Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Podsumowanie

Przedstawiono szybki i dokładny test typu point-of-care w kierunku inwazyjnej aspergilozy płucnej. Wykorzystuje on technologię przepływu bocznego z zastosowaniem specyficznego przeciwciała monoklonalnego, które wiąże antygen Aspergillus wydzielany podczas infekcji płucnych. Analiza jest kompatybilna z surowicą oraz płuczynami z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i stanowi nowy test pomocniczy w diagnostyce choroby.

Streszczenie

Inwazyjna aspergiloza płucna (IPA) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z nowotworami hematologicznymi oraz u biorców przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych¹. Wykrywanie IPA stanowi ogromne wyzwanie diagnostyczne i wobec braku „złotego standardu” opiera się na kombinacji danych klinicznych oraz, w miarę możliwości, wyników mikrobiologii i histopatologii. Rozpoznanie IPA musi być zgodne z konsensusem Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Grupy Badawczej Mykologii Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (EORTC/MSG), który definiuje inwazyjne grzybice jako „potwierdzone”, „prawdopodobne” i „możliwe”². Obecnie żadne testy oparte na kwasach nukleinowych nie zostały zewnętrznie zwalidowane do wykrywania IPA, dlatego reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) nie jest uwzględniona w aktualnych kryteriach diagnostycznych EORTC/MSG.

Identyfikacja Aspergillus w skrawkach histologicznych jest problematyczna ze względu na podobieństwo morfologii strzępek do innych inwazyjnych patogenów grzybiczych³, a potwierdzona identyfikacja wymaga wyizolowania czynnika etiologicznego w czystej kulturze. Metody oparte na hodowli zależą od dostępności próbek biopsyjnych, które jednak nie zawsze są możliwe do pobrania u ciężko chorych pacjentów, a w przypadku ich pozyskania nie zawsze dostarczają żywotnych propaguli do hodowli.

Ważną cechą w patogenezie Aspergillus jest angioinwazja, cecha ta stwarza możliwości immunologicznego śledzenia grzyba za pomocą testów wykrywających charakterystyczne cząsteczki sygnatur antygenowych w surowicy i płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Doprowadziło to do opracowania enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego Platelia (GM-EIA), który wykrywa galaktomannan Aspergillus, oraz testu „pan-grzybiczego” (test Fungitell), który wykrywa konserwowany składnik ściany komórkowej grzybów (1 →3)-β-D-glukan, jednak nie w przypadku Mucorales, których ściany komórkowe są pozbawione tego składnika^1,4. Kwestie związane z dokładnością tych testów^1,4-6 doprowadziły do niedawnego opracowania testów nowej generacji opartych na przeciwciałach monoklonalnych (MAb), które wykrywają markery zastępcze infekcji^1,5.

Thornton⁵ opisał niedawno wytworzenie swoistego dla Aspergillus przeciwciała monoklonalnego (MAb JF5) z wykorzystaniem technologii hybridoma oraz jego zastosowanie w opracowaniu immunochromatograficznego testu przepływu bocznego (LFD) do diagnostyki przy łóżku pacjenta (POC) w przypadku inwazyjnej aspergilozy płuc (IPA). Główną zaletą testu LFD jest zdolność do wykrywania aktywności zakażenia, ponieważ MAb JF5 wiąże się z zewnątrzkomórkowym antygenem glikoproteinowym, który jest wydzielany wyłącznie podczas aktywnego wzrostu grzyba⁵. Jest to istotna kwestia przy stosowaniu płynów, takich jak płyn z rozszerzonego pobierania z oskrzeli (BAL) do diagnostyki IPA, ponieważ zarodniki Aspergillus są powszechnym składnikiem wdychanego powietrza. Użyteczność urządzenia w diagnostyce IPA została wykazana z wykorzystaniem zwierzęcego modelu zakażenia, w którym test LFD wykazał wyższą czułość i swoistość w porównaniu do testów Platelia GM oraz Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan⁷.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą procedurę LFD służącą do wykrywania antygenu Aspergillus w ludzkiej surowicy oraz płynach z BAL. Szybkość i dokładność tej metody stanowią nowatorskie, pomocnicze badanie w punkcie opieki (point-of-care), umożliwiające diagnostykę IPA u pacjentów z nowotworami hematologicznymi.

