Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste (NSCs) mogą być izolowane i namnażane na dużą skalę z wykorzystaniem metody neurosfer, a następnie różnicowane w trzy główne typy komórek ośrodkowego układu nerwowego (CNS): astrocyty, oligodendrocyty i neurony. Cechy te sprawiają, że neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe stanowią niezwykle cenne, odnawialne źródło komórek do badań in vitro, takich jak screening leków, neurotoksykologia i elektrofizjologia, a także do terapii zastępczej komórek w wielu chorobach neurologicznych. W praktyce jednak heterogenność potomstwa NSCs, niska produkcja neuronów i oligodendrocytów oraz przewaga astrocytów po różnicowaniu ograniczają ich zastosowania kliniczne. W niniejszej pracy opisujemy nową metodologię generowania i późniejszego oczyszczania niedojrzałych neuronów z potomstwa mysich NSCs z wykorzystaniem technologii fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Dzięki zastosowaniu tej metodologii można uzyskać wysoce wzbogaconą populację progenitorowych komórek neuronalnych bez zauważalnego zanieczyszczenia astrocytami i właściwymi NSCs. Procedura obejmuje różnicowanie potomstwa NSCs izolowanych i namnażanych z wyrostków zwojowych myszy w stadium E14 przy użyciu metody neurosfer, a następnie izolację i wzbogacanie niedojrzałych komórek neuronalnych w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i złożoność wewnętrzną) oraz fluorescencyjne z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej. Cały proces zajmuje od 5 do 7 dni w celu wytworzenia neurosfer oraz od 6 do 8 dni w celu zróżnicowania potomstwa NSCs i izolacji wysokiej czystości niedojrzałych komórek neuronalnych.

Protokół

1. Podstawowe przygotowania przed przystąpieniem do hodowli komórkowej

1. Podłoże podstawowe NeuroCult NSC Basal Medium oraz suplementy NeuroCult NSC Proliferation Supplements miesza się w stosunku odpowiednio 9:1, aby przygotować kompletne podłoże do hodowli NSC.
2. A 37 °C Kąpiel wodna służy do ogrzewania pożywki.
3. Odpowiednią ilość inaktywowanego termicznie płodowego surowicy cielęcej (FCS) należy rozmrozić.
4. Odpowiednia ilość roztworów czynników wzrostu z zapasów, w tym czynnika wzrostu naskórka (EGF w stężeniu 10 μg/ml), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF w 10 μg/ml) oraz 0,2% roztwór heparyny w buforze fosforanowym (PBS) zostają rozmrożone.
5. Kolby do hodowli tkankowej (T25, T75 lub &T175) są niezbędne do ekspansji i różnicowania NSC.
6. Do wysiewania posortowanych komórek niezbędne są płytki 96- i 24-dołkowe traktowane do hodowli tkankowych oraz szklane laminki.

2. Izolacja i ekspansja (pasażowanie) NSC

1. Neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe są izolowane i namnażane z mózgu myszy zgodnie z opisami w oddzielnych protokołach ^{1, 2 3}.
2. Gdy neurosfery (pierwotne lub pasażowane) są gotowe do subkultury (średnica 150-200 μm), pożywka zawierająca sfery jest przenoszona do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej pojemności i wirowana z prędkością 800 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Nadmiar pożywki jest usuwany, a sfery są zawieszane ponownie w 1 ml uprzednio ogrzanej 0.05 % trypsyny-EDTA.
4. Po inkubacji w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 2-3 min, do zawiesiny komórkowej dodaje się taką samą objętość inhibitora trypsyny z soi w celu zahamowania aktywności trypsyny.
5. Aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie dezaktywowana, zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół 3-5 razy.
6. Po wirowaniu z prędkością 800 rpm (110 g) przez 5 min, nadmiar cieczy jest usuwany, a komórki są zawieszane ponownie w 1 ml pełnej pożywki NSC.
7. 10 μl zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μl błękitu trypanu w celu przeprowadzenia zliczenia komórek.
   Uwaga: Można stosować inne odpowiednie rozcieńczenia komórek.
   
8. Następnie komórki są wykorzystywane do subkultury ^{1, 2} lub do różnicowania zgodnie z poniższym opisem.

3. Różnicowanie neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych, Test Neuroblastów (NBA)

1. Komórki uzyskane z dysocjowanych neurosfer wysiewa się w stężeniu 2-3 x 10⁵ komórek/ml w kompletnej pożywce NSC uzupełnionej o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF, 1 μl/ml 0,2% heparyny oraz 5% FCS inaktywowanego termicznie, do kolby hodowlanej o odpowiedniej wielkości. Dla kolb T25 stosuje się 5 ml pożywki, dla T75 20 ml, a dla T175 40 ml.
   Uwaga: FCS spowoduje trwałe przytwierdzenie komórek do podłoża, w związku z czym powlekanie kolb do hodowli NBA nie jest konieczne.
   
