Metody samodzielnego podawania dożylnego w modelu mysim

Summary

Paradygmat samodzielnego podawania dożylnego (IVSA) jest uważany za złoty standard w badaniu wzmacniających właściwości leków stosowanych u gryzoni. Niniejszy manuskrypt przedstawia procedury eksperymentalne i techniki chirurgiczne niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych IVSA. W szczególności zwrócono uwagę na skrupulatne wszczepianie i konserwację cewnika.

Abstract

Modele zwierzęce zostały opracowane do badania wzmacniającego działania leków, w tym paradygmatu samodzielnego podawania dożylnego (IVSA). Korzyści płynące z zastosowania paradygmatu IVSA do badania wzmacniających właściwości narkotyków nadużywanych, takich jak kokaina, obejmują fakt, że lek jest podawany samodzielnie, a nie przez eksperymentatora, można zmienić harmonogram wzmacniania i można uzyskać dokładny pomiar ilości spożywanego narkotyku, a także czas i wzór wstrzyknięć dożylnych. Co więcej, dożylna droga podania pozwala uniknąć potencjalnych zakłóceń związanych z metabolizmem pierwszego przejścia lub smakiem i powoduje szybki wzrost poziomu leków we krwi i mózgu. Jak pokazano w tym filmie, samodzielne podawanie cewnika można uzyskać bez wcześniejszego ograniczenia żywieniowego lub wcześniejszego szkolenia w zakresie leków po starannym umieszczeniu cewnika podczas operacji oraz skrupulatnym codziennym płukaniu i konserwacji cewnika. Procedury eksperymentalne przedstawione w tym artykule obejmują opis metod trzymania zwierząt i aklimatyzacji, trening instrumentalny z użyciem roztworów słodzonego mleka oraz chirurgię implantacji cewnika.

Protocol

1. Pomieszczenia dla zwierząt i procedury aklimatyzacyjne

1. Samce i samice myszy CD-1 są trzymane z rodzeństwem z miotu tej samej płci, do 5 zwierząt w klatce, w standardowych plastikowych klatkach zawierających ściółkę z chipami beta i podkładki do gniazd, z pokrywami z siatki drucianej na butelki z wodą i jedzeniem. Standardowa karma dla myszy i woda są dostępne ad libitum w klatkach domowych przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Myszy są utrzymywane w odwróconym harmonogramie światło-ciemność (światła od 22:00 do 10:00).
3. Myszy mogą zaaklimatyzować się w pomieszczeniach testowych IVSA na tydzień przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.

2. Trening operacyjny

1. Wszystkie procedury behawioralne, w tym trening słodzonego mleka i sesje samodzielnego podawania leków dożylnie, są przeprowadzane przy użyciu komór operacyjnych o wymiarach 15,9 x 14 x 12,7 cm, wyposażonych w 2 ultraczułe dźwignie myszy, kubki czerpakowe, lampki stymulacyjne i mikrolitrowe pompy strzykawkowe (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA). Komory są połączone z komputerem za pomocą interfejsu Med Associates Smart CR i oprogramowania Med-PC w celu zaprogramowania harmonogramu zbrojenia i zbierania danych.
2. Myszy naiwne są przyzwyczajane do komór operacyjnych i szkolone do naciskania dźwigni za pomocą nagrody w postaci słodzonego mleka (0,1 ml) umieszczonej w kubku do czerpania. Trening Operant Milk odbywa się w 1-godzinnych sesjach przez 5-7 dni. Wykonanie harmonogramu o stałym przełożeniu (FR) na aktywnej dźwigni skutkowało wyświetleniem miseczki czerpaka i podświetleniem światła stymulacyjnego. Słodzony roztwór mleka składał się z sacharozy (10 mg/ml, odczynnik ACS, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) dodanej do pełnego mleka (3,25% zawartości tłuszczu). Trening instrumentalny z roztworem słodzonego mleka lub płynnym wzmacniaczem pokarmu jest powszechną techniką stosowaną w celu ułatwienia odpowiedzi instrumentalnej u myszy ^1,2.

3. Przygotowanie sprzętu do użycia podczas operacji

Wymagany sprzęt - igły o rozmiarze 20, 23 i 26, młynek, strzykawki o pojemności 1 cm3, rurki tygon, lutownica, heparyna, antybiotyki i środki przeciwbólowe.