Protokół

1. Pobieranie, przechowywanie i przygotowanie surowicy oraz płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

1. Pozyskać surowicę z nieprzetworzonych próbek krwi, pozwalając krwi krzepnąć w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać surowicę w formie aliquotów w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Płyny z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) również należy przechowywać w formie aliquotów w temperaturze -20 °C. Uwaga: Przechowywanie surowicy i BAL w formie aliquotów ogranicza możliwość degradacji docelowego antygenu spowodowaną wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem próbek podczas powtarzanych testów.
2. Rozmrozić próbki, dokładnie wymieszać próbki surowicy i BAL za pomocą wortexa, a następnie wirować przez 1 min w prędkości 14,000 rpm.
3. W przypadku rutynowego badania próbek ludzkiej surowicy, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 (v/v) pożywką do hodowli tkankowych (TCM). TCM składa się z pożywki RPMI-1640, 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 1% (v/v) roztworu L-glutaminy 200mM oraz azotku sodu (0,02% w/v) jako konserwantu. Pożywkę przygotowuje się z wyprzedzeniem i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Nanieść 100 μl rozcieńczonej surowicy na test LFD.
4. W przypadku ludzkich płynów BAL oraz płynów BAL z modeli zwierzęcych, nanieść 100 μl nierozcieńczonej próbki na test LFD, bez wstępnej obróbki.
5. W przypadku surowicy z modeli zwierzęcych, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 (v/v) solą fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającą 4% (w/v) EDTA, podgrzewać przez 3 min w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia, wirować przez 5 min w prędkości 14,000 rpm, a następnie nanieść 100 μl nierozcieńczonego supernatantu na urządzenie LFD.

2. Naniesienie surowicy i BAL na urządzenie do analizy przepływu bocznego

1. Przechowywać testy przepływu bocznego w temperaturze pokojowej (23 °C). W tej temperaturze urządzenia są stabilne przez 12 miesięcy. Wyjąć urządzenia z opakowań i umieścić na płaskiej powierzchni.
2. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety nanieść 100 μl wstępnie opracowanego serum lub nieprzetworzonej próbki BAL do otworu wprowadzeniowego urządzenia.
3. Pozostawić test do przebiegu przez 15 min w temperaturze pokojowej, po czym należy zapisać wyniki testów. Uwaga: W ciągu kilku sekund będzie widoczna migracja płynu w kierunku membrany nitrocelulozowej w oknie obserwacyjnym na drodze kapilarnej.

3. Rejestracja i interpretacja wyników LFD

1. LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej (oznaczonej literą C na plastikowej obudowie) oraz linii testowej (oznaczonej literą T). Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu Aspergillus w próbce surowicy lub płynu z BAL. Świadczy to o prawidłowym przebiegu testu.
2. Jeśli antygen Aspergillus jest obecny w próbce surowicy lub płynu z BAL, linia testowa pojawi się w ciągu 15min od aplikacji próbki. Ponieważ intensywność linii testowej jest proporcjonalna do ilości antygenu Aspergillus obecnego w próbce, linia testowa może wystąpić jako słabo dodatnia (+), umiarkowanie dodatnia (++) lub silnie dodatnia (+++). Niemniej jednak każda dodatnia linia testowa, niezależnie od intensywności, wskazuje na obecność antygenu Aspergillus w próbce. W przypadku braku antygenu Aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostaje zapisany jako ujemny (-).

4. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne przykłady wyników LFD ujemnych, słabo dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnie dodatnich dla próbek BAL i surowicy przedstawiono na Rysunku 1.

Wyniki testów LFD dodatnich pod kątem antygenu (słabych i silnych) lub testów LFD ujemnych z wykorzystaniem płynu z BAL pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi EORTC/MSG przedstawiono w Tabeli 1. W tabeli tej ujęto odpowiadające im dane kliniczne i mykologiczne (galaktomannan i posiew) oraz wyniki specyficznego testu PCR na Aspergillus opracowanego w St. Bartholomews Hospital⁸ dla każdego pacjenta. Rozpoznanie choroby oparto na czynnikach gospodarza (neutropenia, przedłużone stosowanie kortykosteroidów, leczenie innymi uznanymi immunosupresantami limfocytów T), kryteriach klinicznych oraz dodatnim wyniku GM dla BAL (zdefiniowanym tutaj jako wartość indeksu GM > 0,8). Zgodnie z wytycznymi EORTC/MSG z 2002 roku¹⁰, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano „prawdopodobną” (possible) IA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych (2008) wytycznych EORTC/MSG², same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na „prawdopodobną” (possible) inwazyjną infekcję grzybiczą, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio dowody pomocnicze z danych klinicznych i mykologii. U pacjenta 6 zdiagnozowano „wysoce prawdopodobną” (probable) IA zgodnie z wytycznymi z 2002 i 2008 roku ze względu na czynniki gospodarza, główne i poboczne cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM. Należy zauważyć, że choć testy LFD ani PCR nie są obecnie zawarte w wytycznych EORTC/MSG, istnieje silna zgodność między tymi dwoma testami a komercyjnym testem na galaktomannan, co wskazuje na obecność antygenu i kwasu nukleinowego Aspergillus w próbkach BAL pacjentów 6 i 12. Dodatkowe wyniki badań wykazujące skuteczność testów LFD i PCR w diagnozowaniu IPA można znaleźć w pracy Johnson et al⁸.