2. Kolby hodowlane inkubuje się następnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 3-4 dni. Okres ten nazywa się fazą proliferacji, podczas której potomstwo NSC przytwierdza się do podłoża i proliferuje w postaci monowarstwy komórek.
3. Gdy kultura osiągnie 90-95% konfluencji, pożywkę w każdej kolbie zmienia się na kompletną pożywkę NSC uzupełnioną o 5% FCS bez dodatku czynników wzrostu.
4. Kolby hodowlane ponownie inkubuje się w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez kolejne 3-4 dni. Okres ten nazywa się fazą różnicowania, podczas której na wierzchu astrocytowej monowarstwy pojawiają się progenitory neuronalne i proliferują, tworząc kolonie niedojrzałych komórek neuronalnych. W 4-5 dniu fazy różnicowania kultura jest gotowa do izolacji neuroblastów przy użyciu techniki cytometrii przepływowej.

4. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

Trypsynizacja

1. Kulturę różnicujących się potomków NSC w 4-5 dniu etapu różnicowania przemywa się raz odpowiednią ilością PBS (2 ml dla kolby T25, 4 ml dla T75 i 8 ml dla T175), aby usunąć FCS z kultury.
   Uwaga: FCS blokuje aktywność Trypsyny-EDTA.
   
2. Następnie do każdej kolby dodaje się odpowiednią ilość uprzednio ogrzanej 0,05% Trypsyny-EDTA (2 ml dla T25, 4 ml dla T75 i 8 ml dla T175), aby pokryć monowarstwę komórek, i inkubuje się przez 1-2 min w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Kolbę sprawdza się pod mikroskopem, aby ocenić wpływ Trypsyny-EDTA na kulturę. Następnie kolbę trzyma się jedną ręką i uderza w nią mocno drugą ręką, aby odczepić komórki od dna kolby.
4. Do kolby dodaje się równą objętość inhibitora trypsyny sojowej w celu zneutralizowania aktywności trypsyny. Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby zapewnić inaktywację trypsyny i uzyskać homogeniczną zawiesinę pojedynczych komórek.
   Uwaga: Alternatywnie, do zneutralizowania aktywności trypsyny można użyć pożywki uzupełnionej o 5% FCS.
   
5. Aby usunąć niedisocjowane grudki, zawiesinę komórkową przepuszcza się przez filtr siatkowy o rozmiarze 40-μm.
6. Następnie zawiesinę komórkową wiruje się przy 800 rpm (110g) przez 5 min, usuwa się nadsącz, a komórki resuspenduje w odpowiedniej objętości pełnej pożywki NSC.
7. Końcową objętość zawiesiny komórkowej dostosowuje się tak, aby gęstość komórek nie przekraczała 2-3x10⁶-komórek/ml. Wysoka gęstość komórek może spowodować zablokowanie strumienia w cytometrze przepływowym.
8. Jeśli chcą Państwo wyizolować komórki neuronalne wyłącznie na podstawie ich właściwości fizycznych, można teraz przejść do sortowania FACS, zgodnie z opisem w części 4.
9. Przed sortowaniem, w celu wykluczenia martwych komórek, dodaje się jodek propidyny (PI, Sigma, 500 μg/ml w PBS) w stężeniu 1 μl/ml zawiesiny komórkowej.

Immunoznakowanie żywych komórek

Aby uzyskać wyższą czystość komórek neuronalnych, pojedyncze komórki pobrane z hodowli NBA można barwić pod kątem PSA-NCAM (markera wczesnych, niedojrzałych progenitorów neuronalnych), a następnie wyizolować komórki pozytywne z populacji neuronalnej przy użyciu analizatora FACS.