1. Przygotuj igłę, aby poprowadzić wprowadzenie cewnika do żyły szyjnej, goląc igłę o rozmiarze 20. Trzon igły jest golony za pomocą szlifierki, aby utworzyć kanał w igle, który prowadzi rurkę cewnika do żyły. Kanał igły należy dokładnie sprawdzić, czy nie ma żadnych metalowych zanieczyszczeń, które mogły się osadzać. Wszelkie przeszkody w kanale należy zeskrobać za pomocą kleszczy z cienką końcówką.
2. Przystosować dwie strzykawki o pojemności 1 cm3 do użycia do przepłukiwania i sprawdzania cewnika. Przygotuj dwie strzykawki, biorąc 12-centymetrowe kawałki rurki Tygon i przymocuj je na jednym końcu do igieł o rozmiarze 26 przymocowanych do strzykawek o pojemności 1 cm3, a następnie rozciągając drugie końce rurki na igłach o rozmiarze 23. Jedną strzykawkę należy napełnić 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a drugą roztworem tikarcyliny heparynizowanej (33 mg tikarcyliny i 0,3 mg heparyny na 10 ml jałowej soli fizjologicznej).
3. Przygotuj nasadki kaniuli cewnika. Rurkę Tygon rozciąga się na igłę o rozmiarze 23 i odcina 1 cm od skosu. Rozpuść otwarty koniec rurki, aby uzyskać grube uszczelnienie. Rurkę należy stopić tak, aby cała nasadka kaniuli była wystarczająco długa, aby zmieściła się na kaniuli cewnika, przy czym uszczelniony koniec ściśle przylegał do końca kaniuli. Należy pamiętać, że jeśli nasadka jest zbyt długa, istnieje ryzyko, że zostanie wygięta, a następnie przebita podczas zakładania przykręcanych osłon cewnika. Dlatego zaleca się staranne przygotowanie nasadek cewnika, aby zapewnić dobre dopasowanie do kaniuli.
4. Przygotuj wymagane rozwiązania. Wszystkie odczynniki kupowane są w firmie Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis, MO, USA).
   1. Heparynizowany roztwór tikarcyliny do płukania cewnika - Rozpuścić 0,33 g tikarcyliny (sól disodowa) i 0,003 g heparyny w 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Codziennie przez cewnik przepłukuje się 0,03 ml roztworu. Roztwór antybiotyku podaje się w celu zapobiegania rozwojowi zakrzepów krwi i infekcji.
   2. Amikicyna (antybiotyk) do wstrzykiwań podskórnych - Pojedyncze wstrzyknięcie podskórne podaje się po zabiegu chirurgicznym w dawce 10 mg/kg mc. w celu zapobiegania zakażeniom pooperacyjnym.
   3. Ketoprofen (środek przeciwbólowy) do wstrzykiwań podskórnych - Pojedyncze wstrzyknięcie podskórne podaje się po zabiegu chirurgicznym w dawce 5 mg/kg w celu opanowania bólu pooperacyjnego.

4. Chirurgia implantacji cewnika

Wymagany sprzęt i odczynniki: Izofluran, sterylna sól fizjologiczna, alkohol (70%), strzykawki o pojemności 1 i 3 cm3 wypełnione sterylnym solą fizjologiczną, strzykawki o pojemności 1 cm3, roztwory antybiotykowe i przeciwbólowe przygotowane w sekcji 3 powyżej, cewniki mysie (CamCaths, Cambridgeshire, Wielka Brytania), osłonki cewników (kryształowe nakrętki od HRS Scientific, Montreal, Quebec), lubrykant do oczu, 4 cm plastikowy pręt do podnoszenia żyły (może być wykonany z plastikowej końcówki higienicznej), polisporyna, sterylne waciki i gaza, kleszcze zakrzywione i proste, zaciski tętnicze, cienkie nożyczki.

