Metodologia testowania multipleksowego fluorometrycznego testu immunologicznego i rozwiązywanie problemów

Summary

Korzystając z technologii mikrosfery xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy Multipleksowany Fluorometryczny Test Immunologiczny (MFIA) do seronadzoru różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to mikromacierz zawiesinowa, w której antygen, kontrola tkanek lub immunoglobuliny są kowalencyjnie połączone z mikrosferami polistyrenu oznaczonymi kolorami. Omówiono metodę testowania MFIA, a także różne tematy związane z rozwiązywaniem problemów.

Abstract

Aby zapewnić jakość modeli zwierzęcych wykorzystywanych w badaniach biomedycznych, opracowaliśmy szereg strategii i metod testowania diagnostycznego, aby określić, czy zwierzęta były narażone na przypadkowe czynniki zakaźne (wirusy, mykoplazmy i inne wybredne mikroorganizmy). Zakażenia zwierząt immunokompetentnych są na ogół przemijające, jednak odpowiedź przeciwciał surowicy na zakażenie często można wykryć w ciągu kilku dni do tygodni i utrzymuje się przez całe życie gospodarza. Serologia jest podstawową metodologią diagnostyczną, za pomocą której monitorowane są zwierzęta laboratoryjne. Historycznie rzecz biorąc, pośredni test immunoenzymatyczny (ELISA) był główną metodą przesiewową w nadzorze serologicznym. Test ELISA jest wykonywany jako singleplex, w którym mierzy się jedną reakcję antygen-przeciwciało drobnoustrojów w każdym dołku. Dla porównania, MFIA jest wykonywany jako test multipleksowany. Ponieważ mikrosfery występują w 100 różnych zestawach kolorów, w jednej studzience mikropłytki można wykonać jednocześnie nawet 100 różnych testów. Ta innowacja zmniejsza ilość surowicy, odczynników i materiałów jednorazowego użytku wymaganych do rutynowych testów, jednocześnie zwiększając ilość informacji uzyskanych z pojedynczego dołka testowego. Ponadto jesteśmy w stanie włączyć wiele wewnętrznych kulek kontrolnych, aby zweryfikować przydatność próbki i systemu, a tym samym zapewnić dokładność wyników. Obejmują one kontrolę tkanek i zestawy kulek pokrytych immunoglobuliną (αIg) przeciwko testom IgG w surowicy w celu oceny przydatności próbki. Podobnie jak w testach ELISA i IFA, kontrola tkankowa wykrywa nieswoiste wiązanie immunoglobuliny w surowicy. Kontrola αIg (kontrola surowicy) potwierdza, że surowica została dodana i zawiera wystarczające stężenie immunoglobuliny, podczas gdy kulka kontrolna IgG (kontrola przydatności systemu), pokryta immunoglobuliną gatunków surowicy, pokazuje, że znakowane odczynniki i czytnik Luminex działają prawidłowo.

Protocol

1. Wyjaśnienie procedury MFIA (Rysunek 1)

1. MFIA wymaga pokrytych antygenem mikrosfer polistyrenowych Charlesa Rivera (kulki), surowic testowych, znakowanych odczynników (BAG, SPE) i (rozcieńczalnik pierwotny, bufor testowy).
2. Odczynniki są dodawane stopniowo do studzienek 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych z dnem filtra.
3. MFIA jest wykonywany jako test heterogeniczny, co oznacza, że po inkubacji następują etapy płukania filtrem w celu usunięcia niezwiązanych składników surowicy lub znakowanych odczynników. Roztwór płuczący dodany do studzienek płytkowych jest usuwany przez aspirację przez dno studni, które zatrzymuje kulki.
4. Testy MFIA przeprowadza się w temperaturze pokojowej (27°C+/-2°C).
5. Kompleksy antygen-przeciwciało powstające podczas etapu inkubacji surowicy testowej są wykrywane przez inkubacje z biotynylowanymi koniugatami antygatunkowymi kóz (BAG), a następnie streptawidyną znakowaną R-fikoerytryną (SPE).
6. W czytniku testowym kulki przechodzą pojedynczo przez detektor, gdzie są poddawane działaniu dwóch laserów. Jeden laser wzbudza wewnętrzne barwniki, które identyfikują zestaw kolorów koralika, który odpowiada testowi; Drugi pobudza barwnik reporterowy fikoerytryny wychwycony podczas testu. Na test odczytywana jest z góry określona liczba kulek, a intensywność fluorescencji fikoerytryny jest podawana jako mediana wskaźnika fluorescencji (MFI).
   
