Elektrofizjologiczna charakterystyka odpowiedzi neuronalnych jest istotna dla zrozumienia funkcji mózgu oraz dla precyzyjnego wyznaczania miejsc podawania barwników do śledzenia szlaków neuronalnych. Jednak wiele badań przeprowadzanych jest na zwierzętach poddanym znieczuleniu. Aby zrozumieć funkcje mózgu bez stosowania środków znieczulających, opracowaliśmy metodę rejestracji właściwości odpowiedzi neuronalnych oraz wstrzykiwania barwników u budzącej się myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie budzącej się myszy do rejestracji odpowiedzi neuronalnych i wstrzykiwania znaczników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powszechnie wiadomo, że znieczulenie zmienia właściwości odpowiedzi neuronalnej w różnych obszarach mózgu13. W układzie słuchowym podstawowe właściwości odpowiedzi neuronów pnia mózgu, w tym próg pobudzenia, swoistość częstotliwościowa i boczne pasma hamowania, ulegają znacznym zmianom pod wpływem znieczulenia1-2. Obserwacje te skłoniły fizjologów do poszukiwania sposobów rejestracji sygnałów z pojedynczych neuronów bez wpływu znieczulenia. Jednym z rezultatów było opracowanie preparatu decerebracyjnego, w którym pień mózgu został całkowicie przecięty na poziomie śródmózgowia4. Wadami tego preparatu są skomplikowana procedura chirurgiczna, eliminacja projekcji zstępujących z przedmózgowia oraz brak możliwości wykorzystania stymulacji sensorycznej do badania struktur powyżej śródmózgowia. Inną strategią było chroniczne implantowanie macierzy elektrod w celu rejestracji sygnałów z pojedynczych neuronów i klastrów wielojednostkowych podczas gdy zwierzę jest w stanie czuwania i/lub wykazuje określoną aktywność behawioralną5,6. Techniki te nie są jednak kompatybilne z wstrzykiwaniem barwników śledzących po uprzednim scharakteryzowaniu struktury mózgu metodami elektrofizjologicznymi. Aby uniknąć zmiany właściwości odpowiedzi neuronalnej przez środki znieczulające podczas rejestracji elektrofizjologicznej pojedynczych neuronów, zaadaptowaliśmy technikę unieruchomienia głowy, długo stosowaną u nietoperzy7-9, do zastosowania u myszy10-12. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie przeprowadzać pomiary elektrofizjologiczne przez kilka dni u nieznarkowanej myszy. Po zakończeniu sesji pomiarowych możemy wstrzyknąć barwnik w celu rekonstrukcji pozycji elektrod i miejsc rejestracji lub wstrzyknąć znacznik, aby wyznaczyć drogi do i z miejsc rejestracji. Metoda ta umożliwia dobrze odizolowaną rejestrację sygnałów z pojedynczych neuronów przez wiele dni bez użycia środków znieczulających.
Protokół
1. Przegląd unieruchomienia głowy
- Aby zmontować wykonany na zamówienie stelaż głowowy (head-post), należy prostopadle włożyć stalową sprężynkę 1/16" w otwór wywiercony w stalowym pręcie 3/32", tworząc krzyż. Pionowy element stelaża głowowego powinien mieć około 20 mm, a poziomy element poprzeczny około 15 mm. Jeden koniec pionowego pręta należy nagwintować pod śrubę #1-72 (Rys. 1).
- Podczas operacji i rejestracji stelaż głowowy jest mocowany w wykonanym na zamówienie mosiężnym lub aluminiowym pręcie montażowym za pomocą śruby #1-72 (Rys. 2). Długi element pręta montażowego powinien mieć około 90 mm długości i 5-10 mm szerokości. Stelaż głowowy pasuje do rowka wyciętego w 15 mm przedłużeniu długiego pręta, który jest ustawiony pod kątem 45 deg. Aby zapobiec obrotowi głowy, element poprzeczny stelaża głowowego osadza się w małym rowku na spodzie pręta montażowego.
- Pręt montażowy jest następnie mocowany do wykonanego na zamówienie aluminiowego bloku montażowego (Rys. 3). Blok montażowy ma wymiary około 30 mm x 30 mm x 25 mm. Blok ten jest przymocowany do mikromanipulatora, aby pozycję stelaża głowowego można było precyzyjnie ustawić wzdłuż linii środkowej i w punkcie Bregma. Blok montażowy składa się z dwóch elementów połączonych śrubami. Wycięcie w bloku umożliwia wsunięcie pręta montażowego i jego zabezpieczenie śrubami. Pręt montażowy znajduje się równolegle do powierzchni stołu. Podczas rejestracji pręt mocuje się w specjalnym stelażu stereotaktycznym (Rys. 4). Stelaż stereotaktyczny jest zaprojektowany tak, aby pręt znajdował się w tej samej pozycji, co w bloku montażowym podczas operacji. Taka konfiguracja zapewnia, że mysz zawsze będzie wyrównana względem stelaża stereotaktycznego we wszystkich sesjach eksperymentalnych.
