Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Podsumowanie

Przedstawiono szybki i dokładny test typu point-of-care w kierunku inwazyjnej aspergilozy płucnej. Wykorzystuje on technologię przepływu bocznego z zastosowaniem specyficznego przeciwciała monoklonalnego, które wiąże antygen Aspergillus wydzielany podczas infekcji płucnych. Analiza jest kompatybilna z surowicą oraz płuczynami z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i stanowi nowy test pomocniczy w diagnostyce choroby.

Streszczenie

Inwazyjna aspergiloza płucna (IPA) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z nowotworami hematologicznymi oraz u biorców przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych¹. Wykrywanie IPA stanowi ogromne wyzwanie diagnostyczne i wobec braku „złotego standardu” opiera się na kombinacji danych klinicznych oraz, w miarę możliwości, wyników mikrobiologii i histopatologii. Rozpoznanie IPA musi być zgodne z konsensusem Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Grupy Badawczej Mykologii Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (EORTC/MSG), który definiuje inwazyjne grzybice jako „potwierdzone”, „prawdopodobne” i „możliwe”². Obecnie żadne testy oparte na kwasach nukleinowych nie zostały zewnętrznie zwalidowane do wykrywania IPA, dlatego reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) nie jest uwzględniona w aktualnych kryteriach diagnostycznych EORTC/MSG.

Identyfikacja Aspergillus w skrawkach histologicznych jest problematyczna ze względu na podobieństwo morfologii strzępek do innych inwazyjnych patogenów grzybiczych³, a potwierdzona identyfikacja wymaga wyizolowania czynnika etiologicznego w czystej kulturze. Metody oparte na hodowli zależą od dostępności próbek biopsyjnych, które jednak nie zawsze są możliwe do pobrania u ciężko chorych pacjentów, a w przypadku ich pozyskania nie zawsze dostarczają żywotnych propaguli do hodowli.

Ważną cechą w patogenezie Aspergillus jest angioinwazja, cecha ta stwarza możliwości immunologicznego śledzenia grzyba za pomocą testów wykrywających charakterystyczne cząsteczki sygnatur antygenowych w surowicy i płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Doprowadziło to do opracowania enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego Platelia (GM-EIA), który wykrywa galaktomannan Aspergillus, oraz testu „pan-grzybiczego” (test Fungitell), który wykrywa konserwowany składnik ściany komórkowej grzybów (1 →3)-β-D-glukan, jednak nie w przypadku Mucorales, których ściany komórkowe są pozbawione tego składnika^1,4. Kwestie związane z dokładnością tych testów^1,4-6 doprowadziły do niedawnego opracowania testów nowej generacji opartych na przeciwciałach monoklonalnych (MAb), które wykrywają markery zastępcze infekcji^1,5.

Thornton⁵ opisał niedawno wytworzenie swoistego dla Aspergillus przeciwciała monoklonalnego (MAb JF5) z wykorzystaniem technologii hybridoma oraz jego zastosowanie w opracowaniu immunochromatograficznego testu przepływu bocznego (LFD) do diagnostyki przy łóżku pacjenta (POC) w przypadku inwazyjnej aspergilozy płuc (IPA). Główną zaletą testu LFD jest zdolność do wykrywania aktywności zakażenia, ponieważ MAb JF5 wiąże się z zewnątrzkomórkowym antygenem glikoproteinowym, który jest wydzielany wyłącznie podczas aktywnego wzrostu grzyba⁵. Jest to istotna kwestia przy stosowaniu płynów, takich jak płyn z rozszerzonego pobierania z oskrzeli (BAL) do diagnostyki IPA, ponieważ zarodniki Aspergillus są powszechnym składnikiem wdychanego powietrza. Użyteczność urządzenia w diagnostyce IPA została wykazana z wykorzystaniem zwierzęcego modelu zakażenia, w którym test LFD wykazał wyższą czułość i swoistość w porównaniu do testów Platelia GM oraz Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan⁷.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą procedurę LFD służącą do wykrywania antygenu Aspergillus w ludzkiej surowicy oraz płynach z BAL. Szybkość i dokładność tej metody stanowią nowatorskie, pomocnicze badanie w punkcie opieki (point-of-care), umożliwiające diagnostykę IPA u pacjentów z nowotworami hematologicznymi.

