Metody dożylnej samopodaży w modelu mysim

Podsumowanie

Paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA) jest uważany za złoty standard w badaniu właściwości wzmacniających substancji psychoaktywnych u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne i techniki chirurgiczne niezbędne do uzyskania wiarygodnych danych IVSA. W szczególności podkreślono znaczenie starannego implantowania i utrzymywania cewników.

Streszczenie

Opracowano modele zwierzęce do badania efektów wzmacniających działania leków, w tym paradygmat dożylnej samopodaży (IVSA). Zalety wykorzystania paradygmatu IVSA do badania właściwości wzmacniających substancji nadużywanych, takich jak kokaina, obejmują fakt, że lek jest podawany samodzielnie przez zwierzę, a nie przez eksperymentatora, możliwość modyfikacji schematu wzmacniania oraz możliwość dokładnego pomiaru ilości spożytego leku, a także czasu i wzorca wstrzykiwań dożylnych. Ponadto dożylna droga podania pozwala uniknąć potencjalnych czynników zakłócających związanych z efektem pierwszego przejścia lub smakiem, a także powoduje szybki wzrost stężenia leku we krwi i mózgu. Jak przedstawiono w tym filmie, dożylną samopodaż można uzyskać bez uprzedniego ograniczenia pokarmowego lub wcześniejszego treningu z lekiem, pod warunkiem starannego umieszczenia cewnika podczas operacji oraz skrupulatnego codziennego płukania i konserwacji cewnika. Procedury eksperymentalne opisane w niniejszej pracy obejmują opis metod utrzymania i aklimatyzacji zwierząt, trening operacyjny z użyciem roztworów słodzonego mleka oraz operację implantacji cewnika.

Protokół

1. Procedury zakwaterowania i aklimatyzacji zwierząt

1. Samce i samice myszy CD-1 są trzymane z rówieśnikami tej samej płci, do 5 zwierząt na klatkę, w standardowych plastikowych klatkach z podścieleniem beta chip i wkładami gniazdowymi nestlet, z drucianymi pokrywami umożliwiającymi zamocowanie butelek z wodą i pokarmu. Standardowa karma dla myszy oraz woda są dostępne ad libitum w klatkach macierzystych przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Myszy są utrzymywane w odwróconym cyklu światło-ciemność (światło zapalone od 22:00 do 10:00).
3. Myszyom pozwolono na aklimatyzację w pomieszczeniach do testów IVSA przez jeden tydzień przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.

2. Trening operacyjny

1. Wszystkie procedury behawioralne, w tym trening z użyciem słodzonego mleka oraz sesje dożylnej samopodaży leku, są przeprowadzane w komorach operantowych o wymiarach 15,9 x 14 x 12,7 cm, wyposażonych w 2 ultrasensytywne dźwignie dla myszy, kubki z dozownikiem (dipper cups), światła stymulujące oraz pompy strzykawkowe mikro-litrowe (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA). Komory są połączone z komputerem za pomocą interfejsu Med Associates Smart CR oraz oprogramowania Med-PC służącego do programowania schematu wzmocnień i zbierania danych.
2. Naiwne myszy są habituowane do komór operantowych i uczone naciskania dźwigni za pomocą nagrody w postaci słodzonego mleka (0,1 ml) podawanego w kubku z dozownikiem. Operantny trening z mlekiem przeprowadzany jest w sesjach trwających 1 h przez 5–7 dni. Wykonanie schematu stałego stosunku (FR) na aktywnej dźwigni skutkowało podaniem kubka z dozownikiem oraz zapaleniem światła stymulującego. Roztwór słodzonego mleka składał się z sacharozy (10 mg/ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc. St-Louis MO, USA) dodanej do pełnotłustego mleka (zawartość tłuszczu 3,25%). Trening operantny z użyciem roztworu słodzonego mleka lub płynnego pokarmu jako wzmocnienia jest powszechną techniką stosowaną w celu ułatwienia reakcji operantnych u myszy ^1,2.

3. Przygotowanie sprzętu do użytku podczas operacji

Wymagany sprzęt - igły o rozmiarach 20, 23 i 26 G, szlifierka, strzykawki 1 cc, rurki Tygon, lutownica, heparyna, antybiotyki i lek przeciwbólowy.

