Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Podsumowanie

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Streszczenie

Aby zapewnić jakość modeli zwierzęcych stosowanych w badaniach biomedycznych, opracowaliśmy szereg strategii i metod diagnostycznych służących do określania, czy zwierzęta były narażone na przypadkowe czynniki zakaźne (wirusy, mycoplasma i inne wymagające mikroorganizmy). Infekcje u zwierząt immunokompetentnych mają zazwyczaj charakter przejściowy, jednak odpowiedzi przeciwciał w surowicy na zakażenie często można wykryć w ciągu kilku dni lub tygodni, a pozostają one obecne przez całe życie gospodarza. Serologia jest podstawową metodologią diagnostyczną stosowaną do monitorowania zwierząt laboratoryjnych. Historycznie główną metodą przesiewową w nadzorze serologicznym był pośredni test enzymatycznego referencyjnego testu immunosorpcyjnego (ELISA). Test ELISA jest wykonywany jako badanie jednoparametrowe (singleplex), w którym w jednej dołku mierzy się jedną reakcję antygen-przeciwciało drobnoustrojów. W porównaniu z nim MFIA jest wykonywany jako test multiplexowy. Ponieważ mikrosfery występują w 100 różnych zestawach kolorystycznych, w jednym dołku mikropłytki można jednocześnie przeprowadzić do 100 różnych analiz. Innowacja ta zmniejsza ilość surowicy, odczynników i materiałów jednorazowych wymaganych do rutynowych badań, zwiększając jednocześnie ilość informacji uzyskanych z jednego dołka testowego. Dodatkowo jesteśmy w stanie wprowadzić wiele wewnętrznych koralików kontrolnych w celu weryfikacji przydatności próbki i systemu, zapewniając tym samym dokładność wyników. Obejmują one zestawy koralików powlekanych kontrolą tkankową oraz immunoglobulinami anty-testowymi dla gatunku surowicy (αIg) w celu oceny przydatności próbki. Podobnie jak w testach ELISA i IFA, kontrola tkankowa wykrywa nieswoiste wiązanie immunoglobulin surowicy. Kontrola αIg (kontrola surowicy) potwierdza, że surowica została dodana i zawiera wystarczające stężenie immunoglobulin, natomiast koralik kontrolny IgG (kontrola przydatności systemu), powlekany immunoglobulinami gatunku surowicy, wykazuje, że znakowane odczynniki i czytnik Luminex funkcjonują prawidłowo.

Protokół

1. Wyjaśnienie procedury MFIA (Rysunek 1)

1. Metoda MFIA wymaga polistyrenowych mikrosfer (kulek) powlekanych antygenem firmy Charles River, surowic testowych, reagentów znakowanych (BAG, SPE) oraz buforów (Primary Diluent, Assay buffer).
2. Reagenty są dodawane etapowo do dołków 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych z filtrem na dnie.
3. Test MFIA jest przeprowadzany jako test heterogenny, co oznacza, że etapom inkubacji towarzyszą etapy przemywania filtra w celu usunięcia niezwiązanych składników surowicy lub reagentów znakowanych. Roztwór piorący dodany do dołków płytki jest usuwany poprzez aspirację przez filtry na dnie dołków, które zatrzymują kulki.
4. Testy MFIA są przeprowadzane w temperaturze pokojowej (27°C+/-2°C).
5. Kompleksy antygen-przeciwciało utworzone podczas etapu inkubacji surowicy testowej są wykrywane poprzez inkubację ze znakowanymi biotyną kozimi koniugatami przeciwgatunkowymi (BAG), a następnie streptawidyną znakowaną R-fikoerytryną (SPE).
6. W czytniku do analizy kulki przechodzą pojedynczo przez detektor, gdzie są naświetlane dwoma laserami. Jeden laser wzbudza wewnętrzne barwniki identyfikujące zestaw kolorystyczny kulki, który odpowiada konkretnemu testowi; drugi wzbudza barwnik raportujący fikoerytrynę wychwyconą podczas analizy. W ramach każdego testu odczytywana jest określona liczba kulek, a intensywność fluorescencji fikoerytryny jest raportowana jako mediana indeksu fluorescencji (MFI).
   