Rycina 1. Wyniki negatywne (tylko linia kontrolna) i pozytywne (linia kontrolna i testowa) testów LFD z wykorzystaniem surowicy i BAL. Intensywność reakcji linii testowej jest proporcjonalna do stężenia docelowego antygenu w próbkach surowicy i BAL. Reakcje zazwyczaj wahają się od słabych (+) przez umiarkowane (++) do silnych (+++). Bez względu na intensywność linii testowej, wszystkie trzy pozytywne reakcje w surowicy wskazywałyby na inwazyjną aspergilozę płuc ze względu na obecność krążącego antygenu Aspergillus w krwiobiegu. Pozytywne reakcje w BAL (słabe, umiarkowane lub silne) wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.

Nr pacjenta	Informacje o pacjencie	Kryteria kliniczne1	Posiew BAL2	Wskaźnik GM EIA3	EORTC / MSG (2002)4	EORTC / MSG (2008)5	Wynik PCR Aspergillus	Wynik LFD
6	-	Główne oznaki w TK (guzek i objaw halo) oraz jedno kryterium poboczne	Ujemny	0,9 (dodatni)	Prawdopodobne	Prawdopodobne	Dodatni	Słabo dodatni (+)
12	Domniemana wcześniejsza infekcja grzybicza	Brak głównych, jedno poboczne	Candida glabrata	6,43 (silnie dodatni)	Możliwe	Brak	Dodatni	Silnie dodatni (+++)
13	Koagulazo-ujemne Staphylococcus oraz E. coli we krwi	Brak głównych, dwa poboczne	Ujemny	0,25 (ujemny)	Możliwe	Brak	Ujemny	Ujemny (-)
16	Infekcja klatki piersiowej	3 kryteria poboczne, w tym nowy naciek oraz wysięk opłucnowy	Ujemny	0,16 (ujemny)	Możliwe	Brak	Ujemny	Ujemny (-)

¹ Guzki lub halo w badaniu tomografii komputerowej sugerują infekcję grzybiczą
² Obecność Candida glabrata w płynie z BAL uznaje się za zanieczyszczenie, ponieważ jest to drugi najczęstszy drożdżak izolowany jako element prawidłowej flory człowieka^9
3 Wskaźnik >0,8 w teście GM EIA z płynu BAL wskazuje na zakażenie Aspergillus
⁴ Na podstawie kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG z 2002 roku dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej^10
5 Na podstawie zaktualizowanych (2008) kryteriów diagnostycznych EORTC/MSG dla „możliwej”, „prawdopodobnej” lub „potwierdzonej” inwazyjnej choroby grzybiczej²

Tabela 1. Wyniki testów LFD próbek BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową z prawdopodobną IPA oraz od kontrolnych pacjentów z AML (brak dowodów na zakażenie), a także diagnoza zakażenia według EORTC/MSG.

Dyskusja

Ostateczną identyfikację IPA można przeprowadzić wyłącznie poprzez wyizolowanie czynnika etiologicznego z próbek biopsyjnych, jednak pobranie odpowiednich próbek jest często niemożliwe u pacjentów w stanie ciężkim, a Aspergillus rzadko udaje się wyizolować z krwi. Mimo znaczącego postępu w wykorzystaniu tomografii komputerowej klatki piersiowej w diagnostyce IPA, cechy sugerujące płucną postać IPA, takie jak objaw „halo” lub „półksiężyca powietrznego”, są albo przejściowe, albo mogą wynikać z artefaktów oddechowych lub innych infekcji grzybiczych^11,12. Dlatego dane te uzupełnia się technikami serologicznymi, których celem jest identyfikacja cząsteczek sygnaturowych (GM i β-glukanu) grzybów krążących w surowicy pacjenta lub obecnych w płycie z BAL, plwocinie bądź próbkach moczu¹³. Chociaż testy te wykazują satysfakcjonującą czułość, brakuje im wystarczającej swoistości lub są podatne na zakłócenia w określonych warunkach^1,6.