Protokół

1. Pobieranie, przechowywanie i przygotowanie surowicy oraz płynu z płukania przypłupnego

1. Pozyskaj surowicę z nieobrobionych próbek krwi, pozwalając krwi skrzepnąć w temperaturze 4 °C, a następnie przechowuj surowicę w formie alikwotów w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Płyn z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) również należy przechowywać w formie alikwotów w temperaturze -20 °C. Uwaga: Przechowywanie surowicy i BAL w formie alikwotów ogranicza możliwość degradacji docelowego antygenu w wyniku wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek podczas powtarzalnych testów.
2. Rozmroź próbki, a następnie dokładnie wymieszaj próbki surowicy i BAL za pomocą vortexera i wiruj przez 1 min w temperaturze 14,000 rpm.
3. W przypadku rutynowych badań próbek ludzkiej surowicy, rozcieńcz surowicę w stosunku 1:1 (v/v) pożywką do hodowli tkankowych (TCM). TCM składa się z pożywki RPMI-1640, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 1% (v/v) roztworu L-glutaminy 200mM oraz azotku sodu (0,02% w/v) jako konserwantu. Pożywkę przygotowuje się z wyprzedzeniem i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Nanieś 100 μl rozcieńczonej surowicy na LFD.
4. W przypadku ludzkich płynów BAL oraz płynów BAL z modeli zwierzęcych, nanieś 100 μl czystej próbki na LFD, bez żadnej wstępnej obróbki.
5. W przypadku surowicy z modeli zwierzęcych, rozcieńcz surowicę w stosunku 1:2 (v/v) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym zawierającym 4% (w/v) EDTA, podgrzewaj przez 3min w kąpieli wodnej w temperaturze wrzenia, wiruj przez 5 min przy 14,000 rpm, a następnie nanieś 100 μl czystego supernatantu na urządzenie LFD.

2. Naniesienie surowicy i BAL na urządzenie do przepływu bocznego

1. Przechowywać testy przepływu bocznego w temperaturze pokojowej (23 °C). W tej temperaturze urządzenia są stabilne przez 12 miesięcy. Wyjąć testy z opakowań i położyć na płaskiej powierzchni.
2. Za pomocą sterylnego końcówki pipety nanieść 100 μl wstępnie opracowanej surowicy lub czystej próbki BAL do otworu aplikacji urządzenia.
3. Pozostawić test do analizy na 15 min w temperaturze pokojowej, po czym należy zapisać wyniki. Uwaga: W ciągu kilku sekund będzie widoczna migracja płynu przez działanie kapilarne wzdłuż membrany nitrocelulozowej w oknie obserwacyjnym.

3. Rejestracja i interpretacja wyników LFD

1. LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej (oznaczonej literą C na plastikowej obudowie) oraz linii testowej (oznaczonej literą T). Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu Aspergillus w próbce surowicy lub BAL. Świadczy to o prawidłowym przebiegu testu.
2. Jeśli w próbce surowicy lub BAL obecny jest antygen Aspergillus, linia testowa pojawi się również w ciągu 15 min od nałożenia próbki. Ponieważ intensywność linii testowej jest proporcjonalna do ilości antygenu Aspergillus obecnego w próbce, linia ta może wystąpić jako słaby wynik dodatni (+), umiarkowany wynik dodatni (++) lub silny wynik dodatni (+++). Niemniej jednak każda dodatnia linia testowa, niezależnie od intensywności, wskazuje na obecność antygenu Aspergillus w próbce. W przypadku braku antygenu Aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostanie zapisany jako ujemny (-).

4. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne przykłady wyników LFD ujemnych, słabo dodatnich, umiarkowanie dodatnich oraz silnie dodatnich dla próbek BAL i surowicy przedstawiono na Rysunku 1.