   
   Rysunek 1. Procedura MFIA. Metoda MFIA oparta na technologii xMAP jest zawiesinową macierzą mikrosfer, która wykorzystuje kodowane kolorystycznie polistyrenowe kulki o średnicy 5.6 micron, do których kowalencyjnie przyłączone są antygeny (lub kontrole). Ponieważ kulki występują w 100 różnych zestawach kolorystycznych, w jednym dołku można przeprowadzić do 100 różnych analiz. Etapy analizy są wykonywane w płytkach mikrotitracyjnych z filtrem na dnie, aby kulki można było przemyć poprzez aspirację na kolektorze próżniowym. Reakcje są odczytywane za pomocą fluorometru Luminex xMAP 100. Intensywność fluorescencji fikoerytryny jest raportowana jako mediana indeksu fluorescencji (MFI).

2. Przed rozpoczęciem należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:

1. Kuleczki MFIA są światłoczułe
   1. Kluczowe jest ograniczenie ekspozycji na bezpośrednie światło. Standardowa ekspozycja na światło podczas rutynowych testów jest dopuszczalna, jednak przedłużony kontakt może prowadzić do fotoblaknięcia kuleczek, co sprawi, że będą one nieczytelne dla czytnika analizatora.
   2. Dla sukcesu analizy kluczowe jest, aby kuleczki MFIA były zawsze zawieszane w roztworze za pomocą wortexa, a następnie poddawane sonikacji (10-30 sekund) przed użyciem.
   3. Czytnik analizatora zbiera informacje wyłącznie z pojedynczych kuleczek. Agregaty kuleczek mogą prowadzić do wydłużenia czasu odczytu.
2. Należy upewnić się, że płytka testowa jest przykryta pokrywką podczas wszystkich etapów inkubacji, aby uniknąć odparowania roztworów analitycznych.
3. Wymagane środki ochrony osobistej: Podczas pracy w laboratorium należy przez cały czas nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz ochronę oczu.

3. Odczynniki

1. Tabela 1 zawiera większość materiałów niezbędnych do utworzenia wewnętrznego laboratorium MFIA. W zależności od konkretnych potrzeb konieczne może być nabycie dodatkowych lub powielonych elementów. Należy pamiętać, że ten wykaz nie obejmuje odczynników zakupionych od firmy Charles River (kulek MFIA, kontroli i odczynników dodatkowych). Dostępnych jest kilka komercyjnych źródeł koniugatów biotynylowanych oraz fykoerytryny znakowanej streptawidyną. Jednakże odczynniki dostępne w firmie Charles River zostały miareczkowane w celu uzyskania optymalnego stosunku sygnału do szumu z naszymi odczynnikami, dlatego nie zaleca się korzystania z alternatywnych dostawców lub partii odczynników.

Tabela 1. CR-RADS wykorzystuje czytnik BioPlex Suspension Array Reader firmy BioRad oraz zautomatyzowaną myjkę do mikropłytek firmy BioTek. Równoważna aparatura jest dostępna u innych dostawców.