   
   Rysunek 1. Procedura MFIA. MFIA oparta na xMAP to mikromatryca zawiesinowa, która wykorzystuje oznaczone kolorami kulki polistyrenowe o grubości 5,6 mikrona, z którymi antygeny (lub kontrole) są kowalencyjnie połączone. Ponieważ kulki są dostępne w 100 różnych zestawach kolorystycznych, w jednym dołku można wykonać nawet 100 różnych testów, Etapy testu są wykonywane na płytkach mikromiareczkowych z dnem filtra, dzięki czemu kulki można myć przez aspirację na kolektorze próżniowym. Odczyt reakcji odbywa się za pomocą fluorometru Luminex xMAP 100. Intensywność fluorescencji fikoerytryny jest podawana jako mediana wskaźnika fluorescencji (MFI)

2. Zanim zaczniesz, proszę zwrócić uwagę na następujące kwestie:

1. Koraliki MFIA są światłoczułe
   1. Ograniczenie ilości bezpośredniej ekspozycji na światło ma kluczowe znaczenie. Normalna ekspozycja na światło, która występuje podczas rutynowych testów, jest dopuszczalna, ale długotrwała ekspozycja może prowadzić do fotowybielania kulek, co sprawia, że są one nieczytelne dla czytnika testów.
   2. Kluczowe znaczenie dla powodzenia testu ma to, że kulki MFIA są zawsze wirowane do zawiesiny, a następnie sonikowane (10-30 sekund) przed użyciem.
   3. Czytnik probierczy zbiera informacje tylko z pojedynczych kulek. Zagregowane klastry ściegów mogą prowadzić do dłuższych czasów odczytu.
2. Należy upewnić się, że płytka testowa jest przykryta pokrywką płytki podczas wszystkich etapów inkubacji, aby uniknąć parowania roztworów testowych.
3. Wymagane środki ochrony osobistej: Fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne powinny być noszone przez cały czas pracy w warunkach laboratoryjnych.

3. Odczynniki

1. W tabeli 1 przedstawiono większość materiałów niezbędnych do utworzenia własnego laboratorium MFIA. W zależności od konkretnych potrzeb mogą być konieczne dodatkowe lub zduplikowane elementy. Należy pamiętać, że ten wykaz nie obejmuje odczynników zakupionych w Charles River (kulki MFIA, kontrole i odczynniki uzupełniające). Dostępnych jest kilka komercyjnych źródeł biotynylowanych koniugatów i fikoerytryny znakowanej streptawidyną. Jednak odczynniki dostępne w Charles River zostały miareczkowane w celu uzyskania optymalnego stosunku sygnału do szumu za pomocą naszych odczynników, nie zaleca się używania alternatywnych dostawców lub partii odczynników.

Tabela 1. CR-RADS wykorzystuje czytnik matrycy zawiesinowej BioPlex firmy BioRad oraz automatyczną myjkę mikropłytek firmy BioTek. Równoważne oprzyrządowanie jest dostępne u alternatywnych dostawców.