1. Przygotować igłę do prowadzenia cewnika do żyły szyjnej poprzez zeszlifowanie igły o rozmiarze 20 gauge. Trzon igły szlifuje się za pomocą szlifierki w celu utworzenia wewnątrz kanału prowadzącego dren cewnika do żyły. Należy dokładnie sprawdzić kanał igły pod kątem obecności ewentualnych osadów metalicznych. Wszelkie zanieczyszczenia blokujące kanał należy usunąć za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami.
2. Przygotować dwie strzykawki 1-cc do przemywania i sprawdzania drożności cewnika. Przygotować dwie strzykawki, biorąc kawałki rurek Tygon o długości 12 cm i mocując jeden ich koniec do igieł 26 gauge przymocowanych do strzykawek 1 cc, a pozostałe końce rurek naciągając na igły 23 gauge. Jedną strzykawkę należy napełnić 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a drugą roztworem heparynowanym ticarcilliny (33 mg ticarcilliny i 0,3 mg heparyny na 10 ml sterylnej soli fizjologicznej).
3. Przygotować nakładki na kaniulę cewnika. Rurkę Tygon naciąga się na igłę 23 gauge i odcina 1 cm od ścięcia igły. Wolny koniec rurki należy stopić, aby utworzyć grubą uszczelkę. Rurkę należy stopić w taki sposób, aby cała nakładka kaniuli była wystarczająco długa, by zmieścić się na kaniuli cewnika, a zamknięty koniec ściśle przylegał do końca kaniuli. Należy pamiętać, że jeśli nakładka będzie zbyt długa, istnieje ryzyko jej zagięcia, a następnie przebicia podczas nakręcania osłon cewnika. Dlatego zaleca się staranne przygotowanie nakładek cewnika, aby zapewnić ich dobre dopasowanie do kaniuli.
4. Przygotować wymagane roztwory. Wszystkie odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA).
   1. Heparynowany roztwór ticarcilliny do przemywania cewnika – rozpuścić 0,33 g ticarcilliny (soli disodowej) i 0,003 g heparyny w 10 ml sterylnej soli fizjologicznej. Codziennie przez cewnik przepłukuje się 0,03 ml roztworu. Roztwór antybiotyku podaje się w celu zapobiegania powstawaniu zakrzepów krwi i infekcjom.
   2. Amikacyna (antybiotyk) do iniekcji podskórnej – po zabiegu chirurgicznym podaje się jednorazową dawkę podskórnie w dawce 10 mg/kg, aby zapobiec infekcjom pooperacyjnym.
   3. Ketoprofen (środek przeciwbólowy) do iniekcji podskórnej – po zabiegu chirurgicznym podaje się jednorazową dawkę podskórnie w dawce 5 mg/kg w celu łagodzenia bólu pooperacyjnego.

4. Operacja implantacji cewnika

Wymagany sprzęt i odczynniki: izofluran, jałowa sól fizjologiczna, alkohol (70%), strzykawki 1 i 3 cc wypełnione jałową solą fizjologiczną, przystosowane strzykawki 1 cc, roztwory antybiotyków i leków przeciwbólowych przygotowane w sekcji 3 powyżej, kaniule dla myszy (CamCaths, Cambridgeshire, UK), nakładki na kaniule (crystal caps od HRS Scientific, Montreal, Quebec), smar do oczu, 4 cm plastikowy pręcik do uniesienia żyły (można go wykonać z plastikowego patyczka higienicznego), Polysporin, jałowe gaziki i gaza, pęsety zakrzywione i proste, zaciski naczyniowe, precyzyjne nożyczki.