Wyniki testów LFD dodatnich pod kątem antygenu (słabe i silne) lub testów LFD ujemnych z wykorzystaniem płynu z BAL pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi EORTC/MSG przedstawiono w Tabeli 1. W tabeli tej ujęto odpowiadające im dane kliniczne i mykologiczne (galaktomanan i hodowla) oraz wyniki specyficznego dla Aspergillus testu PCR opracowanego w St. Bartholomews Hospital⁸ dla każdego pacjenta. Diagnoza choroby opierała się na czynnikach gospodarza (neutropenia, przedłużone stosowanie kortykosteroidów, leczenie innymi uznanymi immunosupresyjnymi lekami przeciwko limfocytom T), kryteriach klinicznych oraz dodatnim wyniku GM dla BAL (zdefiniowanym tutaj jako wartość indeksu GM > 0,8). Zgodnie z wytycznymi EORTC/MSG z 2002 r.¹⁰, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano „prawdopodobną” (possible) IA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych (2008) wytycznych EORTC/MSG² same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na „prawdopodobną” (possible) inwazyjną infekcję grzybiczą, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio potwierdzające dowody z danych klinicznych i mykologii. U pacjenta 6 zdiagnozowano „wysoce prawdopodobną” (probable) IA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 r. ze względu na czynniki gospodarza, główne i poboczne objawy kliniczne oraz dodatni wynik GM. Należy zauważyć, że choć testy LFD i PCR nie są obecnie ujęte w wytycznych EORTC/MSG, istnieje silna zgodność między oboma testami a komercyjnym testem na galaktomanan, co wskazuje na obecność antygenu i kwasu nukleinowego Aspergillus w próbkach BAL pacjentów 6 i 12. Dodatkowe wyniki badań wykazujących skuteczność testów LFD i PCR w diagnostyce IPA można znaleźć w pracy Johnson et al⁸.

Rysunek 1. Wyniki negatywne (tylko linia kontrolna) i pozytywne (linia kontrolna i testowa) w testach LFD z wykorzystaniem surowicy oraz płynu z przemycia oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL). Intensywność reakcji linii testowej jest proporcjonalna do stężenia docelowego antygenu w próbkach surowicy i BAL. Reakcje zazwyczaj wahają się od słabych (+) przez umiarkowane (++) do silnych (+++). Bez względu na intensywność linii testowej, wszystkie trzy pozytywne reakcje w surowicy wskazywałyby na inwazyjną aspergilozę płuc ze względu na obecność krążącego antygenu Aspergillus w krwiobiegu. Pozytywne reakcje w BAL (słabe, umiarkowane lub silne) wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.

Nr pacjenta	Informacje o pacjencie	Kryteria kliniczne1	Posiew treści z BAL2	indeks GM EIA3	EORTC / MSG (2002)4	EORTC / MSG (2008)5	Aspergillus Wynik PCR	Wynik LFD
6	-	Główne objawy w TK (guzek i halo) oraz jeden objaw poboczny	Negatywny	0,9 (dodatni)	Prawdopodobne	Prawdopodobne	Dodatni	Słaby wynik dodatni (+)
12	Domniemywana wcześniejsza grzybica	Brak istotnych zastrzeżeń, jedno drobne zastrzeżenie	Candida glabrata	6,43 (silnie dodatni)	Możliwe	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Dodatni	Silnie dodatni (+++)
13	koagulaza-ujemne Gronkowiec i E. coli we krwi	Brak istotnych, dwa nieistotne	Negatywny	0,25 (wynik negatywny)	Możliwe	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Ujemny	Negatywny (-)
16	Infekcja klatki piersiowej	3 kryteria mniejsze, w tym nowe nacieki oraz wysięk w opłucznie	Negatywny	0,16 (ujemny)	Możliwe	Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.	Ujemny	Ujemna (-)

¹ Guzki lub halo w tomografii komputerowej sugerują grzybiczą infekcję
² Obecność Candida glabrata w płycie BAL uznaje się za zanieczyszczenie, ponieważ jest to drugi najczęstszy drożdżak izolowany jako element normalnej flory ludzkiej^9
3 Wskaźnik >0,8 w teście GM EIA z płynu BAL wskazuje na infekcję Aspergillus
⁴ Na podstawie kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG z 2002 roku dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej^10
5 Na podstawie zrewidowanych (2008) kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej²

Tabela 1. Wyniki testów LFD próbek BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową z prawdopodobną IPA oraz od pacjentów kontrolnych z AML (brak dowodów na infekcję), a także diagnoza infekcji według EORTC/MSG.

Dyskusja

Ostateczną identyfikację IPA można przeprowadzić wyłącznie poprzez wyizolowanie czynnika etiologicznego z próbek biopsyjnych, jednak pobranie odpowiednich próbek jest często niemożliwe u pacjentów w stanie ciężkim, a Aspergillus rzadko udaje się wyizolować z krwi. Mimo znaczącego postępu w wykorzystaniu tomografii komputerowej klatki piersiowej w diagnostyce IPA, cechy sugerujące płucną postać IPA, takie jak objaw „halo” lub „półksiężyca powietrznego”, są albo przejściowe, albo mogą wynikać z artefaktów oddechowych lub innych infekcji grzybiczych^11,12. Dlatego dane te uzupełnia się technikami serologicznymi, których celem jest identyfikacja cząsteczek sygnaturowych (GM i β-glukanu) grzybów krążących w surowicy pacjenta lub obecnych w płycie z BAL, plwocinie bądź próbkach moczu¹³. Chociaż testy te wykazują satysfakcjonującą czułość, brakuje im wystarczającej swoistości lub są podatne na zakłócenia w określonych warunkach^1,6.