1. Po przeprowadzeniu zliczenia komórek, zawiesinę pojedynczych komórek z hodowli NBA dzieli się na cztery grupy:
   • Grupa samych komórek, służąca jako kontrola do ustawienia parametrów i bramkowania (0,5-1 x 10⁶ komórek).
   • Grupa komórek z PI, służąca jako kontrola do ustawienia parametrów i bramkowania (0,5-10 x 10⁶ komórek). Komórki ujemne pod kątem PI z tej grupy mogą być również sortowane na podstawie cech fizycznych komórek.
   • Grupa samego przeciwciała wtórnego (kontrola izotypowa), która również służy jako kontrola do ustawienia parametrów i bramkowania (1-2 x 10⁶ komórek).
   • Grupa do immunoznakowania (8-10 x 10⁶ komórek), która jest barwiona na PSA-NCAM w celu dalszego oczyszczania niedojrzałych komórek neuronalnych. Aby wykluczyć martwe komórki podczas sortowania, do tej grupy dodaje się również PI.
2. Aby rozpocząć immunoznakowanie, komórki wiruje się przy 800 rpm (110 g) przez 5 min. Nadpłyn jest usuwany, a komórki resuspendsuje się w 100 μl kompletnego medium NSC.
3. Przeciwciało anty-PSA-NCAM sprzężone z fykoerytryną (PE) dodaje się w stosunku 10 μl / 5-10 x 10⁶ komórek do zawiesiny komórkowej przeznaczonej do barwienia na PSA-NCAM. W ten sam sposób przeciwciało kontrolne izotypu mysiego IgG1 sprzężone z PE dodaje się do zawiesiny komórkowej kontroli izotypowej. Należy postępować zgodnie z instrukcją na karcie specyfikacji przeciwciała w odniesieniu do stężenia przeciwciała do zastosowania. Następnie zawiesinę komórkową delikatnie miesza się i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 10-15 min w ciemności.
4. Następnie zawiesiny komórkowe (probówki PSA-NCAM i kontroli izotypowej) wiruje się przy 800 rpm (110 g) przez 5 min, usuwa nadpłyn i resuspendsuje komórki w 1 ml kompletnego medium NSC.
5. Aby usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał z próbek, krok 4 powtarza się 2-3 razy.
6. Po resuspensji komórek w odpowiedniej objętości medium, dodaje się jodek propidyny (PI, Sigma, 500 μg/ml w PBS) w stężeniu 1 μl/ml zawiesin komórkowych (próbki komórek z PI, kontroli izotypowej i barwione na PSA-NCAM), aby wykluczyć martwe komórki podczas analizy metodą cytometrii przepływowej.
7. Przygotowuje się sterylne probówki typu Falcon 15 ml zawierające 1 ml kompletnego medium, aby zbierać posortowane komórki z różnych populacji komórkowych.

5. Sortowanie komórek z wykorzystaniem fluorescencji (FACS) niedojrzałych neuronów

1. Urządzenie FACS jest konfigurowane zgodnie z instrukcją obsługi przez wykwalifikowanego technika laboratorium cytometrii przepływowej.
2. Jako płyn osłonowy, zgodnie z instrukcjami producenta, można zastosować fosforanowy bufor solny (PBS) lub inny odpowiedni roztwór, podawany pod ciśnieniem 28 PSI przez dyszę o średnicy 90 μm.
3. Różnica ciśnień w systemie jest regulowana w taki sposób, aby częstotliwość wyzwalania sortowania nie przekraczała 2500 zdarzeń/sekundę.
4. Zawiesinę komórkową z grupy zawierającej same komórki przepuszcza się przez urządzenie FACS.
5. Najpierw komórki (zdarzenia) są nanoszone na wykres w zależności od ich wielkości (światło rozproszone w przód (FSC)) oraz złożoności wewnętrznej (światło rozproszone bocznie (SSC)), aby rozróżnić poszczególne populacje komórek. W tym celu należy dostosować parametry napięcia dla FSC i SSC, tak aby komórki były widoczne na wykresie cytometrycznym.
6. Aby wykluczyć agregaty komórkowe i dublety, komórki są najpierw nanoszone na wykres w zależności od pola rozproszenia w przód (FSC-A) i szerokości impulsu rozproszenia w przód (FSC-W), a populacja pojedynczych komórek jest bramkowana jako populacja 1 (P1). Następnie komórki z P1 są nanoszone na wykres w zależności od pola rozproszenia bocznego (SSC-A) i szerokości impulsu rozproszenia bocznego (SSC-W) i tym razem pojedyncze komórki są bramkowane jako populacja 2 (P2). Dzięki ustanowieniu tych dwóch kolejnych bramek, agregaty lub dublety (wysoka szerokość impulsu FSC i wysoka szerokość impulsu SSC) zostają wykluczone.
7. Aby wykluczyć komórki martwe lub uszkodzone, pojedyncze komórki (P2) są nanoszone na wykres w zależności od reaktywności z PI oraz FSC-A, a następnie bramkowana jest populacja pojedynczych żywych komórek.
8. Pojedyncze żywe komórki są nanoszone na wykres FSC względem SSC, aby rozróżnić populacje komórek na podstawie ich wielkości i ziarnistości wewnętrznej. Na tym etapie dwie główne populacje komórek są bramkowane jako populacja FSC^low SSC^low (P3) oraz populacja FSC^high SSC^high (P4).
9. Aby wyizolować immunoreaktywne niedojrzałe komórki neuronalne PSA-NCAM z populacji FSC^low SSC^low, najpierw populacja FSC^low SSC^low z grup kontrolnych (komórki z dodatkiem PI i kontroli izotypowej) jest nanoszona na wykres w zależności od immunoreaktywności z PE względem FSC-A i bramkowane są komórki negatywne (P5), a następnie bramkowane są komórki pozytywne z grupy barwionej na PSA-NCAM jako populacja 6 (P6).
10. Po ustawieniu wszystkich niezbędnych bramek, interesujące komórki są sortowane do sterylnych probówek do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml zawierających 1ml medium NSC.
11. Posortowane komórki są następnie wirowane przy 1200 rpm (240 g) przez 5 min.
12. Nadsącz jest odrzucany, a osad resuspendsowany w odpowiedniej objętości medium (zależnie od wielkości osadu) i wykonuje się zliczenie komórek.
13. Komórki są następnie wysiewane na płytki 96-dołkowe pokryte poli-L-ornityną z gęstością 20-30 x 10³ komórek /dołek w 200-250 μl pełnego medium NSC z dodatkiem 5% FCS i 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego BMP4 ⁵.

