Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami hematologicznymi za pomocą technologii przepływu bocznego

Summary

Przedstawiono szybki i dokładny test przyłóżkowy na inwazyjną aspergilozę płuc. Wykorzystuje technologię przepływu bocznego wykorzystującą specyficzne przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z antygenem Aspergillus wydzielanym podczas infekcji płuc. Test jest zgodny z płukaniem surowicy i pęcherzyków brochopęcherzykowych i stanowi nowatorski test wspomagający do diagnozowania choroby.

Abstract

Inwazyjna aspergiloza płuc (IPA) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z nowotworami hematologicznymi i biorców przeszczepów krwiotwórczych komórek macierzystych¹. Wykrycie IPA stanowi ogromne wyzwanie diagnostyczne i w przypadku braku "złotego standardu" opiera się na połączeniu danych klinicznych oraz mikrobiologii i histopatologii, jeśli jest to możliwe. Rozpoznanie IPA musi być zgodne z konsensusem Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Raka oraz Grupy Badawczej Mykologii Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (EORTC/MSG) definiującym "udowodnione", "prawdopodobne" i "możliwe" inwazyjne choroby grzybicze². Obecnie żadne testy oparte na kwasach nukleinowych nie zostały zewnętrznie zwalidowane pod kątem wykrywania IPA, a zatem reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) nie jest uwzględniona w obecnych kryteriach diagnostycznych EORTC/MSG.

Identyfikacja Aspergillus w sekcjach histologicznych jest problematyczna ze względu na podobieństwa w morfologii strzępek z innymi inwazyjnymi patogenami grzybowymi³, a udowodniona identyfikacja wymaga izolacji czynnika etiologicznego w czystej kulturze. Podejścia oparte na hodowli opierają się na dostępności próbek biopsyjnych, ale nie zawsze są one dostępne u chorych pacjentów i nie zawsze dają żywe propagule do posiewu po uzyskaniu.

Ważną cechą w patogenezie Aspergillus jest angio-inwazja, cecha, która daje możliwość immunologicznego śledzenia grzyba za pomocą testów, które wykrywają charakterystyczne cząsteczki sygnatur antygenowych w płynach z płukania surowicy i oskrzelowo-pęcherzyków płucnych (BAL). Doprowadziło to do opracowania testu immunoenzymatycznego Platelia (GM-EIA), który wykrywa galaktomannan Aspergillus, oraz testu "pan-grzybiczego" (test Fungitell), który wykrywa konserwatywny składnik ściany komórkowej grzyba (1 →3)-β-D-glukan, ale nie w mucoralach, które nie mają tego składnika w swoich ścianach komórkowych^1,4. Problemy związane z dokładnością tych testów^1,4-6 doprowadziły do niedawnego opracowania testów opartych na przeciwciałach monoklonalnych (MAb) nowej generacji, które wykrywają zastępcze markery infekcji^1,5.

Thornton⁵ niedawno opisał generowanie specyficznego dla Aspergillusa MAb (JF5) przy użyciu technologii hybrydoma i jej wykorzystanie do opracowania immunochromatograficznego urządzenia do przepływu bocznego (LFD) do diagnostyki IPA w miejscu opieki nad pacjentem (POC). Główną zaletą LFD jest jego zdolność do wykrywania aktywności, ponieważ MAb JF5 wiąże się z zewnątrzkomórkowym antygenem glikoproteinowym, który jest wydzielany podczas aktywnego wzrostu grzyba^{tylko 5}. Jest to ważna kwestia przy stosowaniu płynów, takich jak płuca BAL, do diagnozowania IPA, ponieważ zarodniki Aspergillus są częstym składnikiem wdychanego powietrza. Przydatność urządzenia w diagnozowaniu IPA wykazano przy użyciu zwierzęcego modelu infekcji, w którym LFD wykazywał lepszą czułość i swoistość w porównaniu z testami Platelia GM i Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan⁷.

Tutaj prezentujemy prostą procedurę LFD do wykrywania antygenu Aspergillus w ludzkiej surowicy i płynach BAL. Jego szybkość i dokładność stanowią nowatorski test wspomagający w miejscu opieki nad pacjentem do diagnozowania IPA u pacjentów z nowotworami hematologicznymi.