przedmiot sprzedawca Numer katalogowy sprzęt     Czytnik matrycy zawieszenia *BioRad Numer katalogowy: 171-000205 96-dołkowa myjka do mikropłytek BioTek ELX50/8FMW Myjka ultradźwiękowa/kąpiel Cole'a Palmera EW0884900 Analogowy mikser wirowy Firma VWR Nr kat. 58816-121 Zamrażarka -20°C rozmaity   Lodówka 4°C rozmaity   Pipetor 12-kanałowy, 20-200 μl Firma VWR Numer katalogowy: 83009-718 Wytrząsarka orbitalna VWR/Linia laboratoryjna Nr kat. 57019-600 Pipety jednokanałowe, 20-200 μl, z końcówkami Firma VWR Numer katalogowy: 83009-732 Pipety jednokanałowe, 2-20 μl, z końcówkami Firma VWR Numer katalogowy: 83009-726 Pipety jednokanałowe, 100-1000 μl, z końcówkami Firma VWR Numer katalogowy: 83009-736 Urządzenie wentylacyjne Vacushield Firma VWR 55095-006 Pompa podciśnieniowa Firma VWR Nr kat. 54908-037 Zbiornik na odpady systemu próżniowego Firma VWR 80200-640 Jednorazówki     96-dołkowa płytka polistryrenowa Fisher Naukowy Numer katalogowy: 14-245-145 Płyta MultiScreen HTS-BV, filtr 1,2 μm, styren Milipory Zobacz materiał MSBV N12 50 Probówki stożkowe 15ml (polipropylen) Sarstedt powiedział: Numer katalogowy 62554.002 Probówki stożkowe 50ml (polipropylen) Sarstedt powiedział: Numer katalogowy: 62547.004 Fiolki z surowicą Sarstedt powiedział: Numer katalogowy: 72694.007 Folia aluminiowa Firma VWR Numer katalogowy: 89079-068 Butelki 1L, sterylne Firma VWR 28199-246 Filtry butelkowe 0,22 μm Firma VWR Numer katalogowy 28199-307 Zbiorniki na odczynniki (100ml) Firma VWR 82026-356 Pipety 5 ml, 10 ml, 25 ml do dozowania płynnych odczynników Firma VWR   Odczynniki     PBS, pH 7,4 1 BSA, proszek (torebki) Sigma Zobacz materiał P3813 Silnik ProClin 300 Sigma/Supelco 48912-U Mikrosfery niepowlekane Luminex Zróżnicowane w zależności od typu

4. Przygotowanie odczynnika

1. Do przeprowadzenia procedury MFIA wymagane są dwa. Podstawowy rozcieńczalnik jest dostępny w Charles River i zawiera zastrzeżone środki blokujące w celu zmniejszenia niespecyficznych interakcji białkowych. Bufor do płukania próbnego jest wytwarzany w Twoim zakładzie z dostępnymi na rynku odczynnikami.
2. Bufor do płukania testowego: PBS / 1% BSA pH 7,4 jest dostępny w postaci proszku firmy Sigma-Aldrich.
   1. Usuwanie cząstek stałych przez filtrację ma kluczowe znaczenie, ponieważ cząstki te mogą prowadzić do zatkania czytnika testów. Przefiltruj bufor przez filtr butelkowy o średnicy 0,2 mikrona do sterylnych, oznakowanych pojemników.
   2. BAG i SPE rozcieńcza się do ich 2-krotnego stężenia roboczego w buforze Assay Wash. Uwaga: SPE jest wrażliwy na światło i powinien mieć ograniczoną ekspozycję na światło.

5. Przygotowanie próbki

1. Zbierz materiały testowe, odczynniki i materiały jednorazowego użytku.
   1. Mikropipety i końcówki wielokanałowe i jednokanałowe
   2. 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe o niskim poziomie wiązania białek (rozcieńczenia surowicy) i płytki z dnem filtra (test MFIA)
   3. Pobieraj próbki krwi zgodnie ze standardową procedurą. Pozwól próbkom krwi całkowicie skrzepnąć, trzymając je w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed odwirowaniem i usunięciem surowicy. Nierozcieńczoną surowicę należy krótko przemieszać wirowo w celu wymieszania składników surowicy przed pobraniem próbki.
   4. Końcowe rozcieńczenie testowe dla MFIA wynosi 1/50. Do testu konieczne jest pobranie 2X (1/25) próbki surowicy testowej. Rozcieńczyć nierozcieńczone surowice testowe, dodając 1 część surowicy do 24 części rozcieńczalnika pierwotnego MFIA. Organizacja surowicy testowej na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania znacznie skraca czas przenoszenia próbek na płytkę testową i jest wysoce zalecana.