- Należy odciąć pręt wolframowy (średnica .010") na długość około 5 mm, zagiąwszy około 1 mm pod kątem 45°. Pręt ten służy jako pin uziemiający (Rys. 1).
2. Ustawienie stereotaktyczne do kraniotomii
Uwaga: Wszystkie opisane poniżej procedury są zgodne ze standardowymi aseptycznymi technikami chirurgicznymi i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Washington State University oraz Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Garvan.
- Zanurzyć mysz w narkozie, umieszczając ją w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem. Brak reakcji na uciśnięcie ogona i/lub palców u stóp potwierdza pełne znieczulenie zwierzęcia.
- Umieścić mysz w stereotaktycznym uchwycie do gryzoni wyposażonym w adapter dla myszy (Stoelting). Aby prawidłowo zorientować mysz, umieścić zęby w otworze poprzeczki do zgryzu i mocno dokręcić zacisk nosowy. Ustawić mysz w poprzeczce do zgryzu i zacisku nosowym tak prosto, jak to możliwe. Nałożyć maskę twarzową wykonaną z kawałka lateksowej rękawiczki na nos myszy i utrzymać stężenie izofluranu na poziomie 5%, aż częstość oddechów myszy wyniesie około 1 oddechu/sec. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5 - 2,0%. Unieruchomić głowę za pomocą prętów usznych, uważając, aby nie przebić błony bębenkowej. Pręty powinny przylegać ściśle, ale nie wnikać zbyt głęboko w kanały słuchowe.
- Umieścić matę grzewczą pod myszą.
- Nanieść maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.
- Ogolić skórę głowy od okolic między uszami aż do oczu za pomocą małej maszynki do golenia lub nożyczek z cienkim czubkiem.
- Oczyścić i wysterylizować skórę głowy, przecierając ją preparatem do mycia z chlorheksydyną (lub betadyną), a następnie płucząc alkoholem (powtórzyć 3 razy).
- Aby odsłonić skórę nad górną częścią czaszki, wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej od tyłu głowy do oczu.
- Zeskrobać okostną do krawędzi nacięcia za pomocą skalpela. Jeśli jest to wymagane (w zależności od celu eksperymentu), ostrożnie odsunąć pęsetą mięśnie w tylnej części szyi, pozwalając mięśniom rwać się wzdłuż pęczków, aby zminimalizować krwawienie. Pod tkankę skóry głowy nałożyć gąbkę żelatynową (gelfoam), aby zminimalizować wilgotność i zapobiec przesuwaniu się skóry po czaszce.
- Osuszyć powierzchnię czaszki aplikatorem z bawełnianym końcem zwilżonym alkoholem izopropylowym, aby poprawić widoczność punktów orientacyjnych czaszki.
- Wyrównać czaszkę zgodnie ze standardowymi współrzędnymi stereotaktycznymi13. Włożyć cienką sondę do uchwytu elektrod i przymocować ją do stereotaktycznego mikromanipulatora. Do tego celu dobrze nadaje się zaostrzony metalowy pręt (Rys. 5).
- Użyć końcówki do zidentyfikowania punktów Bregma (Rys. 5A) i Lambda (Rys. 5B) na czaszce. Przesuwać sondę w przód i w tył między tymi punktami, sprawdzając, czy współrzędna boczna-środkowa dla każdej lokalizacji różni się nie więcej niż o 50 μm. W razie potrzeby zmienić położenie głowy, ostrożnie luzując pręty uszne, przesuwając głowę i pręty uszne bocznie, a następnie ponownie dokręcając pręty.
- Zweryfikować, czy wysokość grzbietowo-brzuszna w każdej lokalizacji różni się nie więcej niż o 50 μm. W razie potrzeby skorygować wysokość zacisku nosowego, co spowoduje obrót czaszki wokół osi prętów usznych, aby wyrównać nachylenie czaszki. Konieczna może być również korekta wysokości prętów usznych.
- Skorzystać z atlasu13, aby określić współrzędne interesującego celu (Rys. 5C) względem punktu Bregma. Zaznaczyć czaszkę nad celem (np. znakiem „X” lub używając tuszu indyjskiego do naniesienia kropek w czterech rogach kwadratu), w miejscu, gdzie zostanie wykonana kraniotomia (Rys. 5D).
3. Instalacja wspornika głowy i pinu uziemiającego
- Użyj żelu trawiącego do oczyszczenia czaszki. Za pomocą aplikatora wyszoruj i rozprowadź żel trawiący po powierzchni (10 s). Przemyj wodą i całkowicie osusz. Nałóż primer do cementu dentystycznego na powierzchnię czaszki za pomocą aplikatora. Rozprowadź adhezyw nowym aplikatorem. Utwardź adhezyw za pomocą lampy UV (1 cykl).