Protocol

1. Zbieranie, przechowywanie i przygotowanie surowicy i płynów do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

1. Pobrać surowicę z niepoddanych działaniu substancji próbek krwi, pozwalając krwi zakrzepnąć w temperaturze 4 °C, a przed użyciem przechowywać surowicę w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Płyny z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) powinny być również przechowywane w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Uwaga: Przechowywanie surowicy i BAL w postaci podwielokrotności ogranicza możliwość degradacji docelowego antygenu przez wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbek podczas powtórnych badań.
2. Rozmrozić próbki i dokładnie wymieszać próbki surowicy i BAL poprzez wirowanie i odwirowywanie przez 1 minutę przy 14 000 obr./min.
3. W celu rutynowego badania próbek surowicy ludzkiej należy rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 (v/v) pożywką do hodowli tkankowych (TCM). TCM składa się z pożywki RPMI-1640, 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 1% (v/v) 200mM roztworu L-glutaminy i azydku sodu (0,02% w/v) jako środka konserwującego. Pożywka jest przygotowywana z wyprzedzeniem i może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Nanieś 100 μl rozcieńczonej surowicy na LFD.
4. W przypadku płynów BAL u ludzi oraz płynów BAL z modeli zwierzęcych należy nanieść 100 μl czystej próbki do LFD, bez obróbki wstępnej.
5. W przypadku surowicy z modeli zwierzęcych rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 (v/v) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem zawierającym 4% (w/v) EDTA, podgrzewać przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej, wirować przez 5 minut przy 14 000 obr./min i nanieść 100 μl czystego supernatantu na urządzenie LFD.

2. Nakładanie surowicy i BAL na urządzenie z przepływem bocznym

1. Urządzenia z przepływem bocznym należy przechowywać w temperaturze pokojowej (23 °C). W tej temperaturze urządzenia są stabilne przez 12 miesięcy. Wyjmij urządzenia z woreczków i umieść je na równej powierzchni.
2. Za pomocą sterylnej końcówki pipety nanieść 100 μl wstępnie poddanej obróbce surowicy lub czystej próbki BAL do portu uwalniania urządzenia.
3. Pozostawić test na 15 minut w temperaturze pokojowej, w którym to czasie należy zapisać wyniki badań. Uwaga: W ciągu kilku sekund będzie można zaobserwować, jak płyn migruje w wyniku działania kapilarnego wzdłuż membrany nitrocelulozowej w oknie obserwacyjnym.

3. Rejestrowanie i interpretacja wyników LFD

1. LFD składa się z wewnętrznego przewodu sterującego (oznaczonego literą C na plastikowej obudowie) i przewodu testowego (oznaczonego literą T). Linia kontrolna powinna zawsze pojawiać się niezależnie od antygenu Aspergillus w próbce surowicy lub BAL. Świadczy to o tym, że test przebiegł prawidłowo.
2. Jeśli antygen Aspergillus jest obecny w próbce surowicy lub BAL, linia testowa pojawi się również w ciągu 15 minut od nałożenia próbki. Ponieważ intensywność linii testowej jest proporcjonalna do ilości antygenu Aspergillus obecnego w próbce, linia testowa może pojawić się jako słabo dodatnia (+), umiarkowanie dodatnia (++) lub jako silnie dodatnia (+++). Jednak każda dodatnia linia testowa, niezależnie od intensywności, wskazywałaby na obecność antygenu Aspergillus w próbce. W przypadku braku antygenu Aspergillus nie pojawi się żadna linia testowa, a wynik jest zapisywany jako ujemny (-).

4. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne przykłady negatywnych, słabych dodatnich, umiarkowanie pozytywnych i silnych pozytywnych wyników LFD z próbkami BAL i surowicy są pokazane na rysunku 1.