6. Przygotowanie płytki testowej

1. Wymagane jest wstępne zwilżenie 96-dołkowej płytki testowej, aby zapewnić prawidłową, równomierną ewakuację. Nawet jeśli cała płytka nie zostanie użyta, ten krok jest początkowo wymagany, nie będziesz musiał dodawać kolejnego odczynnika lub buforu płuczącego do pustych studzienek.
   1. Niektóre laboratoria przeprowadzają mniej niż pełną 96-dołkową płytkę, uszczelniając nieużywane studzienki na płytce testowej i planują ponowne wykorzystanie tych studni w późniejszym terminie. Nie zalecamy stosowania tej metody, ponieważ może to wpłynąć na prawidłową filtrację płytki testowej.
2. Właściwa aspiracja płytki testowej ma kluczowe znaczenie dla powodzenia testu MFIA. Opróżnianie studzienek na próbki powinno trwać około 5-10 sekund. Zbyt szybkie zasysanie zawartości studzienki może prowadzić do agregacji kulek i powolnego czasu odczytu na końcu testu.
3. Wytrzyj spód płytki testowej ręcznikami papierowymi po każdym etapie mycia, aby upewnić się, że odpływ płynu został zatrzymany. Nieosuszenie płytki testowej może prowadzić do wydostania się płynnych odczynników ze studzienek podczas inkubacji i spowodować niepowodzenie wyników antygatunkowych koz i/lub kulek IgG kóz. Kulki te są zaprojektowane tak, aby nacinały się w ustalonym z góry zakresie MFI, gdy do każdej studzienki dodaje się odpowiednią ilość surowicy pierwotnej i znakowanych odczynników.

7. Przygotowanie zawiesiny MFIA Bead

1. Kluczowe znaczenie dla powodzenia testu ma to, że kulki są zawsze wirowane i sonikowane przed użyciem. Czytnik testowy zbiera informacje tylko z pojedynczych kulek, agregaty lub grudki koralików mogą prowadzić do dłuższego czasu odczytu.
2. Wiruj zawieszenie stopki sprzężonej z kolbą (zwykle 10 ± 5 sekund)
3. Ponownie zawiesić kulki, a następnie sonikację w kąpieli sonicyjnej na 10-20 sekund.
4. Rozcieńczyć zawiesinę 20X do 2X roboczej zawiesiny stopki w rozcieńczalniku pierwotnym. Dozować 50 μl zawiesiny kulek 2X do każdej studzienki testowej wstępnie zwilżonej płytki testowej.

8. Dodanie surowicy testowej i kontrolnej do płytki testowej

1. Odpipetuj 50 μl każdej surowicy testowej i kontrolnej 2X na płytkę testową w oparciu o predefiniowaną mapę płytki. Przymocuj pokrywkę do płytki elastyczną opaską lub folią aluminiową i inkubuj płytkę testową przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej, w ciemności w temperaturze pokojowej.
   1. Prędkość wytrząsarki powinna być większa niż 400, ale mniejsza niż 700 obr./min. Bardzo ważne jest, aby kulki były utrzymywane w zawiesinie, aby umożliwić przeciwciałom surowicy dostęp do wszystkich powierzchni sprzężonych antygenów. Nieutrzymanie kulek w zawieszeniu spowoduje niskie wyniki kontroli kulek IgG i test będzie musiał zostać powtórzony.

9. Mycie płytki testowej

1. Zassać zawartość studzienki za pomocą kolektora próżniowego. Opróżnianie studzienek na próbki powinno trwać około 5-10 sekund.
2. Po każdym z nich należy wytrzeć spód płytki testowej ręcznikami papierowymi, aby upewnić się, że drenaż cieczy został zatrzymany.
3. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl buforu do płukania testów. Ważne jest, aby kulki nie mogły wyschnąć podczas procesu oznaczania.

