważyć, że dana dawka karbacholu wywoła nieco silniejszą odpowiedź jako dawka pojedyncza niż jako element kumulatywnej krzywej dawka-odpowiedź.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład odpowiedzi skurczowej na wysokie stężenie potasu przedstawiono na Ryc. 3A. Skurcz osiąga maksimum w ciągu około 10 minut, po czym może nastąpić niewielki spadek. Podczas początkowego wypłukiwania wysokiego stężenia potasu mięsień może wykazać przejściowy wzrost skurczu, co wynika ze spadku temperatury w momencie, gdy niewielka objętość niepodgrzanego roztworu PSS w liniach doprowadzających przejściowo przepływa przez preparat. Można to zminimalizować, ograniczając objętość martwą w rurkach łączących podgrzewany zbiornik z PSS z kąpielą tkankową, a także poprzez stosunkowo szybką wymianę roztworu (zazwyczaj pompujemy roztwory z prędkością 100 ml/min). Każdy preparat będzie wykazywał pewne różnice w odpowiedzi skurczowej ze względu na różnice w masie mięśnia lub uszkodzenia powstałe podczas sekcji. Ryc. 3B przedstawia dwie tchawice o różnej masie mięśniowej poddane działaniu wysokiego stężenia potasu oraz karbacholu. Chociaż skurcze wywołane cholinergicnie różnią się od siebie, są one zbliżone po normalizacji do odpowiedzi na roztwór z wysokim stężeniem potasu (Ryc. 3C).

Rysunek 4 przedstawia przykład skurczu wywołanego karbacholem (cholinergicznym) przy zastosowaniu pojedynczych dawek (A) oraz kumulatywnego zwiększania dawki (B). Roztwory karbacholu są dodawane bezpośrednio do kąpieli, a wprowadzany gaz pomaga w szybkim mieszaniu. Warto zauważyć, że dodanie pojedynczej dawki (tj. 1 μM, Rysunek 4A) wywołuje nieco silniejszą odpowiedź niż równoważne stężenie podczas kumulatywnej krzywej dawka-odpowiedź (1 μM, Rysunek 4B). Rysunek 4C przedstawia wykres siły skurczu w funkcji stężeń karbacholu na podstawie danych z Rysunku 4B. Efekty działania karbacholu nasycają się przy stężeniu 10-5 M. Chociaż agoniści cholinergiczni inicjują skurcz poprzez mechanizmy uwalniania wapnia, istotna część skurczu jest również pośredniczona przez depolaryzację i aktywację napięciowo-zależnych kanałów wapniowych 20.

Rycina 5A przedstawia przykład skurczów wywołanych przez EFS. Tchawice są stymulowane impulsami o czasie trwania 0,5 ms i napięciu 40 V, aż skurcze osiągną plateau (patrz wstawka a1). Zwiększenie częstotliwości stymulacji powoduje wzrost odpowiedzi skurczowej (krzywa zależność odpowiedzi od częstotliwości przedstawiona jest na Rycynie 5B). Wykazano, że stymulacja polem elektrycznym wywołuje skurcze głównie poprzez aktywację nerwów presynaptycznych. Świadczy o tym efekt toksyny botulinowej, blokera uwalniania neuroprzekaźników, która hamuje większość skurczów tchawicy wywołanych przez EFS 21. Ponadto tetrodotoksyna, środek blokujący kanały Na+, również hamuje aktywność nerwową i eliminuje odpowiedź tchawicy na EFS.

Schemat depolaryzacji komórki z napływem Ca, cAMP, ACH; przedstawia sygnalizację w neuronach cholergicznych.
Rysunek 1. Schemat głównych szlaków sygnalizacyjnych w preparacie izolowanej tchawicy. Przedstawiono zakończenie aksonu cholergicznego unerwiającego komórkę mięśni gładkich tchawicy. Główne szlaki sygnalizacyjne to aktywacja muskarynowych receptorów acetylocholiny (mACHR) typu M3 i M2, które powodują uwalnianie wapnia poprzez receptory IP3 (M3) oraz redukcję cAMP (M2). Receptory M2 (przy częściowym udziale receptorów M3) powodują również wywołaną cholergicznie depolaryzację, która aktywuje napięciozależne kanały wapniowe typu L i napływ wapnia. Typowe czynniki skurczowe i ich efektory to: 1. wysokie stężenie potasu (depolaryzuje komórkę mięśni gładkich i akson cholergiczny), 2. stymulacja polem elektrycznym (EFS, depolaryzuje akson cholergiczny) oraz 3. egzogenna aplikacja czynników cholergicznych, takich jak acetylocholina lub karbachol (bezpośrednio aktywuje receptory muskarynowe).