Wyniki testów LFD z dodatnim antygenem (słabe i silne) lub ujemnych testów LFD z użyciem płynów BAL od pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi EORTC/MSG są pokazane w Tabeli 1. W tej tabeli znajdują się odpowiednie dane kliniczne i mikologiczne (galaktomannan i hodowla) oraz wyniki testu PCR specyficznego dla Aspergillus, opracowanego w Szpitalu św. Bartłomieja⁸ dla każdego pacjenta. Rozpoznanie choroby opierało się na czynnikach gospodarza (neutropenia, długotrwałe stosowanie kortykosteroidów, leczenie innymi uznanymi lekami immunosupresyjnymi z limfocytów T), kryteriach klinicznych i dodatnim wyniku GM dla BAL (tutaj zdefiniowanym jako wartość indeksu GM > 0,8). Zgodnie z wytycznymi EORTC/MSG z 2002 r.¹⁰, u pacjentów w wieku 12, 13 i 16 lat zdiagnozowano "możliwą" IA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GMO. Zgodnie ze zmienionymi (2008) wytycznymi EORTC/MSG², czynniki gospodarza i dodatniość GM same w sobie lub czynniki gospodarza i kryteria kliniczne same w sobie nie wskazują na "możliwe" inwazyjne zakażenie grzybicze, chyba że towarzyszą im dowody potwierdzające odpowiednio z danych klinicznych i mikologii. U pacjenta 6 zdiagnozowano "prawdopodobną" IA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 r. ze względu na czynniki gospodarza, główne i mniejsze cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM. Należy zauważyć, że chociaż ani testy LFD, ani PCR nie są obecnie uwzględnione w wytycznych EORTC/MSG, istnieje silna zgodność między tymi dwoma testami a komercyjnym testem galaktomannanu wskazującym na obecność antygenu Aspergillus i kwasu nukleinowego w próbkach BAL pacjentów 6 i 12. Dodatkowe wyniki badań wykazujących skuteczność testów LFD i PCR w diagnostyce IPA można znaleźć w Johnson i wsp. ⁸.

Rysunek 1. Ujemne (tylko linia kontrolna) i pozytywne (linia kontrolna i testowa) wyniki testów LFD z użyciem surowicy i BAL. Intensywność reakcji na linii badawczej jest proporcjonalna do stężeń docelowego antygenu w próbkach surowicy i BAL. Reakcje zazwyczaj wahają się od słabych (+) przez umiarkowane (++) do silnych (+++). Niezależnie od intensywności linii testowej, wszystkie trzy dodatnie reakcje surowicy wskazywałyby na inwazyjną chorobę aspergilozy płucnej z powodu obecności krążącego antygenu Aspergillus we krwi. Dodatnie reakcje BAL (słabe, umiarkowane lub silne) wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.

Pacjent nr.	Informacje dla pacjenta	Kryteria kliniczne1	Kultura BAL2	Indeks EIAGM 3	EORTC / MSG (2002)4	EORTC / MSG (2008)5	Wynik testu Aspergillus PCR	Wynik LFD
6	-	Główne objawy CT (guzek i aureola) i jeden mniejszy	Minus	0,9 (pozytywny)	prawdopodobny	prawdopodobny	Plus	Słaby dodatni (+)
12	Przypuszczalna wcześniejsza infekcja grzybicza	Nie ma majora, jeden drobny	Candida glabrata (Candida glabrata	6,43 (silny pozytywny)	możliwy	żaden	Plus	Silny pozytyw (+++)
13	Koagulazo-ujemny Staphylococcus i E. coli we krwi	Bez durowych, dwa drobne	Minus	0,25 (negatywny)	możliwy	żaden	Minus	Negatywny (-)
16	Infekcja klatki piersiowej	3 mniejsze kryteria, w tym nowy naciek plus wysięk mnogi	Minus	0,16 (negatywny)	możliwy	żaden	Minus	Negatywny (-)

)

¹ Guzki lub aureole na tomografii komputerowej sugerują infekcję grzybiczą
² Candida glabrata w płynie BAL byłby uważany za zanieczyszczenie, ponieważ jest to drugi najczęściej występujący drożdżak izolowany jako część normalnej flory człowieka^9
3 Wskaźnik >0,8 w teście OOŚ GM BAL wskazuje na zakażenie Aspergillus
>⁴ Na podstawie kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG z 2002 r. dla "możliwej", "prawdopodobnej" lub "udowodnionej" inwazyjnej choroby grzybiczej^10
5 Na podstawie zmienionych (2008) kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG dla "możliwej", "prawdopodobnej" lub "udowodnionej" inwazyjnej choroby grzybiczej²

Tabela 1. Wyniki badań LFD próbek BAL od pacjentów z ostrą białaczką szpikową z prawdopodobnym IPA oraz od pacjentów z grupy kontrolnej AML (brak dowodów na zakażenie) oraz rozpoznanie zakażenia EORTC/MSG.