10. Dodawanie BAG i SPE do płytki testowej

1. Dozować 50 μl worka z 2X roboczym rozcieńczalnikiem do wszystkich studzienek zawierających kulki MFIA. Przymocuj pokrywkę do talerza za pomocą gumki lub folii aluminiowej. Inkubować płytkę testową przez 30 minut, wstrząsając jak powyżej, w ciemności w temperaturze pokojowej.
   1. Po tej inkubacji przemyć płytkę testową i ponownie zawiesić kulki za pomocą buforu do płukania testu, jak opisano wcześniej, po dodaniu surowicy.
2. Dozować 50 μl 2X roboczego rozcieńczalnika SPE do wszystkich studzienek zawierających kulki MFIA. Przymocuj pokrywkę do talerza za pomocą gumki lub folii aluminiowej. Inkubować płytkę testową przez 30 minut, wstrząsając jak powyżej, w ciemności w temperaturze pokojowej.
   1. Po tej inkubacji umyj płytkę testową i ponownie zawieś kulki za pomocą 125 μl buforu do przemywania testu i potrząsaj płytką przez dwie minuty, aby ponownie zawiesić kulki przed umieszczeniem w czytniku testowym.

11. Odczytywanie płytki testowej

1. Umieść płytkę testową w czytniku testowym w ciągu 10 minut od ponownego zawieszenia kulek. W przypadku awarii zasilania lub innego incydentu płytka testowa może być przechowywana w temperaturze pokojowej w ciemności do 12 godzin, aż będzie gotowa do odczytu.
   1. Obserwuj pierwszą studzienkę na próbkę, aby sprawdzić, czy wybrany panel ściegu pasuje do profilu ściegu w dołkach testowych. Jeśli na wyświetlaczu protokołu znajdują się koraliki wypadające poza wyznaczony im "obszar ściegu", oznacza to, że dokonano nieprawidłowego wyboru profilu.
   2. Jeśli kulki zostały prawidłowo zawieszone, powinny wypełnić określone "obszary" wskazane w oprogramowaniu czytnika testów.
   3. Jeśli koraliki zostaną zagregowane, będą wypełniać swoje obszary w wolnym tempie. Możesz wyjąć płytkę testową z czytnika i ręcznie ponownie zawiesić studzienki. Rozetruj każdą studzienkę pipetą wielokanałową 3-4 razy, aby pomóc w rozdrobnieniu agregatów kulek. Włóż płytkę testową do czytnika i kontynuuj.

12. Reprezentatywne wyniki

1. Minimalna liczba kulek jest odczytywana na test, a intensywność fluorescencji fikoerytryny jest podawana jako mediana wskaźnika fluorescencji (MFI) w zakresie od 0 do 32 667. Po porównaniu liczby 25, 50 lub 100 kulek na studzienkę nie zauważyliśmy żadnej różnicy statystycznej i rutynowo liczymy 25 kulek na czynnik na próbkę studzienki. Sprawdź raport z wynikami pod kątem błędów, takich jak niewystarczająca liczba kulek lub nieprawidłowe wyniki kulek IgG / anty-IgG. Kulki te są zaprojektowane tak, aby "nacinać" się w ustalonym z góry zakresie MFI, gdy do każdej studzienki dodaje się odpowiednią ilość surowicy pierwotnej i znakowanych odczynników. Studzienki do pobierania próbek z błędami (niska liczba kulek) lub nieprawidłowymi punktami kontrolnymi IgG należy powtórzyć w celu uzyskania prawidłowych wyników.
2. Wyeksportuj wyniki do arkusza programu Excel. Do naszej interpretacji danych każdy test jest przypisany:
   1. Test kontroli tkanek (TC): W przypadku większości testów MFIA na gryzoniach kontrola tkanek polega na ekstrakcji komórek owadów zakażonych dzikim wirusem bakulowirusa.
   2. Punkt odcięcia testu: Ta wartość jest minimalną oczekiwaną fluorescencją i jest dostosowywana dla każdego testu w celu maksymalizacji dokładności diagnostycznej. W przypadku większości testów granica fluorescencji wynosi 3000.
3. Medianę wskaźnika fluorescencji netto (MFI) oblicza się dla każdego testu (z wyjątkiem badań kontrolnych tkanek i IgG) według następującego wzoru. Innymi słowy, specyficznym sygnałem testu jest całkowity test MFI minus TC (tło) MFI Ta wartość jest następnie dzielona przez 1000, co po prostu ustawia zakres MFI netto w zakresie 0-32 zamiast 0-32,667,
   
   
   Netto MFI = (_{Test przeciwciał} MFI -_{kontrola tkanek} MFI) / 1000
   
   MFI netto i MFI TC są przeliczane na wyniki przez porównanie z punktem odcięcia testu specyficznym dla każdego antygenu.
   