1. Stosując standardowe techniki aseptyczne, przed operacją sterylizuje się stół chirurgiczny, instrumenty chirurgiczne oraz cewniki. Odpowiednie techniki sterylizacji obejmują autoklawowanie parowe dla instrumentów chirurgicznych i cewników zakupionych od CamCaths. W przypadku końcówek instrumentów chirurgicznych można zastosować sterylizację koralikami szklanymi. Sterylizację tlenkiem etylenu można zastosować przy bardziej delikatnych cewnikach lub materiałach narażonych na stopienie. Bardziej szczegółowy opis aseptycznych technik chirurgicznych u gryzoni znajduje się w załączonych referencjach ^1,2. Przygotowanie stołu, instrumentów i stożka nosowego do znieczulenia utrzymującego przedstawiono na zdjęciu.
2. Myszy są znieczulane gazem izofluranem, a znieczulenie jest utrzymywane za pomocą rurki oddechowej w systemie odprowadzania gazów. Do obu oczu aplikuje się lubrykant do oczu (Tears Naturale P.M), aby zapobiec ich wysychaniu podczas procedury. Na grzbiecie zwierzęcia i wokół szyi ogala się odpowiedni margines chirurgiczny. Przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć pola operacyjne zostają odizolowane za pomocą sterylnych obłożenia.
3. Aby przygotować cewnik do wprowadzenia do prawego przedsionka serca, nadmiar rurki cewnika odcina się 1,2 cm od balonika cewnika. Jest to optymalna długość ustalona dla dorosłych myszy CD-1 w wieku około 8 tygodni i masie ciała 20-25 g. Długość rurki cewnika może wymagać niewielkiej korekty (metodą prób i błędów) w zależności od szczepu, wielkości i wieku myszy. Przed wprowadzeniem do kanyli cewnika podłącza się strzykawkę zawierającą sterylną sól fizjologiczną (sekcja 3.2), a następnie cewnik jest przepłukiwany i sprawdzany pod kątem nieszczelności. Strzykawkę tę należy pozostawić podłączoną do cewnika przez cały czas trwania procedury chirurgicznej. Będzie ona służyć do przepłukiwania cewnika i pobierania krwi w kroku 4.7.
4. Po sterylizacji 70% alkoholem wykonuje się nacięcie międzyshapularne o długości 2 cm, zaczynając od połowy grzbietu i kończąc tuż poniżej szyi, aby pomieścić podstawę cewnika. Tkankę łączną należy rozsunąć pęsetą, aby zrobić miejsce na podstawę cewnika pod skórą.
5. Kładąc zwierzę na plecach, po przetarciu obszaru 70% alkoholem, wykonuje się drugie, płytkie, ukośne nacięcie o długości 1-2 cm od prawej obojczyka w górę, w stronę żuchwy zwierzęcia. Żyła szyjna znajduje się powierzchownie pod skórą szyi. W ramach przygotowania do wprowadzenia cewnika, rurkę z podstawy cewnika przeciąga się przez nacięcie na grzbiecie i doprowadza w pobliże żyły szyjnej, przeprowadzając rurkę pod skórą tuż nad prawym barkiem. Koniec rurki cewnika zostaje następnie przymocowany do zacisku tętniczego i umieszczony z boku zwierzęcia, aby go ustabilizować.
6. Prawą żyłę szyjną lokalizuje się, delikatnie odsuwając powierzchowną tkankę łączną i tłuszczową z nacięcia wokół szyi zwierzęcia. Tkankę łączną wokół żyły rozdziela się za pomocą zakrzywionej pęsety, a następnie żyłę unosi się za pomocą sterylnego plastikowego pręta. Wokół każdego końca żyły zawiązuje się luźne węzły chirurgiczne, a rurkę cewnika przeciąga się przez górny węzeł, zapętlając ją nad nicią szwy, tak aby spoczywała niezacisnięta nad prawym barkiem.
7. Przed wprowadzeniem należy zwilżyć zarówno igłę wprowadzającą 20G, jak i żyłę sterylną solą fizjologiczną w celu zmniejszenia tarcia. Igłę trzyma się równolegle do żyły i wprowadza delikatnie w pobliżu dolnej części uniesionej żyły (Uwaga: do żyły musi wejść około 0,5 cm czubka igły). Za pomocą pęsety przesuwa się rurkę cewnika wzdłuż trzonu igły do wnętrza żyły. Opór wskazywałby na to, że rurka znajduje się w tkance łącznej, a nie w żyle. Przez żyłę wtłacza się 0,03 cc soli fizjologicznej, aby upewnić się, że nie ma nieszczelności. Nieszczelności mogą świadczyć o tym, że żyła została przebita lub że położenie rurki cewnika wymaga korekty.
   Uwaga: Aby sprawdzić, czy rurka znajduje się w żyle, należy spróbować pobrać trochę krwi za pomocą podłączonej strzykawki z solą fizjologiczną. Jeśli krwi nie można pobrać natychmiast, ścianą żyły lub serca może być zablokowany czubek cewnika lub żyła nie została przebita; należy skorygować położenie rurki i spróbować ponownie. Jeśli nadal nie można pobrać krwi, konieczne może być ponowne wprowadzenie igły.
   