Element	Dostawca	Numer katalogowy
Sprzęt
Czytnik macierzy zawiesinowych	BioRad	171-000205
myjka do mikropłytek 96-dołkowych	BioTek	ELX50/8FMW
Myjka/kąpiel ultradźwiękowa	Cole Palmer	EW0884900
Analogowy mieszalnik wiorowy	VWR	58816-121
-20°C zamrażarka	Różnorodne
4°C lodówka	Różne
dozownik wielokanałowy 12-kanałowy, 20-200μl	VWR	83009-718
Inkubator z wytrząsarką orbitalną	VWR/Lab-Line	57019-600
Pipety jednokanałowe, 20-200μl, wraz z wskazówkami	VWR	83009-732
Pipety jednokanałowe, 2-20μl, wraz z praktycznymi wskazówkami	VWR	83009-726
Pipety jednokanałowe, 100-1000μl, wraz ze wskazówkami	VWR	83009-736
Urządzenie wentylacyjne Vacushield	VWR	55095-006
Pompa próżniowa	VWR	54908-037
Zbiornik na odpady systemu próżniowego	VWR	80200-640
Materiały jednorazowe
polistyrenowa płytka 96-dołkowa	Fisher Scientific	14-245-145
płytka MultiScreen HTS-BV, 1.2μm filtr, styren	Millipore	MSBV N12 50
probówki stożkowe 15 ml (polipropylenowe)	Sarstedt	62554.002
probówki stożkowate 50 ml (polipropylenowe)	Sarstedt	62547.004
Fiolki z surowicą	Sarstedt	72694.007
Folia aluminiowa	VWR	89079-068
butelki 1L, sterylne	VWR	28199-246
0.22μm filtry nakręcane na butelkę	VWR	28199-307
Zbiorniki na odczynniki (100 ml)	VWR	82026-356
pipety 5 ml, 10 ml, 25 ml do dozowania odczynników w formie ciekłej	VWR
Odczynniki
PBS, pH 7,4; BSA, proszek (saszetki)	Sigma	P3813
ProClin 300	Sigma/Supelco	48912-U
Niepowlekane mikrosfery	Luminex	zróżnicowane w zależności od typu

4. Przygotowanie odczynników

1. Do procedury MFIA wymagane są dwa bufory. Primary Diluent jest dostępny w ofercie firmy Charles River i zawiera zastrzeżone środki blokujące w celu zmniejszenia nieswoistych oddziaływań białkowych. Bufor Assay Wash jest przygotowywany w laboratorium z wykorzystaniem dostępnych handlowo odczynników.
2. Bufor Assay Wash: PBS/ 1% BSA pH 7.4 jest dostępny w formie proszku w ofercie Sigma-Aldrich.
   1. Kluczowe jest usunięcie cząstek stałych poprzez filtrację, ponieważ mogą one prowadzić do zatorów w czytniku do analizy. Przefiltruj bufor przez jednostkę filtrującą nakładaną na butelkę o porach 0.2micron do sterylnych, oznakowanych pojemników.
   2. BAG oraz SPE są rozcieńczane do ich 2X stężenia roboczego w buforze Assay Wash. Uwaga: SPE jest światłoczuły i powinien być ograniczony w ekspozycji na światło.

5. Przygotowanie próbek

1. Przygotuj materiały testowe, odczynniki i materiały jednorazowe.
   1. Mikropipety wielo- i jednokanałowe oraz końcówki
   2. Płytki mikrotytrujące 96-dołkowe o niskim wiązaniu białek (do rozcieńczeń surowicy) oraz płytki z filtrem na dnie (do analizy MFIA)
   3. Pobierz próbki krwi zgodnie ze standardową procedurą. Pozostaw próbki krwi w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut do całkowitego skrzepnięcia przed wirowaniem i oddzieleniem surowicy. Przed pobraniem próbek należy krótko wymieszać nierozcieńczoną surowicę za pomocą vortexa w celu ujednolicenia składników surowicy.
   4. Końcowe rozcieńczenie testowe dla MFIA wynosi 1/50. Do analizy konieczne jest przygotowanie 2X (1/25) próbki surowicy testowej. Rozcieńcz nierozcieńczoną surowicę testową, dodając 1 część surowicy do 24 części rozcieńczalnika wstępnego MFIA (MFIA Primary Diluent). Organizacja surowicy testowej na 96-dołkowej płytce mikrotytrującej znacznie skraca czas przenoszenia próbek na płytkę testową i jest wysoce zalecana.