Przedstawiony tutaj test LFD do wykrywania IPA umożliwia diagnostykę IPA w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-care) i wykorzystuje technologię stosowaną dotychczas w testach do wykrywania wirusów, bakterii, pasożytów i toksyn^14-19, a przede wszystkim w domowych testach ciążowych, wprowadzonych po raz pierwszy przez Unipath w 1988 roku. W opisanym tutaj teście LFD na Aspergillus, swoiste dla Aspergillus MAb JF5 jest unieruchomione w strefie wychwytu (linia testowa) na porowatej membranie nitrocelulozowej. Jako kontrolę wewnętrzną (linia kontrolna) służy unieruchomiona na membranie w osobnej strefie przeciwciała przeciwko immunoglobulinom mysim. Po dodaniu surowicy lub płynu z BAL do otworu wlotowego, koniugat MAb JF5 ze złotem koloidalnym znajdujący się w podkładce uwalniającej wiąże się z docelowym antygenem, a kompleks ten przemieszcza się następnie wzdłuż porowatej membrany dzięki działaniu kapilarnemu. MAb JF5 unieruchomione w strefie wychwytu wiąże się z kompleksem JF5-złoto koloidalne-antygen, co skutkuje powstaniem czerwonej linii testowej. Każdy niewiązany koniugat JF5-złoto koloidalne wiąże się z kontrolą wewnętrzną, co wskazuje na prawidłowy przebieg analizy. Przejawia się to powstaniem czerwonej linii kontrolnej.

Test jest szybki, jego wykonanie zajmuje tylko 15 minut, jest tani w porównaniu do testów surowicy i BAL opartych na wykrywaniu GM i β-glukanu oraz nie wymaga drogiego sprzętu ani rozbudowanej infrastruktury laboratoryjnej. Co więcej, MAb JF5 nie wykazuje reakcji krzyżowej z lekami ani zanieczyszczeniami, które w testach GM i β-glukanu powodują reakcje fałszywie dodatnie^1,4,6. Dodatkową istotną zaletą w stosunku do obecnych testów diagnostycznych jest zdolność LFD do wykrywania aktywności wskazującej na inwazyjny wzrost gatunków Aspergillus.

Krytycznym etapem procedury LFD jest konieczność odczytania wyników 15 min po naniesieniu próbki surowicy lub BAL na urządzenie. Test nie powinien być pozostawiony na dłużej niż 15 min przed zapisaniem wyników, ponieważ może to wpłynąć na interpretację rezultatu. Słaba reakcja nie zostanie wzmocniona poprzez wydłużenie okresu inkubacji. Stwierdzono, że obróbka termiczna surowicy z modeli zwierzęcych infekcji poprawia czułość analizy. Ograniczeniem testu jest jego charakter jakościowy oraz fakt, że opiera się on na subiektywnej ocenie dodatniego wyniku przez operatora. Intensywność linii testowej różni się w zależności od zawartości antygenu w próbkach surowicy i BAL (Rysunek 1). Niemniej jednak każda dodatnia reakcja (ustalona poprzez porównanie z znanymi próbkami ujemnymi) wskazuje na obecność antygenu Aspergillus, a tym samym na infekcję. Aby ograniczyć subiektywizm analiz LFD, dostępne są przenośne urządzenia, które umożliwiają kwantyfikację intensywności linii testowych LFD oraz ustalenie wartości progowych dla detekcji antygenu²⁰.

Przyszłe kierunki rozwoju LFD obejmują jego komercjalizację oraz opracowanie multipleksowego LFD, który umożliwi jednoczesne wykrywanie innych inwazyjnych patogenów grzybiczych przy użyciu wysoce specyficznych MAbs³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aspergillus LFD	University of Exeter		Dostępne od autora korespondencyjnego na zapytanie
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Płodowa surowica cielęca	Biosera	S9100	Do przygotowania TCM można użyć innych źródeł płodowej surowicy cielęcej
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1