   
   Rysunek 2. Reprezentatywne dane MFIA dla surowic testowych z wynikiem pozytywnym wszystkich kontroli IgG.
4. 12.4 Interpretacja MFIA
   1. Wyniki badań na płytkach powinny być interpretowane tylko wtedy, gdy wyniki kontroli przydatności systemu i kontroli surowicy (kulki IgG / anty-IgG) spełniają kryteria akceptacji wymienione w tabeli 2. Niepowodzenie tych dwóch kulek kontrolnych IgG może wskazywać na kilka błędów proceduralnych, takich jak niewłaściwe rozcieńczenie lub niewystarczająca objętość koniugatu lub SPE, niewłaściwe rozcieńczenie surowicy testowej lub użycie surowicy od zwierzęcia z układem immunologicznym.

Tabela 2

Kryteria akceptacji dla kontroli testowych Kontrola Dopuszczalny wynik wynik klasyfikacja Serum odpornościowe wysokiego zasięgu ≥ 4,5 Plus Surowica immunologiczna niskiego zasięgu ≥ 1,5 ≥ Granica Surowica nieimmunologiczna < 2,5 ≤ Granica Rozcieńczalnika < 2,5 ≤ Granica Zestaw koralików ig* ≥ Odcięcie/1000 przechodzić

*Zestaw koralików pokryty specyficzną dla gatunku immunoglobuliną (Ig) w surowicy przeciwtestowej: niezadowalające wyniki kontroli przydatności tej próbki mogą wynikać z dodania niewystarczającej ilości próbki, zbyt dużego rozcieńczenia próbki, niewłaściwego gatunku lub testowania surowicy od gospodarza z niedoborem odporności.

2. Jeśli którykolwiek z testów kontrolnych na płytce testowej zakończy się niepowodzeniem, z wyjątkiem surowicy immunologicznej wysokiego zakresu, wyniki są niedopuszczalne i należy je powtórzyć. Przejście wyników kontrolnych surowicy w niskim zakresie ma kluczowe znaczenie, ponieważ pokazuje poziom czułości wykrywania płytki testowej.
3. Wynik kulek IgG antygatunkowego kozła opiera się na ilości pierwotnej surowicy testowej dodanej do testu. Jeśli ten koralik kontrolny zawiedzie, ale gatunek IgG przejdzie (dołek B1, ryc. 3), oznacza to, że do dołka testowego dodano wystarczającą ilość odczynników testowych (BAG, SPE) i jest to problem związany z surowicą. Jeśli ilość odczynników testowych w danym dołku jest niewystarczająca, zarówno kulki kontrolne IgG, jak i anty-IgG ulegną awarii (Well E1, Fig.3).
   
   
   Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki testów MFIA z awariami (oznaczone na pomarańczowo). Studzienki A1, C1 i F1 wskazują na niewydolność TC (reaktywną tkankowo), gdzie wynik TC jest reprezentowany w nawiasach. Studzienki B1 i E1 ilustrują dwa rodzaje niepowodzeń kontroli wewnętrznej IgG, niewystarczające przeciwciało testowe (B1) lub odczynniki testowe (E1) odpowiednio BAG / SPE.
   
4. Jeżeli wyniki kontroli testu na płytce testowej są zadowalające, poszczególne wyniki testu klasyfikuje się zgodnie z tabelą 3. Bardzo ważne jest, aby potwierdzić wszelkie graniczne lub dodatnie wyniki za pomocą alternatywnej metody testowej.