6. Przygotowanie płytki testowej

1. Wstępne zwilżenie płytki testowej z 96 dołkami jest niezbędne, aby zapewnić prawidłowe i równomierne opróżnianie dołków. Nawet jeśli nie zostanie wykorzystana cała płytka, ten krok jest początkowo wymagany; nie trzeba będzie dodawać kolejnych odczynników ani buforu płuczącego do pustych dołków.
   1. Niektóre laboratoria przeprowadzają analizy na mniejszej liczbie niż pełne 96 dołków, uszczelniając niewykorzystane dołki na płytce testowej z zamiarem ponownego użycia ich w późniejszym terminie. Nie zalecamy stosowania tej metody, ponieważ może ona wpłynąć na prawidłową filtrację płytki testowej.
2. Prawidłowe aspirowanie płytki testowej jest kluczowe dla sukcesu analizy MFIA. Opróżnianie dołków z próbką powinno trwać około 5-10 sekund. Zbyt szybkie aspirowanie zawartości dołków może prowadzić do agregacji kulek i wydłużyć czas odczytu na koniec analizy.
3. Po każdym etapie płukania należy osuszyć spód płytki testowej ręcznikami papierowymi, aby upewnić się, że ciecz przestała spływać. Brak osuszania płytki testowej może doprowadzić do podsiąkania ciekłych odczynników z dołków podczas inkubacji i skutkować nieprawidłowymi wynikami dla kulek Goat anti-species i/lub Species IgG. Kulki te są zaprojektowane tak, aby uzyskiwać wyniki w określonym zakresie MFI, gdy do każdego dołka dodana zostanie odpowiednia ilość surowicy pierwotnej i znacznika.

7. Przygotowanie zawiesiny kuleczek MFIA

1. Kluczem do sukcesu testu jest to, aby kuleczki były zawsze mieszane w vortexerze i poddawane sonikacji przed użyciem. Czytnik testu zbiera informacje z pojedynczych kuleczek; agregaty lub skupiska kuleczek mogą prowadzić do wydłużenia czasu odczytu.
2. Wymieszaj w vortexerze roztwór gęsty zawiesiny kuleczek sprzęganych (zazwyczaj 10 ± 5 sekund).
3. Resuspender kuleczki, a następnie poddaj je sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 10-20 sekund.
4. Rozcieńcz zawiesinę gęstą 20X do roboczej zawiesiny kuleczek 2X w Primary Diluent. Do każdej studzienki testowej wcześniej zwilżonej płytki Test Plate nanieś 50μl zawiesiny kuleczek 2X.

8. Dodawanie surowic testowych i kontrolnych do płytki testowej

1. Pipetuj 50μl każdego serum testowego i kontrolnego 2X na płytkę testową zgodnie z wcześniej zdefiniowaną mapą płytki. Zabeziecz pokrywkę płytki gumką recepturką lub folią aluminiową i inkubuj płytkę testową przez 60minutes na wytrząsarce orbitalnej, w ciemności, w temperaturze pokojowej.
   1. Prędkość wytrząsania powinna wynosić od 400 do 700rpm. Kluczowe jest utrzymanie kulek w zawiesinie, aby przeciwciała z surowicy miały dostęp do wszystkich powierzchni sprzężonych antygenów. Brak utrzymania kulek w zawiesinie spowoduje niskie wyniki kontroli kulek IgG i będzie wymagało powtórzenia analizy.

9. Mycie płytki testowej

1. Odssać zawartość dołków za pomocą manifoldu próżniowego. Ewakuacja próbek z dołków powinna trwać około 5-10 sekund.
2. Po każdym etapie osuszyć spód płytki testowej ręcznikiem papierowym, aby upewnić się, że odpływ cieczy ustał.
3. Resuspendować kuleczki w 50μl buforu do mycia Assay Wash. Ważne jest, aby kuleczki nie wyschły w trakcie procesu analizy.

10. Dodawanie BAG i SPE do płytki testowej

1. Do wszystkich studzienek zawierających kulki MFIA nanieś 50μl 2X rozcieńczenia roboczego BAG. Przymocuj pokrywkę płytki za pomocą gumki recepturki lub folii aluminiowej. Inkubuj płytkę testową przez 30minutes z wstrząsaniem zgodnie z powyższą instrukcją, w ciemności, w temperaturze pokojowej.
   1. Po tej inkubacji przemyj płytkę testową i resuspenduj kulki przy użyciu buforu Assay Wash, jak opisano wcześniej po dodaniu surowicy.
2. Do wszystkich studzienek zawierających kulki MFIA nanieś 50μl 2X rozcieńczenia roboczego SPE. Przymocuj pokrywkę płytki za pomocą gumki recepturki lub folii aluminiowej. Inkubuj płytkę testową przez 30minutes z wstrząsaniem zgodnie z powyższą instrukcją, w ciemności, w temperaturze pokojowej.
   1. Po tej inkubacji przemyj płytkę testową, resuspenduj kulki za pomocą 125μl buforu Assay Wash i wstrząsaj płytką przez ˜dwie minuty, aby ponownie zawiesić kulki przed umieszczeniem jej w czytniku do analizy.