Uwaga: aby pokryć 96 dołków, do każdego z nich dodaje się 100 μl roztworu roboczego poli-L-ornityny (1,5 ml Poly-O i 8,5 ml sterylnego PBS), a płytkę inkubuje w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej jedną godzinę. Następnie Poly-O zostaje usunięty, a każdy dołek przemyto trzykrotnie sterylnym PBS (pozostawiając PBS w dołku na 10 min przy każdym myciu). W przypadku użycia płytek 24-dołkowych należy zastosować 500 μl roztworu roboczego poli-L-ornityny na dołek.

14. Komórki utrwala się następnie w różnych punktach czasowych po sortowaniu, używając zimnego 4% paraformaldehydu, a następnie przeprowadza barwienie immunocytochemiczne na odpowiednie markery komórek neuronalnych i glejowych, aby ocenić fenotyp komórek wyselekcjonowanych z różnych populacji komórkowych.

6. Reprezentatywne wyniki

W kulturze różnicowania podczas testu neuroblastów (NBA), wysiane komórki przywierają do podłoża hodowlanego i rosną jako monowarstwa. W zależności od początkowej gęstości wysiewu komórek, po 3-4 dniach kultura osiągnie 90-95% konfluencji. Na tym etapie można zaobserwować monowarstwę składającą się głównie z komórek astrocytarnych, na której powierzchni znajdują się małe, okrągłe komórki progenitorowe neuronów^4,5 (Rycina 1). Po zamianie medium na takie pozbawione czynników wzrostu, komórki progenitorowe neuronów zaczynają się szybko dzielić i w ciągu 4-5 dni tworzą skupiska niedojrzałych neuroblastów na powierzchni monowarstwy astrocytarnej (Rycina 2). Analiza cytometryczna dysocjowanej kultury NBA w 4- lub 5. dniu etapu różnicowania wykazuje dwie główne populacje komórek: FSC^low SSC^low oraz FSC^high SSC^high, w zależności od wielkości komórek (FSC) i ziarnistości wewnętrznej (SSC) (Rycina 3). Analiza immunofluorescencyjna posortowanych komórek wykazuje, że komórki neuronalne znajdują się głównie w populacjach FSC^low SSC^low (ponad 75% z nich wykazuje ekspresję β-III tubuliny), natomiast komórki posortowane z populacji FSC^high SSC^high to w większości astrocyty immunoreaktywne na GFAP (Rycina 4). Dalsze oczyszczanie niedojrzałych komórek neuronalnych do poziomu niemal pełnej homogeniczności (97%) można osiągnąć poprzez selekcję pozytywną komórek PSA-NCAM IR z populacji FSC^low SSC^low (Rycina 3, 4). Wzbogacone komórki neuronalne uzyskane z komórek macierzystych neuronów (NSCs) wyizolowanych z eminencji zwojowych myszy E14 nabywają fenotypu GABAergicznego i w procesie różnicowania wykazują ekspresję DARPP-32, markera średnich neuronów kolczastych (Rycina 5).

