Method Article

Ilościowe obrazowanie specyficznej dla linii sygnalizacji za pośrednictwem receptora toll-podobnego w monocytach i komórkach dendrytycznych z małych próbek ludzkiej krwi

DOI:

10.3791/3741

April 16th, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy użycie technologii ImageStream (www.amnis.com), która łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym obrazowaniem cyfrowym o wysokiej rozdzielczości, w celu ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Nasze badania stanowią plan dla badań translacyjnych w celu ilościowego określenia odpowiedzi komórkowych specyficznych dla linii w małych próbkach z kohort badanych.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indywidualne różnice w statusie immunologicznym determinują reakcje na infekcję i przyczyniają się do ciężkości choroby i jej wyniku. Starzenie się wiąże się ze zwiększoną podatnością na infekcje wirusowe i bakteryjne oraz zmniejszoną reakcją na szczepionki z dobrze udokumentowanym spadkiem humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej1,2. Niedawno oceniliśmy wpływ starzenia się na receptory Toll-podobne (TLR), kluczowe elementy wrodzonego układu odpornościowego, które wykrywają infekcje drobnoustrojowe i wywołują przeciwdrobnoustrojowe odpowiedzi obronne gospodarza3. W dużej kohorcie zdrowych dawców ludzkich wykazaliśmy, że monocyty krwi obwodowej od osób starszych mają zmniejszoną ekspresję i funkcję niektórych TLR4 i podobne obniżone poziomy TLR i odpowiedzi sygnałowe w komórkach dendrytycznych (DC), komórkach prezentujących antygen, które odgrywają kluczową rolę w związku między odpornością wrodzoną a nabytą5. Wykazaliśmy rozregulowanie TLR3 w makrofagach i niższą produkcję IFN przez DC od starszych dawców w odpowiedzi na zakażenie wirusem Zachodniego Nilu6,7.

Najważniejsze dla naszego zrozumienia immunosenescencji i interwencji terapeutycznej jest szczegółowe zrozumienie konkretnych typów komórek reagujących i mechanizmu (mechanizmów) transdukcji sygnału. Tradycyjne badania odpowiedzi immunologicznych poprzez obrazowanie komórek pierwotnych i badanie markerów komórkowych za pomocą FACS lub immunoblot znacznie poszerzyły naszą wiedzę, jednak badania te są na ogół ograniczone technicznie ze względu na małą objętość próbki dostępnej od pacjentów i niemożność przeprowadzenia złożonych technik laboratoryjnych na wielu próbkach ludzkich. ImageStream łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym obrazowaniem cyfrowym o wysokiej rozdzielczości, ułatwiając w ten sposób prowadzenie badań w wielu populacjach komórek jednocześnie w celu skutecznego uchwycenia podatności pacjenta. Tutaj pokazujemy zastosowanie ImageStream w DC do oceny wzrostu fosforylacji i translokacji jądrowej kluczowego czynnika transkrypcyjnego, NF-κB, za pośrednictwem aktywacji TLR7/8 8. Korzystając z tej technologii, wykazaliśmy również niedawno nierozpoznaną zmianę sygnalizacji TLR5 i szlaku NF-κB w monocytach od starszych dawców, która może przyczyniać się do zmienionej odpowiedzi immunologicznej w starzeniu się9.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja i stymulacja komórek odpornościowych

  1. Pobrać 10-50 ml krwi w heparyniźnie od zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody zgodnie z wytycznymi lokalnej Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej. W przypadku badań nad starzeniem się lub patogenezą choroby należy wyraźnie określić kryteria wykluczenia i włączenia dla każdego ochotnika lub pacjenta.
  2. Wyizolować ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) za pomocą probówek CPT lub Ficoll-Paque Plus zgodnie z instrukcjami producenta (GE Healthcare, NJ) i przeprowadzić eksperymenty w dniu izolacji7 (Odczynniki, Tabela 1).
  3. Inkubować PBMC (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowymi etapami wykorzystania ImageStream w badaniach translacyjnych są wybór odpowiednich grup porównawczych oraz optymalizacja i walidacja swoistości przeciwciał. Różnice między grupami badanych w oznaczonym celu będą łatwo widoczne za pomocą histogramów i obrazów komórek. W połączeniu z dokładną analizą zmian w odpowiednich receptorach i szlakach sygnałowych, dane te dostarczą cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw dysregulacji immunologicznej w wyspecjalizowanych kohortach. Technika ta będzi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, oraz NCRR/GCRC Program M01-RR00125). Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych i dziękują dr Markowi Shlomchikowi, dyrektorowi Yale Cell Sorter Core Facility.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
  2. Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
  3. Medzhitov,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ImageStream CytometryToll like Receptor SignalingNF kappa B TranslocationPeripheral Blood Mononuclear CellsMonocyte Dendritic Cell AnalysisFlow Cytometry ImagingCell Signaling QuantificationHuman Blood Sample AnalysisImmunosenescence ResearchFluorescent Antibody Labeling

Related Articles