11. Odczyt płyty testowej

1. W ciągu 10 minut od resuspensji kulek umieść płytkę testową w czytniku do analizy. W przypadku awarii zasilania lub innego zdarzenia, płytkę testową można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności do 12 godzin do momentu odczytu.
   1. Obserwuj pierwszy dołek z próbką, aby zweryfikować, czy wybrany panel kulek odpowiada profilowi kulek w dołkach testowych. Jeśli na wyświetlaczu protokołu pojawią się kulki wykraczające poza ich wyznaczony „region kulek”, oznacza to wybór nieprawidłowego profilu.
   2. Jeśli kulki zostały prawidłowo zresuspendowane, powinny wypełnić określone „regiony” wskazane w oprogramowaniu czytnika.
   3. W przypadku agregacji kulek będą one wypełniać swoje regiony powolnie. Można wtedy wyjąć płytkę testową z czytnika i ręcznie zresuspendować zawartość dołków. Aby wspomóc rozbicie agregatów kulek, należy 3-4 razy triturować każdy dołek za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie należy ponownie umieścić płytkę testową w czytniku i kontynuować procedurę.

12. Reprezentatywne wyniki

1. Dla każdego testu odczytywana jest minimalna liczba kulek, a intensywność fluorescencji fykoerytryny jest raportowana jako medianowy indeks fluorescencji (Median Fluorescence Index, MFI) w zakresie od 0 do 32 667. Po porównaniu liczb 25, 50 lub 100 kulek na dołek nie stwierdzono różnic statystycznych, dlatego rutynowo zlicza się 25 kulek na jeden antygen w dołku z próbką. Należy sprawdzić raport z wynikami pod kątem błędów, takich jak niewystarczająca liczba kulek lub nieprawidłowe wyniki dla kulek IgG / anty-IgG. Kulki te są zaprojektowane tak, aby uzyskiwać wynik w określonym zakresie MFI po dodaniu do każdego dołka odpowiedniej ilości surowicy pierwotnej i znakowanych odczynników. Dołki z próbkami zawierające błędy (niska liczba kulek) lub nieprawidłowe wyniki dla kulek kontrolnych IgG powinny zostać powtórzone w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
2. Wyeksportuj wyniki do arkusza programu Excel. W naszej interpretacji danych dla każdego testu przypisuje się:
   1. Test kontroli tkankowej (Tissue Control, TC): w większości testów MFIA dla gryzoni kontrolą tkankową jest ekstrakt z komórek owadziech zakażonych bakulowirusem typu dzikiego.
   2. Próg odcięcia testu (Assay Cutoff): wartość ta stanowi minimalną oczekiwaną fluorescencję i jest dostosowywana dla każdego testu w celu maksymalizacji dokładności diagnostycznej. Dla większości testów próg odcięcia fluorescencji wynosi 3000.
3. Netto medianowy indeks fluorescencji (Net MFI) jest obliczany dla każdego testu (z wyjątkiem testów kontroli tkankowej i IgG) według następującego wzoru. Innymi słowy, specyficzny sygnał testowy to całkowite MFI testu pomniejszone o MFI TC (tła). Wartość tę dzieli się następnie przez 1000, co sprowadza zakres Net MFI do wartości między 0 a 32 zamiast 0–32 667.
   
   
   Net MFI = (MFI_{Antibody Assay} - MFI_{Tissue Control}) / 1000
   
   Wartości Net MFI oraz TC MFI są przeliczane na wyniki poprzez porównanie z Progiem odcięcia testu specyficznym dla każdego antygenu.
   