Rycina 1. Hodowla testowa neuroblastów z komórek macierzystych sieci neuronowej myszy E14 w 4. dniu etapu proliferacji. Ta hodowla monowarstwowa składa się z płaskich komórek astrocytarnych (groty strzałek) na dole i okrągłych komórek progenitorowych neuronów (strzałki) na górze. Powiększenie oryginalne; 20 x.

Rycina 2. Hodowla do testu neuroblastów z neuronalnych komórek macierzystych myszy E14 w 4. dniu etapu różnicowania: A) kontrast fazowy, B) barwienie immunofluorescencyjne. Zwróć uwagę na skupiska niedojrzałych komórek neuronalnych (strzałki w A i barwienie na β III tubulinę w B) na powierzchni monowarstwy astrocytów (groty strzałek w A, barwienie na GFAP w B). Powiększenie oryginalne; 20 x.

Rycina 3. Reprezentatywne wykresy sortowania: A). Wykres sortowania FSC vs. SSC przed wykluczeniem dubletów i martwych komórek. B, C). Wykresy sortowania do wykluczenia dubletów na podstawie szerokości impulsu FSC i SSC. D). Wykluczenie martwych i uszkodzonych komórek na podstawie immunoreaktywności z jodkiem propidium. E). Wykres FSC vs. SSC po wykluczeniu dubletów i martwych komórek, pokazujący dwie główne populacje oznaczone jako populacje FSC^low SSC^low oraz FSC^high SSC^high. F, G). Wykresy sortowania w celu wyizolowania niedojrzałych komórek PSA-NCAM IR z populacji FSC^low SSC^low.

Rycina 4. Reprezentatywne mikrofotografie komórek wyselekcjonowanych z różnych populacji jeden dzień po wysianiu. A) Populacja FSC^low SSC^low (ponad 75% tych komórek to neurony). B) Populacja FSC^high SSC^high (większość tych komórek to astrocyty). C) Komórki PSA-NCAM⁺ wyselekcjonowane z populacji FSC^low SSC^low (niemal wszystkie wyselekcjonowane komórki to neurony). Powiększenie oryginalne: 20 x.

Rycina 5. Posortowane niedojrzałe neurony różnicują się w neurony GABAergiczne (A) i wykazują ekspresję DARPP-32 (B), markera dla średnich neuronów kolczastych.

Dyskusja

Zdolność do izolowania określonych populacji komórek neuronalnych (t.j. neuronów, astrocytów i oligodendrocytów) może rozwiązać niektóre problemy związane z klinicznym zastosowaniem neuralnych komórek macierzystych (NSCs). Po pierwsze, umożliwia to pełną charakterystykę wyjściowej populacji komórek dawcy. Po drugie, pozwala na zastosowanie konkretnego typu komórek lub kombinacji różnych typów komórek w określonej proporcji, w zależności od charakteru lub stadium choroby. Wreszcie, zastosowanie silnie wzbogaconych, przedr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże bazowe NeuroCult NSC	Podłoże	Stem Cell Technologies	05700
Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC	Suplement do podłoża	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsyna-EDTA	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Inhibitor trypsyny z soi	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	Składnik HEM
*HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H4034	Składnik HEM
*Woda destylowana	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Sito do komórek	Sito	BD Biosciences	352340
Kolba T25	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	136196
Kolba T80	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	178905
Probówki 15 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352096
Probówki 50 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352070
EGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	3139-FB
Heparyna	Czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	H4784	Zrekonstytuowana w PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Przeciwciało	Miltenyi Biotec	130-093-274
Mysia IgG1 sprzężona z PE	Przeciwciało kontrolne izotypowe	BD Biosciences	556029
Heparyna	Czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	H4784	Zrekonstytuowana w PBS
HrBMP-4	Czynnik wzrostu	R&D Systems	314-BP-010
Poly-L-Ornityna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P4957
Płodowa surowica cielęca	Suplement do podłoża	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
GFAP	Przeciwciało	Dako	Z0334
B-III tubulina	Przeciwciało	Promega Corp.	G7121
*Aby przygotować HEM, zmieszać opakowanie MEM 1 x 10L i 160ml 1M HEPES, a następnie uzupełnić objętość do 8.75 L wodą destylowaną. Ustawić końcowe pH na 7.4 i przechowywać w temperaturze 4°C.