1. Przy użyciu standardowych technik aseptycznych stół operacyjny, narzędzia chirurgiczne i cewniki są sterylizowane przed operacją. Właściwe techniki sterylizacji obejmują autoklawowanie parowe narzędzi chirurgicznych i cewników zakupionych w CamCaths. Sterylizacja kulkami szklanymi może być również stosowana na końcówkach narzędzi chirurgicznych. Sterylizacja tlenkiem etylenu może być stosowana w przypadku delikatniejszych cewników lub materiałów, które mogą się stopić. Bardziej szczegółowy opis technik aseptyki chirurgicznej u gryzoni znajduje się w załączonych pozycjach ^1,2. Ustawienie ławki, instrumentów i stożka nosowego do znieczulenia podtrzymującego jest zilustrowane na zdjęciu.
2. Myszy są znieczulane gazem izofluranowym i utrzymywane w znieczuleniu za pomocą rurki oddechowej pod systemem oczyszczania. Lubrykant do oczu (Tears Naturale P.M) nakłada się na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu. Na grzbiecie zwierzęcia i wokół szyi goli się odpowiedni margines chirurgiczny. Przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć pola operacyjne są ograniczane za pomocą sterylnych obłożeń.
3. W celu przygotowania cewnika do wprowadzenia do prawego przedsionka serca, nadmiar rurki cewnika odcina się 1,2 cm od bańki cewnika. Jest to optymalna długość ustalona dla dorosłych myszy CD-1, w wieku około 8 tygodni, 20-25 gramów masy ciała. Długość rurki cewnika może wymagać nieznacznego dostosowania (metodą prób i błędów), w zależności od szczepu, rozmiaru i wieku myszy. Przed wprowadzeniem strzykawki zawierającej sterylną sól fizjologiczną (sekcja 3.2) podłącza się do kaniuli cewnika, a cewnik przepłukuje się i sprawdza pod kątem wycieków. Strzykawkę należy trzymać podłączoną do cewnika przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego. Zostanie on użyty do przepłukania cewnika i pobrania krwi z powrotem w kroku 4.7.
4. Po sterylizacji 70% alkoholem wykonuje się nacięcie środkowe łopatki o długości 2 cm, zaczynając w połowie pleców i kończąc tuż pod szyją, aby pomieścić podstawę cewnika. Tkankę łączną należy rozsunąć kleszczami, aby zrobić miejsce na podstawę cewnika pod skórą.
5. Układając zwierzę na grzbiecie, wykonuje się drugie płytkie nacięcie po przekątnej 1 - 2 cm od prawego obojczyka idącego w górę do szczęki zwierzęcia, po przetarciu tego obszaru 70% alkoholem. Żyła szyjna znajduje się powierzchownie pod skórą szyi. W ramach przygotowań do wprowadzenia cewnika, rurka od podstawy cewnika jest przeciągana przez nacięcie z tyłu i zbliżana do żyły szyjnej, przechodząc przez rurkę pod skórą tuż nad prawym ramieniem. Koniec rurki cewnika jest następnie mocowany do zacisku tętniczego i umieszczany po stronie zwierzęcia, aby utrzymać go na miejscu.
6. Prawa żyła szyjna jest zlokalizowana poprzez delikatne odsunięcie powierzchownej tkanki łącznej i tłuszczowej od nacięcia wokół szyi zwierzęcia. Tkanka łączna wokół żyły jest rozbijana za pomocą zakrzywionych kleszczy, a następnie żyła jest podnoszona za pomocą sterylnego plastikowego pręta. Luźne otwarte węzły szwów są wykonywane wokół każdego końca żyły, a rurka cewnika jest przewlekana przez górny węzeł i zapętlana na nitce szwu, aby spoczywała niezaciśnięta na prawym ramieniu.
7. Przed wprowadzeniem zwilż zarówno igłę do wprowadzania 20 rozmiarów, jak i żyłę sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby zmniejszyć tarcie. Igła jest trzymana równolegle do żyły i delikatnie wprowadzana w pobliżu dna uniesionej żyły (Uwaga: około 0,5 cm końcówki igły musi wejść do żyły). Za pomocą kleszczy wsuń rurkę cewnika w dół trzonu igły do żyły. Opór wskazywałby, że rurka znajduje się w tkance łącznej, a nie w żyle. Przepchnij 0,03 ml soli fizjologicznej przez żyłę, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Nieszczelności wskazywałyby, że żyła może zostać przebita lub że umieszczenie rurki cewnika wymaga regulacji.
   nuta: Aby sprawdzić, czy rurka znajduje się w żyle, spróbuj pobrać trochę krwi za pomocą dołączonej strzykawki z solą fizjologiczną. Jeśli nie można natychmiast pobrać krwi, żyła lub ściana serca może zasłaniać końcówkę cewnika lub żyła nie została przebita; Wyreguluj rurkę i spróbuj ponownie. Ponowne wprowadzenie igły może być konieczne, jeśli nadal nie można pobrać krwi.
   