8. Aby utrwalić cewnik na miejscu, należy dosunąć balonik cewnika do punktu wprowadzenia i usunąć igłę. Zawiązuje się dolny węzeł, a następnie przyciąga cewnik ściśle do pręta przed zawiązaniem drugiego węzła bezpośrednio nad balonikiem. Ponownie sprawdza się, czy można pobrać krew i w razie potrzeby nieco poluzowuje węzły. Rurkę cewnika chowa się pod skórą i zszywa nacięcie brzuszne wokół szyi zwierzęcia. Do zamkniętego nacięcia aplikuje się Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem lub inną maść antybiotykową, najlepiej zawierającą środek przeciwbólowy.
9. Kładąc zwierzę na brzuchu, umieszcza się podstawę cewnika pod skórą grzbietu w przygotowanym nacięciu. Należy upewnić się, że nadmiar rurki tworzy minimalną pętlę i jest dobrze ukryty pod podstawą cewnika, aby zminimalizować ryzyko pogryzienia i przebicia go przez zwierzę. Zszywa się nacięcie po obu stronach podstawy cewnika i aplikuje Polysporin Heal Fast za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem.
10. Cewnik przepłukuje się 0,03 cc heparynowanego roztworu ticarcilliny za pomocą strzykawki z przymocowaną rurką (sekcja 3.2). Kanulę zamyka się plastikowym kapturkiem, a następnie nakręca białą osłonę cewnika. U niektórych myszy bezpośrednio po operacji krew może wyciekać z cewnika przed założeniem kapturka na kanulę. Ważne jest ponowne przepłukanie zwierzęcia i szybkie założenie kapturka na kanulę, zanim krew zdąży wypłynąć. Zwierzęta muszą być przepłukiwane codziennie w celu utrzymania drożności cewnika.
11. Po przetarciu miejsca iniekcji między tylnymi nogami zwierzęcia 70% etanolem, podskórnie wstrzykuje się przeciwbólowy ketoprofen w dawce 5 mg/kg po jednej stronie oraz antybiotyk amikacynę w dawce 10 mg/kg po drugiej stronie.
12. Po zaprzestaniu znieczulenia zwierzęta pozostawia się do rekonwalescencji w czystej klatce z łatwym dostępem do jedzenia i wody przez 5 do 7 dni. Myszy powinny być przetrzymane przez noc w ogrzewanej szafce, aby zapobiec pooperacyjnej hipotermii.

5. Badania behawioralne – dożylna samopodaż

1. Przed testami behawioralnymi cewniki są przemywane 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Następnie myszy są umieszczane w komorach operantowych i podłączane do linii infuzyjnych oraz pomp infuzyjnych. Naciśnięcia dźwigni aktywnej skutkują 3,2 s infuzją 18 μl leku połączoną z zapaleniem światła stymulującego. Po każdym naciśnięciu dźwigni następuje 8 s przerwy (time out), podczas której światło stymulujące pozostaje zapalone.
2. Po sesji operantowej cewniki myszy są przemywane roztworem heparynowanej ticarcilliny przed powrotem zwierząt do klatek domowych.
3. Myszyom umożliwia się samopodawanie leku podczas 3 kolejnych 2-godzinnych sesji dla każdej dawki. Dawki były podawane w losowej kolejności dla każdej myszy, zgodnie z opisem w następnej sekcji.
4. Drożność cewników jest oceniana codziennie poprzez upewnienie się, że zarówno sól fizjologiczna, jak i roztwór antybiotyku mogą zostać przepłukane przez cewnik. Dodatkowo można przeprowadzić test z ketaminą/midazolamem, zgodnie z opisem w załączonej referencji ⁵. W skrócie, objawy anestezji, takie jak unieruchomienie w ciągu 5 s od infuzji 0,02-0,03 ml ketaminy (15 mg/ml) lub midazolamu (0,75 mg/ml), stanowią dowód drożności cewnika ⁵.