Przedstawiony tutaj test LFD do wykrywania IPA umożliwia diagnostykę IPA w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-care) i wykorzystuje technologię stosowaną dotychczas w testach do wykrywania wirusów, bakterii, pasożytów i toksyn^14-19, a przede wszystkim w domowych testach ciążowych, wprowadzonych po raz pierwszy przez Unipath w 1988 roku. W opisanym tutaj teście LFD na Aspergillus, swoiste dla Aspergillus MAb JF5 jest unieruchomione w strefie wychwytu (linia testowa) na porowatej membranie nitrocelulozowej. Jako kontrolę wewnętrzną (linia kontrolna) służy unieruchomiona na membranie w osobnej strefie przeciwciała przeciwko immunoglobulinom mysim. Po dodaniu surowicy lub płynu z BAL do otworu wlotowego, koniugat MAb JF5 ze złotem koloidalnym znajdujący się w podkładce uwalniającej wiąże się z docelowym antygenem, a kompleks ten przemieszcza się następnie wzdłuż porowatej membrany dzięki działaniu kapilarnemu. MAb JF5 unieruchomione w strefie wychwytu wiąże się z kompleksem JF5-złoto koloidalne-antygen, co skutkuje powstaniem czerwonej linii testowej. Każdy niewiązany koniugat JF5-złoto koloidalne wiąże się z kontrolą wewnętrzną, co wskazuje na prawidłowy przebieg analizy. Przejawia się to powstaniem czerwonej linii kontrolnej.

Test jest szybki, jego wykonanie zajmuje tylko 15 minut, jest tani w porównaniu do testów surowicy i BAL opartych na wykrywaniu GM i β-glukanu oraz nie wymaga drogiego sprzętu ani rozbudowanej infrastruktury laboratoryjnej. Co więcej, MAb JF5 nie wykazuje reakcji krzyżowej z lekami ani zanieczyszczeniami, które w testach GM i β-glukanu powodują reakcje fałszywie dodatnie^1,4,6. Dodatkową istotną zaletą w stosunku do obecnych testów diagnostycznych jest zdolność LFD do wykrywania aktywności wskazującej na inwazyjny wzrost gatunków Aspergillus.

Krytycznym etapem procedury LFD jest konieczność odczytania wyników 15 min po naniesieniu próbki surowicy lub BAL na urządzenie. Test nie powinien być pozostawiony na dłużej niż 15 min przed zapisaniem wyników, ponieważ może to wpłynąć na interpretację rezultatu. Słaba reakcja nie zostanie wzmocniona poprzez wydłużenie okresu inkubacji. Stwierdzono, że obróbka termiczna surowicy z modeli zwierzęcych infekcji poprawia czułość analizy. Ograniczeniem testu jest jego charakter jakościowy oraz fakt, że opiera się on na subiektywnej ocenie dodatniego wyniku przez operatora. Intensywność linii testowej różni się w zależności od zawartości antygenu w próbkach surowicy i BAL (Rysunek 1). Niemniej jednak każda dodatnia reakcja (ustalona poprzez porównanie z znanymi próbkami ujemnymi) wskazuje na obecność antygenu Aspergillus, a tym samym na infekcję. Aby ograniczyć subiektywizm analiz LFD, dostępne są przenośne urządzenia, które umożliwiają kwantyfikację intensywności linii testowych LFD oraz ustalenie wartości progowych dla detekcji antygenu²⁰.

Przyszłe kierunki rozwoju LFD obejmują jego komercjalizację oraz opracowanie multipleksowego LFD, który umożliwi jednoczesne wykrywanie innych inwazyjnych patogenów grzybiczych przy użyciu wysoce specyficznych MAbs³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aspergillus LFD	University of Exeter		Dostępne od autora korespondencyjnego na zapytanie
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Płodowa surowica cielęca	Biosera	S9100	Do przygotowania TCM można użyć innych źródeł płodowej surowicy cielęcej
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1