Ilościowe obrazowanie sygnałów zależnych od receptorów Toll podobnych specyficznych dla linii komórkowych w monocytach i komórkach dendrytycznych z niewielkich próbek ludzkiej krwi

Podsumowanie

Opisujemy zastosowanie technologii ImageStream (www.amnis.com), która łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, w celu ilościowego określenia mechanizmów komórkowych pierwotnych komórek odpornościowych pochodzących z dobrze zdefiniowanych kohort pacjentów. Nasze badania stanowią wzorzec dla analiz translacyjnych służących do ilościowego określania specyficznych dla linii komórkowych odpowiedzi w małych próbkach pobranych z kohort badanych.

Streszczenie

Indywidualne różnice w statusie immunologicznym determinują reakcje na infekcję i wpływają na ciężkość oraz przebieg choroby. Starzenie się wiąże się ze zwiększoną podatnością na infekcje wirusowe i bakteryjne oraz zmniejszoną odpowiedzią na szczepionki, przy dobrze udokumentowanym spadku odpowiedzi immunologicznej zarówno humoralnej, jak i komórkowej^1,2. Niedawno oceniliśmy wpływ starzenia się na receptory Toll-podobne (TLRs), kluczowe komponenty wrodzonego układu odpornościowego, które wykrywają infekcje mikrobowe i uruchamiają przeciwmikrobowe odpowiedzi obronne organizmu³. W dużej kohorcie zdrowych dawców ludzkich wykazaliśmy, że monocyty krwi obwodowej u osób starszych wykazują obniżoną ekspresję i funkcję niektórych receptorów TLR⁴, a podobny spadek poziomu TLR i odpowiedzi sygnałowych zaobserwowano w komórkach dendrytycznych (DCs) – komórkach prezentujących antygen, które odgrywają kluczową rolę w powiązaniu odporności wrodzonej z adaptacyjną⁵. Wykazaliśmy również dysregulację TLR3 w makrofagach oraz niższą produkcję IFN przez komórki dendrytyczne od starszych dawców w odpowiedzi na infekcję wirusem zachodniego Nilu^6,7.

Kluczem do zrozumienia immunosenescencji oraz do interwencji terapeutycznej jest szczegółowe poznanie konkretnych typów komórek wykazujących odpowiedź oraz mechanizmów transdukcji sygnału. Tradycyjne badania odpowiedzi immunologicznej poprzez obrazowanie komórek pierwotnych i analizę markerów komórkowych za pomocą FACS lub immunoblottingu znacząco poszerzyły naszą wiedzę, jednak badania te są zazwyczaj ograniczone technicznie przez małą objętość próbek dostępnych od pacjentów oraz brak możliwości przeprowadzania złożonych technik laboratoryjnych na wielu próbkach ludzkich. ImageStream łączy ilościową cytometrię przepływową z jednoczesnym cyfrowym obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, co ułatwia badanie wielu populacji komórek jednocześnie w celu efektywnego uchwycenia podatności pacjentów. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie ImageStream w komórkach DC w celu oceny wzrostu fosforylacji i translokacji jądrowej kluczowego czynnika transkrypcyjnego, NF-κB, indukowanego aktywacją TLR7/8, który inicjuje transkrypcję licznych genów krytycznych dla odpowiedzi immunologicznych⁸. Wykorzystując tę technologię, wykazaliśmy również niedawno wcześniej niezauważoną zmianę w sygnalizacji TLR5 oraz w szlaku NF-κB w monocytach od starszych dawców, co może przyczyniać się do zmienionej reaktywności immunologicznej w procesie starzenia⁹.

Protokół

1. Izolacja i stymulacja komórek odpornościowych

1. Pobrać 10-50 ml heparynowanej krwi od zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej zgody zgodnie z wytycznymi lokalnej Komisji Bioetycznej. W badaniach nad starzeniem się lub patogenezą chorób należy ściśle określić kryteria włączenia i wykluczenia dla każdego ochotnika lub pacjenta.
2. Wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) człowieka przy użyciu probówek CPT lub Ficoll-Paque Plus zgodnie z instrukcjami producenta (GE Healthcare, NJ) i przeprowadzić eksperymenty w dniu izolacji⁷ (Odczynniki, Tabela 1).
3. Inkubować PBMCs (3 x 10⁶/probówkę) w probówkach 1,5 ml w 0,6 ml samego medium lub stymulować ligandami TLR bądź innymi czynnikami aktywującymi, np. ligandem TLR7/8 R848 (0,6 ml medium plus 0,6 μl 10 mM ligandu TLR7/8 R848, stężenie końcowe 10 μM) w temperaturze 37 °C przez 10-60 min (InvivoGen, CA)⁹.