Discussion

Ostateczna identyfikacja IPA może być naprawdę osiągnięta tylko poprzez wyizolowanie czynnika etiologicznego z próbek biopsyjnych, ale odzyskanie odpowiednich próbek często nie jest możliwe u bardzo chorych pacjentów, a Aspergillus rzadko jest możliwy do odzyskania z krwi. Chociaż poczyniono znaczne postępy w stosowaniu tomografii komputerowej klatki piersiowej w diagnostyce IPA, cechy sugerujące płucne IPA, takie jak objawy "halo" lub "półksiężyc powietrzny", są albo przejściowe, albo można je przypisać artefaktom oddychania lub innym infekcjom grzybiczym^11,12. Dane te są zatem uzupełniane technikami serologicznymi, które mają na celu identyfikację cząsteczek sygnaturowych (GM i β-glukanu) grzybów, które krążą w surowicy pacjenta lub które są obecne w płynach BAL, plwocinie lub próbkach moczu¹³. Chociaż testy te wykazują zadowalającą czułość, brakuje im wystarczającej swoistości lub w pewnych warunkach ulegają zakłóceniom^1,6.

Prezentowany tutaj test LFD do wykrywania IPA umożliwia diagnostykę IPA w miejscu opieki nad pacjentem i wykorzystuje technologię, która była do tej pory stosowana w testach do wykrywania wirusów, bakterii, pasożytów i toksyn^14-19 oraz, co najbardziej znane, w domowych testach ciążowych wprowadzonych po raz pierwszy przez Unipath w 1988 roku. W opisanym tutaj Aspergillus LFD specyficzny dla Aspergillusa MAb JF5 jest unieruchomiony w strefie wychwytywania (linii testowej) na porowatej membranie nitrocelulozowej. Immunoglobulina przeciw mysiu unieruchomiona na błonie w oddzielnej strefie służyła jako kontrola wewnętrzna (linia kontrolna). Po dodaniu surowicy lub płynu BAL do portu uwalniania, koniugat MAb JF5-koloidalnego złota w podkładce antyadhezyjnej wiąże się z docelowym antygenem, a następnie kompleks przechodzi wzdłuż porowatej błony przez działanie kapilarne. MAb JF5 unieruchomiony w strefie wychwytywania wiąże się z JF5-koloidalnym kompleksem złoto-antygen, tworząc czerwoną linię testową. Każdy niezwiązany koniugat złota koloidalnego JF5 wiąże się z kontrolą wewnętrzną, co wskazuje, że test przebiegł prawidłowo. Powoduje to powstanie czerwonej linii kontrolnej.

Test jest szybki, trwa tylko 15 minut, jest tani w porównaniu z testami surowicy i BAL opartymi na wykrywaniu GM i β-glukanu, a także nie wymaga drogiego sprzętu ani rozbudowanego zaplecza laboratoryjnego. Ponadto MAb JF5 nie wchodzi w reakcję krzyżową z lekami lub zanieczyszczeniami, które, jak wykazano, powodują fałszywie dodatnią reakcję w testach GM i β-glukanów^1,4,6. Dodatkową istotną zaletą w porównaniu z obecnymi testami diagnostycznymi jest zdolność LFD do wykrywania aktywności wskazującej na inwazyjny wzrost gatunków Aspergillus .

Krytycznym etapem procedury LFD jest konieczność odczytania wyników po 15 minutach od aplikacji próbki surowicy lub BAL do urządzenia. Test nie powinien być pozostawiony na dłużej niż 15 minut przed zapisaniem wyników, ponieważ może to zniekształcić interpretację wyników. Słaba reakcja nie zostanie wzmocniona przez wydłużenie okresu inkubacji. Stwierdzono, że obróbka cieplna surowicy ze zwierzęcych modeli infekcji poprawia czułość testu. Ograniczeniem testu jest to, że jest on jakościowy i polega na tym, że operator dokonuje subiektywnej oceny pozytywności. Intensywność linii testowej zmienia się w zależności od zawartości antygenu w próbkach surowicy i BAL (ryc. 1). Jednak każda pozytywna reakcja (określona przez porównanie ze znanymi wynikami ujemnymi) wskazuje na obecność antygenu Aspergillus , a tym samym na zakażenie. Aby ograniczyć subiektywność testów LFD, dostępne są urządzenia ręczne, które umożliwiają ilościowe określenie intensywności linii testowej LFD i umożliwiają ustalenie wartości progowych dla wykrywania antygenu²⁰.

Przyszły rozwój LFD obejmuje jego komercjalizację i opracowanie multipleksowego LFD, który umożliwia jednoczesne wykrywanie innych inwazyjnych patogenów grzybiczych za pomocą wysoce specyficznych MAbs³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspergillus LFD	Uniwersytet w Exeter		Dostępne u autora korespondencyjnego na żądanie
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Surowica cielęca płodu	Biosurica	S9100	Inne źródła płodowej surowicy cielęcej mogą być stosowane do przygotowania TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1