8. Aby zamocować cewnik na miejscu, dociśnij gruszkę cewnika do punktu wprowadzenia i wyjmij igłę. Zawiąż dolny węzeł, a następnie pociągnij cewnik równo z prętem przed zawiązaniem drugiego węzła tuż nad bańką. Przetestuj ponownie, aby sprawdzić, czy można pobrać krew i w razie potrzeby lekko poluzuj węzły. Wsuń rurkę cewnika pod skórę i zszyj brzuszne nacięcie wokół szyi zwierzęcia. Nałóż Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką lub innej maści z antybiotykiem, najlepiej zawierającej trochę środka przeciwbólowego do zamkniętego nacięcia.
9. Trzymając zwierzę na brzuchu, umieść podstawę cewnika pod skórą pleców w przygotowanym nacięciu. Upewnij się, że nadmiar rurki jest minimalnie zapętlony i dobrze ukryty pod podstawą cewnika, aby zminimalizować ryzyko przeżucia i przekłucia go przez zwierzę. Zszyj nacięcie po obu stronach podstawy cewnika i nałóż Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
10. Przepłukać cewnik 0,03 ml roztworu tikarcyliny z heparynizacją za pomocą strzykawki z przymocowanym do niej rurką (punkt 3.2). Zakryj kaniulę plastikową nasadką kaniuli i przykręć białą osłonę cewnika. U niektórych myszy, które są świeżo po operacji, krew może wyciekać z cewnika przed zamknięciem kaniuli. Ważne jest, aby ponownie przepłukać zwierzę i szybko wymienić nasadkę kaniuli, zanim krew będzie miała szansę wypłynąć. Zwierzęta muszą być codziennie płukane w celu utrzymania drożności cewnika.
11. Po wytarciu miejsca wstrzyknięcia między tylnymi nogami zwierzęcia 70% etanolem, należy wstrzyknąć podskórnie przeciwbólowy ketoprofen w dawce 5 mg/kg z jednej strony, a antybiotyk amikicynę w dawce 10 mg/kg mc. z drugiej strony.
12. Po odstawieniu znieczulenia zwierzęta mogą dojść do siebie w czystej klatce z łatwym dostępem do jedzenia i wody przez 5 do 7 dni. Myszy należy umieścić na noc w ogrzewanej szafce, aby zapobiec hipotermii pooperacyjnej.

5. Testy behawioralne – samodzielne podawanie dożylne

1. Przed badaniem behawioralnym cewniki przepłukuje się 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Myszy są następnie umieszczane w komorach operacyjnych i podłączane do przewodów infuzyjnych i pomp infuzyjnych. Aktywne naciśnięcia dźwigni powodują infuzję leku w ciągu 3,2 sekundy i 18 μl w połączeniu z podświetleniem światła stymulacyjnego. Po każdym naciśnięciu dźwigni następuje 8-sekundowy okres przerwy, podczas którego lampka bodźca pozostaje włączona.
2. Po sesji operacyjnej cewniki myszy są przepłukiwane heparynizowanym roztworem tikarcyliny przed powrotem do klatki domowej.
3. Myszy mogą samodzielnie podawać przez 3 kolejne 2-godzinne sesje po każdej dawce. Dawki zostały przedstawione w kolejności losowej dla każdej myszy, jak pokazano w następnym punkcie.
4. Drożność cewnika jest oceniana codziennie, upewniając się, że zarówno roztwór soli fizjologicznej, jak i antybiotyk mogą być przepłukane przez cewnik. Ponadto można przeprowadzić test na obecność ketaminy/midazolamu zgodnie z opisem w załączonym piśmiennictwie ⁵. Krótko mówiąc, objawy znieczulenia, takie jak unieruchomienie w ciągu 5 sekund od infuzji 0,02-0,03 ml ketaminy (15 mg/ml) lub midazolamu (0,75 mg/ml) midazolamu, są dowodem na istnienie opatentowanego cewnika ⁵.