Układ kąpieli tkankowej, przetwornik siły, eksperyment na tchawicy, schemat, pomiar siły mechanicznej.
Rycina 2. Schemat aparatury użytej do pomiaru skurczów tchawicy. A. Przetwornik siły, mikrometr i kąpiel tkankowa są zamocowane na prętach wspierających za pomocą zacisków śrubowych. Pierścień tchawiczy jest nawleczony na górny i dolny pręt. Na schemacie kąpiel tkankowa znajduje się poniżej preparatu (tj. podczas montażu tchawicy na przetworniku siły). Podczas badań nad skurczami kąpiel tkankowa jest przemieszczana pionowo, aby obmywać preparat. B. W celu stymulacji polem elektrycznym dolny pręt został zmodyfikowany poprzez dodanie dwóch platynowych płytek, które są zamontowane bocznie do drutu podtrzymującego tchawicę. Płytki platynowe są połączone przewodami elektrycznymi ze stymulatorem.

Wykres skurczu mięśni; przedstawia siłę w funkcji czasu pod wpływem stymulacji wysokim stężeniem K* i CCh; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 3. Przykłady odpowiedzi skurczowej tchawicy na wysokie stężenie potasu (67 mM). (A) pokazuje powtarzalne, zduplikowane odpowiedzi na wysokie stężenie potasu. (B) Przykłady odpowiedzi skurczowej na karbachol w dwóch różnych tchawicach. (C) Odpowiedzi tchawic z punktu B są podobne po normalizacji do odpowiedzi na wysokie stężenie potasu.

Wykresy analizy siły skurczu cholergicznego w odpowiedzi na dawkowanie CCh, wizualizacja danych eksperymentalnych.
Rycina 4. Przykłady skurczów indukowanych karbacholem. (A) Skurcze indukowane karbacholem przy zastosowaniu pojedynczych dawek, po których nastąpiło wypłukanie. (B) Przykład kumulatywnej krzywej zależności odpowiedzi od dawki dla tchawicy z punktu A. (C) Szczytowe skurcze z punktu B przedstawione jako funkcja stężenia karbacholu.

Wykres przedstawiający siłę skurczu w funkcji częstotliwości stymulacji; analiza odpowiedzi mięśniowej; wynik naukowy.
Rysunek 5. Przykłady skurczów wywołanych stymulacją polem elektrycznym. (A) Stymulacja polem elektrycznym skurczu tchawicy przy użyciu impulsu 0,5 ms, napięcia 40 V i różnych częstotliwości stymulacji zgodnie z oznaczeniem. Wstawka przedstawia powiększenie czasowe skurczu przy 30 Hz. (B) Szczytowe skurcze z części A przedstawione jako funkcja częstotliwości stymulacji.

Normalny PSS

SólStężenie (mM)Ilość (g/2 L)
NaCl11913.91
KCl4.70.7
KH2PO41.180.32
MgSO4 x 7H2O1.170.58
NaHCO3183.02
EDTA0.0260.1 ml 0.5 M
Glukoza113.96
Saharoza12.58.56
CaCl22400 ml 10 mM

Wysokie stężenie K+ PSS (regulacja NaCl i KCl)

SólStężenie (mM)Ilość (g/2 L)
NaCl56.76.628
KCl679.991

Tabela 1. Skład roztworów PSS. Uwaga: Roztwory są przygotowywane na bieżąco co tydzień, przy użyciu wody ultraczystej, i przechowywane w lodówce nie dłużej niż przez 5 dni, aby uniknąć zanieczyszczenia wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje przygotowanie fizjologiczne służące do oceny funkcji mięśni dróg oddechowych. Zazwyczaj jednocześnie obsługujemy 3-4 układy kąpieli organowych, jednak od wielu dostawców dostępne są gotowe systemy umożliwiające jednoczesny pomiar do 8 preparatów (ADInstruments, World Precision Instruments oraz Harvard Apparatus). Wykorzystaliśmy szereg przetworników siły i kąpieli organowych, uzyskując porównywalne wyniki. Stwierdziliśmy jednak, że stymulacja polem elektrycznym wykazuje pewną zmiennoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantu przyznanego przez Center for Innovation in Prevention and Treatment of Airway Diseases, grantu NINDS (NS052574) oraz z Sandler Program for Asthma Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przetwornik analogowo-cyfrowyfigure-materials-1 ADInstrumentsPowerLab 4/35
Karbachol (chlorek karbamoilocholiny)Sigma-AldrichC483210-2 M w wodzie (alikwoty można przechowywać w -20 °C)
Oprogramowanie do rejestracji danychfigure-materials-2 ADInstrtumentsLabChart
Cyrkulator grzewczyHaakeMixer Mill MM400
Izometryczny przetwornik siłyKent ScientificTRN001
StymulatorGrass TechnologiesS88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Kąpiel tkankowaWPI47264

Bibliografia

  1. Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
  2. Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
  3. Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
  4. Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
  5. Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
  6. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  7. Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
  8. Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
  9. Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
  10. Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
  11. Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
  12. Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
  13. Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
  14. Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
  15. Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
  16. Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
  17. Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
  18. Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
  19. Kenakin, T. P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).
  20. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
  21. Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
  22. Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
  23. Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
  24. Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
  25. Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
  26. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
  27. Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
  28. Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
  29. Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
  30. Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
  31. Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
  32. Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar si y izometrycznejizolacja pier cienia tchawicystymulacja polem elektrycznymstymulacja wysokim st eniem potasuaktywacja receptor w cholinergicznychmi nie g adkie dr g oddechowychpreparat tchawicy mysiejkalibracja k pieli tkankowejkonfiguracja przetwornika si y
In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.