2. znakowanie komórek

1. Oznakuj linie komórkowe i inne markery powierzchniowe w zawiesinach żywych komórek, używając przeciwciał sprzężonych z fluorochromami. Oznakuj 3 x 10⁶ PBMC przez 20 min w 4 °C w 100 μl buforu PBS/2% FBS w probówce Eppendorf 1,5 ml, stosując koktajl przeciwciał powierzchniowych specyficznych dla linii monocytów lub DC (Tabela 2). Optymalne rozcieńczenia przeciwciał można określić w eksperymentach wstępnych; próbki należy przetwarzać partiami, aby zminimalizować zmienność między partiami odczynników. Dla zapasu przeciwciał od dostawcy o stężeniu 0,1 mg/ml użyj 5 μl przeciwciała (rozcieńczenie 1:20). Użyj oddzielnej probówki z komórkami oznakowanymi tylko jednym koniugatem barwnym do ustawienia kanałów fluorescencyjnych w urządzeniu.
2. Po znakowaniu powierzchniowym utrwal komórki w 4% PFA/PBS przez 10 min w RT. W celu przechowywania do czasu analizy odwirowuj komórki z prędkością 500 x g i resuspenduj je w buforze do zamrażania (90% FBS zawierającym 10% DMSO) w -80 °C do dnia przeprowadzenia testu.
3. W celu oceny przetwarzaj razem partie komórek nieleczonych i stymulowanych od grupy dawców, aby zminimalizować zmienność. W dniu analizy szybko rozmroź komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie odwirowuj z prędkością 500x g, aby usunąć bufor do zamrażania.
4. Aby zpermeabilizować komórki dla detekcji wewnątrzkomórkowych cytokin lub innych markerów, resuspenduj zawiesiny komórkowe w 100 μl buforu BD Perm/Wash (BD Biosciences, NJ). Oznakuj wewnątrzkomórkowe komponenty sygnalizacyjne, np. stosując rozcieńczenie 1:20 przeciwciała króliczego anty-NF-κB (p65) (stężenie końcowe 10 μg/ml, SantaCruz Biotechnology, CA) przez 20 min w RT, odwirowuj z prędkością 500 x g, odciągnij nadsącz i resuspenduj komórki w 100 μl buforu BD Perm/Wash zawierającego rozcieńczenie 1:250 przeciwciała koziego anty-króliczego IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) i inkubuj przez 20 min w RT.
5. Bezpośrednio przed obrazowaniem przeprowadź przeciwbarwienie jąder za pomocą DAPI (0,2 μg/ml, Invitrogen, CA) lub jodku propidyny (PI; 20 ng/ml, Invitrogen, CA).

3. Analiza ImageStream

1. Przeprowadzić obrazowanie za pomocą systemu ImageStream na próbkach pogrupowanych, aby zmniejszyć zmienność między próbkami ludzkimi. Ustawienia mocy laserów instrumentu były następujące: 200 mW dla 488 nm, 10 mW dla 658 nm oraz 250 mW dla 405 nm.
2. Aby przeanalizować pliki danych (Rys. 1), najpierw należy wyznaczyć bramkę dla zdarzeń o prawidłowej intensywności PI i wysokim współczynniku kształtu PI (stosunek szerokości do wysokości), aby odróżnić pojedyncze komórki (R1) od debris (niska intensywność PI) lub zdarzeń wielokomórkowych (wysoka intensywność PI i niski współczynnik kształtu). Monocyty znajdują się w bramce dla komórek CD14-dodatnich. mDC znajdują się w bramce dla komórek o wysokiej ekspresji CD11c i niskiej ekspresji CD4 (R2), a także niskiej ekspresji markerów Lin-1 (R3).
3. Użyć oprogramowania IDEAS (Amnis, WA), aby uzyskać skuteczną miarę ilościową stopnia aktywacji każdej komórki. Określić podobieństwo (lub kolokalizację) cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego NF-κB z nuklearnym barwnikiem PI, aby wskazać translokację do jądra (R4). Wysoka korelacja lokalizacji NF-κB/PI przejawia się wysoką wartością podobieństwa i wskazuje na stopień aktywacji¹⁰.
4. Porównać współczynniki podobieństwa między różnymi grupami terapeutycznymi lub populacjami pacjentów, aby określić względną wydajność funkcjonalną komórek. Ilościowo określić dane między próbkami poprzez statystyczne porównanie wartości bezwzględnych lub różnic krotności. Użyć oprogramowania IDEAS do wyświetlenia obrazów komórek z kluczowych segmentów histogramów populacyjnych (Rys. 2).