Results

Rysunek 1. Wzorzec reakcji na samodzielne podawanie leków dożylnie będzie się różnić w zależności od leku, zakresu dawek i zastosowanego szczepu myszy. Przedstawiony rysunek przedstawia dane dotyczące samodzielnego podawania kokainy po udanych operacjach cewnikowania z zastosowaniem procedury opisanej w filmie. Rysunek przedstawia średnią (±SEM) zarobioną infuzję kokainy i średnie (±SEM) spożycie kokainy (mg/kg masy ciała) w zakresie 4 dawek kokainy przedstawionych w losowej kolejności według schematu wzmacniania FR1. Abscissa: dawka leku do samodzielnego spożycia na infuzję. Lewa rzędna: całkowita liczba infuzji uzyskanych podczas 2-godzinnej sesji operacyjnej. Prawa współrzędna: całkowite spożycie kokainy w mg/kg podczas 2-godzinnej sesji testowej. Wszystkie 13 cewników pozostało opatentowanych przez cały czas trwania badania (4 tygodnie). Jednoczynnikowa ANOVA przeprowadzona po podaniu dawki wykazała, że myszy podawały kokainę w sposób zależny od dawki [F (1,12) = 42,8, p<0,05]. Obserwuje się wzrost spożycia kokainy w stosunku do krzywej dawka-odpowiedź [F (3,36) = 29,6, p<0,05] pomimo spadku nacisku dźwigniowego przy wyższych dawkach. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 3 sesji testowych przy każdej dawce kokainy (±SEM) zebranych u myszy CD-1 (n = 13 / dawkę, samce i samice łącznie). Porównania aktywnej (wzmocnionej lekiem) i nieaktywnej dźwigni reagującej na krzywej odpowiedzi na dawkę przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej ANOVA, aby upewnić się, że myszy rozróżniają między dwiema dźwigniami. W przypadku myszy CD1 analiza wykazała preferencję dla aktywnej dźwigni [F (1,12) = 10,255, p<0,05] na całej krzywej dawka-odpowiedź (dane nie pokazane tutaj).

Discussion

Zwierzęce modele nadużywania narkotyków są szczególnie przydatne w zrozumieniu genetycznych podstaw zachowań związanych z narkotykami. Na przykład myszy o różnych profilach genetycznych wykazują dziedziczne różnice w wrażliwości na kokainę ^6-8 i pomagają zidentyfikować potencjalnych kandydatów na geny pośredniczące w obserwowanej zmienności fenotypowej ⁹. Procedury cewnikowania dożylnego opisane w tym artykule zostały wykorzystane ze znacznym powodzeniem do zbadania leku IVSA u różnych szczepów myszy, a także myszy o różnym pochodzeniu genetycznym ¹⁰.

Procedury pokazane w tym filmie podkreślają ważne czynniki, na których należy się skupić podczas i po operacji cewnikowania, aby uzyskać wiarygodne dane dotyczące samodzielnego podawania dożylnego. Po pierwsze, umieszczenie rurki cewnika w prawym przedsionku jest niezbędne, aby zapobiec niewydolności cewnika spowodowanej zakrzepami. Podczas operacji ważne jest, aby upewnić się, że koniec cewnika jest niezakłócony i nie jest zasłonięty ani przez serce, ani przez tkankę żylną. Po drugie, codzienne płukanie cewnika jest wymagane zarówno przed, jak i po sesjach operacyjnych, aby zapobiec zatorom. Wreszcie, kaniula cewnika musi być stale przykryta zarówno nasadkami kaniuli, jak i osłonami kryształów, gdy zwierzęta znajdują się w klatkach domowych, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń. Niewielkie zablokowanie kaniuli cewnika może zostać usunięte za pomocą cienkiej igły o rozmiarze 26, jednak wymagane jest codzienne płukanie roztworem antybiotyku z heparyną, szczególnie w dniach, w których zwierzęta nie są badane na obecność IVSA.

Aby przeprowadzić operację przetrwania zwierząt, niezbędna jest dobra znajomość technik aseptycznych, analgezji i znieczulenia. Chociaż ten film nie zastępuje właściwego szkolenia chirurgicznego, może być wykorzystany jako przewodnik dla badaczy pragnących zdobyć techniki niezbędne dla tego paradygmatu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Sól disodowa	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Butelka 1 gram
Tears Naturale PM (Smar do oczu)	Alcon	N/A	3,5 gramowa tubka Ten lubrykant do oczu można znaleźć w większości aptek. Można użyć dowolnego okulistycznego smaru do oczu.
Kokaina	Medisca Pharmaceutique	0723-06	Butelka 1 gram
Ketamina	Medisca Pharmaceutique	1754-04	Butelka 25 gramów
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	Butelka 1 gram
Heparyna sól sodowa	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Butelka 250 gram
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram butelka
Sól siarczanowa amikicyny	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gramowa butelka
Odczynnik ACS sacharozy	Sigma-Aldrich	S5016-500G	Butelka 500 gramów
Standardowe cewniki dla myszy z miękką siatką	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Specyfikacje przewodów: 26SWG; 0.451; 0,254
Aplikator z nasadką kryształową	HRS Scientific	313CAC	Jest to biała nasadka na cewnik.
Rurki z mikrootworem Tygon	Thomas Scientific	9561S41	Specyfikacja rurki (otwór x średnica zewnętrzna x grubość ścianki w calach): .01 x .03 x .01