   
   Rycina 2. Reprezentatywne dane MFIA dla surowic testowych ze wszystkimi poprawnymi kontrolami IgG.
4. 12.4 Interpretacja MFIA
   1. Wyniki z płytki testowej należy interpretować tylko wtedy, gdy wyniki kontroli przydatności systemu (System-Suitability Control) oraz kontroli surowicy (kulki IgG / anty-IgG) spełniają kryteria akceptacji wymienione w Tabeli 2. Nieprawidłowy wynik dla tych dwóch kulek kontrolnych IgG może wskazywać na kilka błędów proceduralnych, takich jak niewłaściwe rozcieńczenie lub niewystarczająca objętość koniugatu lub SPE, nieprawidłowe rozcieńczenie surowicy testowej lub użycie surowicy od zwierzęcia z niedoborem odporności.

Tabela 2

Kryteria akceptacji dla kontroli testu
Kontrola	Akceptowalny wynik
	Wynik	Klasyfikacja
Surowica immunologiczna o wysokim zakresie stężeń	≥ 4.5	Dodatni
Surowica immunologiczna o niskim zakresie stężeń	≥ 1.5	≥ Graniczny
Surowica nieimmunna	< 2.5	≤ Graniczny
Rozcieńczalnik	< 2.5	≤ Graniczny
Zestaw kulek Ig*	≥ Cutoff/1000	Przejdź

*Zestaw kulek pokrytych swoistymi dla gatunku przeciwciałami przeciwko immunoglobulinom (Ig) surowicy testowej: niskie wyniki tej kontroli przydatności próbek mogą wynikać z dodania zbyt małej ilości próbki, zbyt dużego rozcieńczenia próbki, wyboru niewłaściwego gatunku lub użycia surowicy testowej od gospodarza z niedoborem odporności.

2. Jeśli jakikolwiek z parametrów kontrolnych płyty testowej nie zostanie spełniony, z wyjątkiem surowicy immunologicznej o wysokim zakresie (High Range Immune Serum), wyniki są nieakceptowalne i muszą zostać powtórzone. Uzyskanie prawidłowego wyniku dla kontroli surowicy o niskim zakresie (Low range Serum) jest krytyczne, ponieważ demonstruje ono poziom czułości wykrywania płyty testowej.
3. Wynik dla koralików z przeciwciałem kozim anty-IgG przeciwko danemu gatunkowi zależy od ilości pierwotnej surowicy testowej dodanej do analizy. Jeśli ta kontrola koralików nie zostanie spełniona, ale kontrola IgG dla danego gatunku przejdzie pomyślnie (dołek B1, Rys. 3), wskazuje to, że do dołka testowego dodano wystarczającą ilość odczynników testowych (BAG, SPE) i problem wynika z właściwości surowicy. Jeśli ilość odczynników testowych w konkretnym dołku jest niewystarczająca, oba rodzaje koralików kontrolnych – IgG oraz anty-IgG – nie spełnią norm (dołek E1, Rys. 3).
   
   
   Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki testu MFIA z błędami (oznaczonymi kolorem pomarańczowym). Dołki A1, C1 i F1 wskazują błąd TC (reaktywność tkankowa), gdzie wynik TC podano w nawiasie. Dołki B1 i E1 ilustrują dwa typy błędów wewnętrznej kontroli IgG: niewystarczającą ilość przeciwciał testowych (B1) lub niewystarczającą ilość odczynników testowych (E1) BAG / SPE.
   
4. Jeśli wyniki parametrów kontrolnych płyty testowej są zadowalające, poszczególne wyniki analizy klasyfikuje się zgodnie z Tabelą 3. Krytyczne jest potwierdzenie każdego wyniku granicznego lub dodatniego za pomocą alternatywnej metody testowej.

Tabela 3

Klasyfikacja punktacji MFIA
Wynik			Klasyfikacja
TC	Siatka	TC + Net*
≥ 2	< 0.5	< 2.5	Ujemna (-)
	≥ 0.5	≥ 2.5	Reakcja TC (T)
< 2	< 1.5		-
	1,5 ≤ X < 2.5		Graniczny (B)
	≥ 2.5		Dodatni (+)

*Klasyfikację negatywną można nadal określić przy niezerowym wyniku TC, pod warunkiem że suma wyników TC + Net ( = wynik Ag) jest negatywna