Wyniki

Rysunek 1. Wzorce reakcji w przypadku dożylnej samopodaży leku będą różnić się w zależności od rodzaju leku, zakresu dawek oraz zastosowanej szczepu myszy. Przedstawiony rysunek ukazuje dane dotyczące samopodaży kokainy po pomyślnym przeprowadzeniu zabiegu kaniulacji zgodnie z procedurą opisaną w filmie. Na rysunku przedstawiono średnią liczbę (±SEM) uzyskanych infuzji kokainy oraz średnie spożycie kokainy (mg/kg masy ciała, ±SEM) dla czterech dawek kokainy podawanych w losowej kolejności w schemacie wzmocnienia FR1. Oś abscys: dawka samopodanego leku na jedną infuzję. Oś rzędnych lewa: całkowita liczba uzyskanych infuzji podczas 2-godzinnej sesji operantowej. Oś rzędnych prawa: całkowite spożycie kokainy w mg/kg podczas 2-godzinnej sesji testowej. Wszystkie 13 kaniul pozostało drożnych przez cały czas trwania badania (4 tygodnie). Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) przeprowadzona dla dawek wykazała, że myszy podawały kokainę w sposób zależny od dawki [F (1,12) = 42.8, p<0.05]. Odnotowano wzrost spożycia kokainy na krzywej dawka-odpowiedź [F (3,36) = 29.6, p<0.05], pomimo spadku częstotliwości naciskania dźwigni przy wyższych dawkach. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 3 sesji testowych dla każdej dawki kokainy (±SEM), zebranych u myszy CD-1 (n=13 na dawkę, samce i samice łącznie). Porównania reakcji na dźwignię aktywną (wzmocnioną lekiem) i nieaktywną na całej krzywej dawka-odpowiedź przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA, aby upewnić się, że myszy rozróżniają obie dźwignie. W przypadku myszy CD1 analiza wykazała preferencję dla dźwigni aktywnej [F (1,12) = 10.255, p<0.05] w całym zakresie krzywej dawka-odpowiedź (dane nie zostały tutaj przedstawione).

Dyskusja

Modele zwierzęce nadużywania narkotyków są szczególnie użyteczne w zrozumieniu podłoża genetycznego zachowań związanych z przyjmowaniem substancji psychoaktywnych. Na przykład myszy o różnych profilach genetycznych wykazują dziedziczne różnice w wrażliwości na kokainę ^6-8, co pomaga w identyfikacji potencjalnych genów kandydackich pośredniczących w obserwowalnej zmienności fenotypowej ⁹. Procedury kaniulacji dożylnej opisane w niniejszej pracy były z dużym sukcesem stosowane do badania IVSA leków u różnych szczepów myszy, a także u myszy o różnym tle genetycznym ¹⁰.

Procedury przedstawione w tym filmie podkreślają ważne aspekty, na których należy się skoncentrować podczas i po zabiegu kaniulacji, aby uzyskać wiarygodne dane dotyczące dożylnej autopodaży (IVSA). Po pierwsze, kluczowe jest odpowiednie umieszczenie cewnika w prawym przedsionku, aby zapobiec niedrożności cewnika spowodowanej skrzepami krwi. Podczas operacji należy upewnić się, że koniec cewnika nie jest przeszkodzony ani zablokowany przez tkankę serca lub żyły. Po drugie, wymagane jest codzienne przemywanie cewnika zarówno przed, jak i po sesjach operacyjnych, aby zapobiec powstaniu zatorów. Wreszcie, gdy zwierzęta znajdują się w klatkach domowych, kaniula musi być stale zabezpieczona zarówno za pomocą nasadek kaniuli, jak i osłon krystalicznych, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń. Drobne zatory w kaniuli można usunąć za pomocą cienkiej igły o rozmiarze 26 G, jednak wymagane jest codzienne przemywanie roztworem antybiotyku z heparyną, szczególnie w dniach, w których zwierzęta nie są poddawane testom IVSA.

Do przeprowadzenia operacji przeżycia u zwierząt niezbędna jest dobra znajomość technik aseptycznych, analgezji i anestezji. Chociaż niniejszy film nie zastępuje właściwego szkolenia chirurgicznego, może służyć jako przewodnik dla badaczy pragnących opanować techniki niezbędne dla tego paradygmatu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól disodowa tikarcyliny	Sigma-Aldrich	T5639-1G	butelka 1 gram
Tears Naturale P.M (Smar do oczu)	Alcon	N/A	tubka 3,5 gram Ten smar do oczu można znaleźć w większości aptek. Można zastosować dowolny okulistyczny smar do oczu.
Kokaina	Medisca Pharmaceutique	0723-06	butelka 1 gram
Ketamina	Medisca Pharmaceutique	1754-04	butelka 25 gram
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	butelka 1 gram
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	butelka 250 gram
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	butelka 1 gram
Sól siarczanu amikacyny	Sigma-Aldrich	A2324-5G	butelka 5 gram
Sacharoza, odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	S5016-500G	butelka 500 gram
Standardowe kaniule dla myszy z miękką siatką	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Specyfikacja rurek: 26SWG;0,451;0,254
Aplikator nakładek Crystal cap	HRS Scientific	313CAC	Jest to biała nakładka na kaniulę.
Rurki Tygon Micro Bore	Thomas Scientific	9561S41	Specyfikacja rurek (średnica wewnętrzna x zewnętrzna x grubość ścianki w calach): .01 x .03 x .01