4. Reprezentatywne wyniki

Przeprowadziliśmy ilościową analizę szlaków sygnałowych w odpowiedzi na modelowy ligand wirusowy poprzez stymulację PBMC ligandem TLR7/8, R848 (Ryc. 1). W naszych grupach próbek zebraliśmy zarówno obrazy lokalizacji komórkowej, jak i statystyki populacyjne (Ryc. 2). System ImageStream pozwala na bezpośrednie bramkowanie podgrup komórek z PBMC oraz obrazowanie odpowiedzi komórkowych z bramkowanych, ale niesortowanych populacji komórek. W niniejszej pracy określiliśmy ilościowo wpływ sygnalizacji TLR na lokalizację jądrową NF-κB (p65) w mieloidalnych komórkach dendrytycznych (mDCs) o fenotypie Lin1-, CD4 dim, CD11c+. W stanie podstawowym zaobserwowaliśmy wysoki odsetek niestymulowanych komórek z czynnikiem transkrypcyjnym NF-κB (p65) w cytoplazmie. Po stymulacji komórki potraktowane wykazały istotnie wyższy wskaźnik podobieństwa NF-κB (p65) do barwnika jądrowego PI, co wskazuje na translokację NF-κB (p65) do jądra po stymulacji (mediany wskaźników podobieństwa wynoszą odpowiednio 1,52 i 3,01, Ryc. 2). Podobne wyniki odnotowano w monocytach stymulowanych TLR5⁹.

Rycina 1. Strategia barwienia i bramkowania w celu ilościowego określenia efektów stymulacji w ludzkich mDC. Czynnik transkrypcyjny NF-κB reguluje ekspresję licznych genów układu odpornościowego. W niniejszym badaniu zmierzono lokalizację jądrową NF-κB (p65) w mDC od jednego reprezentatywnego badanego po stymulacji ligandem TLR7/8. Pojedyncze komórki w ostrości zidentyfikowano poprzez bramkowanie zdarzeń dodatnich dla PI o wysokim współczynniku kształtu jądra (R1). Komórki mDC (Lin1-, CD4dim, CD11c+) wybrano w bramce R3. Lokalizację jądrową NF-κB (p65) przedstawiono w bramce R4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 2. Translokacja NF-κB w mDC po stymulacji. Translokacja NF-κB (p65) do jądra komórkowego po stymulacji (R4) jest przedstawiona dla populacji nieleczonych i stymulowanych mDC; mediana wyniku podobieństwa wynosi 1,52 w próbce nieleczonej i 3,01 w próbce stymulowanej (A). Cyfrowe obrazy zebrane jednocześnie z populacji komórek nieleczonych lub stymulowanych R848 pokazują reprezentatywne komórki oraz intensywność NF-B translokowanego do jądra komórkowego (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Kluczowymi etapami wykorzystania systemu ImageStream w badaniach translacyjnych są wybór odpowiednich grup porównawczych oraz optymalizacja i walidacja specyficzności przeciwciał. Różnice między grupami badawczymi w zakresie znakowanego celu będą wyraźnie widoczne na histogramach i obrazach komórek. W połączeniu z gruntowną analizą zmian w odpowiednich receptorach i szlakach sygnalizacyjnych, dane te dostarczą cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw dysregulacji odpornościowej w wyspecjalizowanych koho...