Tabela 3

Klasyfikacja wyników MFIA Wynik Klasyfikacja Tc sieć TC + Sieć* ≥ 2 < 0,5 < 2,5 Negatywny (-) ≥ 0,5 ≥ 2,5 Reakcja TC (T) < 2 < 1,5   - 1,5 ≤ X < 2,5   Linia graniczna (B) ≥ 2,5   Pozytywne (+)

*Klasyfikacja negatywna może być nadal określona z niezerowym wynikiem TC, pod warunkiem, że wynik TC + Net ( = Ag) jest ujemny

Discussion

Proces testowania MFIA jest bardzo wydajny, wymaga mniejszej ilości sprzętu oraz mniejszych objętości próbek i odczynników niż tradycyjne testy singleplex. Funkcjonalność systemu multipleksowego daje użytkownikowi elastyczność w zakresie jednoczesnego badania przesiewowego pod kątem wielu szczepów lub serotypów powszechnych czynników chorobotwórczych u gryzoni laboratoryjnych (np. koronawirusa, parwowirusów itp.). Umożliwia nam to również projektowanie niestandardowych paneli perełkowych w oparciu o obszar zainteresowania (tj. konkretną rodzinę wirusów) i można je dostosować do badań przesiewowych innych typów biomolekuł, w tym cytokin i innych biomarkerów. Ponadto pozwala nam to na włączenie kilku testów kontroli wewnętrznej w celu sprawdzenia przydatności próbki i systemu, a tym samym zapewnienia dokładności wyników. Obejmują one kontrolę tkanek i zestawy kulek pokrytych immunoglobuliną (αIg) przeciwko testom IgG w surowicy w celu oceny przydatności próbki. Kulka kontrolna tkankowa wykrywa nieswoiste wiązanie immunoglobuliny w surowicy, a kontrola kulki αIg potwierdza, że surowica została dodana i zawiera wystarczające stężenie immunoglobuliny. Inny koralik kontrolny, pokryty immunoglobuliną surowicy, pokazuje, że znakowane odczynniki i czytnik testowy działają prawidłowo. Inne dostępne na rynku testy serologiczne w formacie multipleksu (tj. MicroArrays, ImmunoComb) mogą nie oferować tego samego poziomu potwierdzenia wyników.

Możliwość zawężenia możliwego źródła niepowodzenia testu przed ponownym testowaniem może pomóc badaczowi zaoszczędzić czas i materiały. Krytyczne aspekty MFIA powinny zostać potwierdzone przed powtórzeniem próbki, która zakończyła się niepowodzeniem. Ponieważ test przeprowadza się w temperaturze otoczenia, należy sprawdzić, czy temperatura laboratoryjna wynosi około 27°C±2°C, wyższe temperatury mogą prowadzić do niższych niż oczekiwano wyników dla kontroli i próbek. Mycie jest prawdopodobnie najbardziej krytycznym krokiem w teście. Zapewnienie, że płytka testowa jest prawidłowo umyta, osuszona i ponownie zawieszona, może wyeliminować zdecydowaną większość błędów pobierania próbek spowodowanych niską liczbą kulek (z powodu zagregowanych kulek) lub niewystarczającym dodatkiem odczynnika (utraconym przez odprowadzanie wilgoci z dna filtra płytki testowej). Rutynowo liczymy 25 kulek na test (czynnik) i nie znaleźliśmy statystycznej różnicy w wynikach przy liczeniu większej liczby kulek, co również doprowadzi do dłuższego czasu odczytu płytki.

Przeprowadziliśmy kompleksowe badania walidacyjne MFIA na kilku gatunkach powszechnie wykorzystywanych zwierząt laboratoryjnych (myszy, szczury, chomiki, świnki morskie i króliki), aby wykazać dokładność diagnostyczną, odtwarzalność i wytrzymałość, testując dużą liczbę znanych dodatnich i ujemnych próbek surowicy oraz porównując ich wyniki ELISA, IFA i MFIA. Granice wykrywalności (tj. standardowe punkty końcowe miareczkowania surowicy immunologicznej) MFIA były porównywalne, a w niektórych przypadkach przewyższane, a w niektórych przypadkach przewyższały wartości odpowiadającego mu testu ELISA. Swoistość diagnostyczna, mierzona surowicami gryzoni SPF, przekroczyła 99%; ogólna zgodność między testami ELISA i MFIA przeprowadzona na znanych dodatnich i znanych ujemnych surowicach była większa niż 95%. Podsumowując, wyniki te dowiodły, że multiplex MFIA jest dobrą alternatywą dla testu ELISA singleplex i nadaje się do zamierzonego zastosowania, tj. w rutynowym nadzorze serologicznym nad koloniami zwierząt laboratoryjnych.