Dyskusja

Proces testowania MFIA jest wysoce wydajny, wymagając mniej sprzętu oraz mniejszych objętości próbek i odczynników niż tradycyjne testy jednoparametrowe. Funkcjonalność systemu multipleksowego daje użytkownikowi elastyczność w jednoczesnym badaniu wielu szczepów lub serotypów powszechnych czynników u gryzoni laboratoryjnych (np. koronawirusów, parwowirusów itp.). Pozwala to również na projektowanie spersonalizowanych paneli kuleczek w zależności od obszaru zainteresowań (np. konkretnej rodziny wirusów) i jest możliwe do dostosowania do analizy innych rodzajów biomolekuł, w tym cytokin i innych biomarkerów. Dodatkowo umożliwia to włączenie kilku wewnętrznych testów kontrolnych w celu weryfikacji przydatności próbki i systemu, a tym samym zapewnienia dokładności wyników. Obejmują one zestawy kuleczek pokryte kontrolą tkankową oraz immunoglobulinami przeciwko immunoglobulinom (αIg) gatunku serum testowanego w celu oceny przydatności próbki. Kuleczka kontroli tkankowej wykrywa nieswoiste wiązanie immunoglobulin surowicy, a kontrola kuleczkami αIg potwierdza dodanie surowicy i obecność w niej wystarczającego stężenia immunoglobulin. Inna kuleczka kontrolna, pokryta immunoglobulinami gatunku surowicy, wykazuje, że znakowane odczynniki i czytnik testowy funkcjonują prawidłowo. Inne dostępne komercyjnie serologiczne testy w formacie multipleksowym (np. MicroArrays, ImmunoComb) mogą nie oferować tak wysokiego poziomu potwierdzenia wyników.

Zdolność do zawężenia potencjalnych źródeł niepowodzenia analizy przed powtórnym badaniem może pomóc badaczowi zaoszczędzić czas i materiały. Przed powtórzeniem analizy wadliwej próbki należy potwierdzić krytyczne aspekty MFIA. Ponieważ analizę przeprowadza się w temperaturze otoczenia, należy zweryfikować, czy temperatura w laboratorium wynosi około 27°C±2°C; wyższe temperatury mogą prowadzić do uzyskania niższych niż oczekiwano wyników dla kontroli i próbek. Płukanie jest prawdopodobnie najkrytyczniejszym etapem analizy. Upewnienie się, że płytka testowa została prawidłowo wypłukana, osuszona i resuspendowana, może wyeliminować zdecydowaną większość błędów próbkowania wynikających z niskiej liczby kulek (z powodu ich agregacji) lub niewystarczającego dodania odczynnika (utraconego w wyniku odsysania przez filtr na dnie płytki testowej). Rutynowo odliczamy 25 kulek na analizę (antygen) i nie stwierdziliśmy istotnych statystycznie różnic w wynikach przy odliczaniu większej liczby kulek, co prowadziłoby również do wydłużenia czasu odczytu płytki.

Przeprowadziliśmy kompleksowe badania walidacyjne metody MFIA na kilku gatunkach powszechnie stosowanych zwierząt laboratoryjnych (myszy, szczura, chomika, świnki morskiej i królika), aby wykazać dokładność diagnostyczną, powtarzalność i odporność metody poprzez przetestowanie dużej liczby znanych dodatnich i ujemnych próbek surowicy oraz porównanie wyników uzyskanych metodami ELISA, IFA i MFIA. Granice wykrywalności (tj. standardowe punkty końcowe miareczkowania surowicy immunologicznej) w MFIA były porównywalne, a w niektórych przypadkach przewyższały wyniki uzyskiwane za pomocą odpowiadających im testów ELISA. Swoistość diagnostyczna, mierzona przy użyciu surowic gryzoni SPF, przekroczyła 99%; ogólna zgodność między wynikami ELISA i MFIA uzyskanymi z znanych dodatnich i ujemnych surowic wyniosła ponad 95%. Podsumowując, wyniki te dowiodły, że multipleksowa metoda MFIA stanowi dobrą alternatywę dla pojedynczego testu ELISA i jest odpowiednia do zamierzonego zastosowania, tzn. w rutynowym nadzorze serologicznym kolonii zwierząt laboratoryjnych.