- Wybierz miejsce na pin uziemiający, które znajduje się dystalnie względem miejsca docelowego. Ostrożnie wykonaj mały otwór w czaszce za pomocą końcówki skalpela z mini ostrzem #65, na tyle szeroki, aby krótki koniec pinu uziemiającego mógł wejść i spocząć na oponach mózgowych. Pin uziemiający powinien być zorientowany tak, aby był skierowany w stronę przeciwną do punktu Bregma i przyszłego trzpienia głownego (Rys. 6A).
- Zamocuj trzpień główny do pręta montażowego i bloku, a następnie przyłącz do mikromanipulatora. Przesuwając mikromanipulator w trzech wymiarach, ustaw trzpień główny nad punktem Bregma, tak aby ledwo dotykał czaszki (Rys. 6B). Podstawa trzpienia głównego powinna przylegać płasko do czaszki.
- Używając sond do sekcji, nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego wokół trzpienia głównego i pinu uziemiającego (Rys. 6C). Dociśnij cement, aby zapewnić dobry kontakt z czaszką. Uwaga: Nie używaj zbyt dużej ilości cementu, w przeciwnym razie nie utwardzi się on równomiernie. Utwardź cement za pomocą lampy UV (3-4 cykle pod różnymi kątami).
- Nałóż drugi etap cementowania, budując podstawę wokół trzpienia głównego i zakrywając jego rowki (Rys. 6D).
4. Kraniektomia
- Zlokalizuj punkt odniesienia do kraniotomii, który będzie częściowo przesłonięty przez primer. Używając skalpela nr 65, wyznacz kwadrat o wymiarach 3 mm x 3 mm wokół tego miejsca, a następnie nanieś kroplę lidokainy, aby zmniejszyć wrażliwość i zminimalizować krwawienie.
- Wykonaj wielokrotne nacięcia na każdym boku kwadratu (nawet do 10), uważając, aby nie przeciąć kości i nie uszkodzić mózgu (Ryc. 7A).
- Gdy fragment kości poluzuje się, użyj czubka skalpela, aby go podważyć, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną (Ryc. 7B).
- Przykryj wosk kostny.
5. Po operacji
- Wyłączyć znieczulenie gazowe i wyjąć mysz z ramion stereotyptaktycznych.
- Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem nałożyć maść lidokainową na odsłoniętą skórę, aby znieczulić obszar wokół rany. Za pomocą innego aplikatora z bawełnianym końcem nałożyć Neosporin na odsłoniętą skórę. Wstrzyknąć ketoprofen (5 mg/kg IM lub IP, zgodnie z preferencjami lekarzy weterynarii IACUC) jako lek przeciwbólowy po operacji. Mysz zazwyczaj podnosi się i zaczyna poruszać w ciągu kilku minut od zaprzestania podawania gazu.
- Umieścić mysz w ciepłej klatce i monitorować do czasu, aż będzie gotowa do powrotu do pomieszczenia dla zwierząt.
- Zwierzę powinno być sprawdzane co najmniej raz dziennie po wybudzeniu z narkozy. Należy obserwować oznaki słabego jedzenia i/lub picia oraz apatyczne zachowanie. W przypadku podejrzenia bólu podawać ketoprofen co 24 godziny (w tej samej dawce, co po operacji) aż do ustąpienia objawów. Lidokainę można stosować miejscowo na ranę, jeśli zwierzę drapie się lub wykazuje oznaki dyskomfortu. Zwierzęta zazwyczaj regenerują się po operacji bez powikłań i bólu.
6. Rejestracja i wstrzykiwanie barwnika
- Odczekać co najmniej jeden dzień po operacji wszczepienia trzpienia głownego przed rozpoczęciem rejestracji u myszy.
- Umieścić mysz w piankowym urządzeniu ograniczającym, dopasowanym do kształtu ciała zwierzęcia. Mysz została wcześniej przyzwyczajona do tego urządzenia, co redukuje jej lęk. Typowa adaptacja polega na codziennej manipulacji myszą po odsadzeniu oraz umieszczaniu jej w piankowym urządzeniu na 1-5 minut przez około jeden tydzień przed operacją i eksperymentami. Zawiesić urządzenie w ramie stereotaktycznej (Rys. 4).
- Zabezpieczyć trzpień główny na pręcie montażowym, który jest teraz przymocowany do ramy stereotaktycznej (Rys. 4).
- Podłączyć do pinu uziemiającego za pomocą przewodu zakończonego tępą igłą hipodermiczną o rozmiarze 22-gauge.
- Usunąć wosk kostny z miejsca kraniotomii. W razie potrzeby usunąć oponę twardą za pomocą czubka skalpela typu miniblade.
- Wprowadzić elektrodę do odpowiedniej lokalizacji stereotaktycznej i rozpocząć rejestrację (Rys. 8). W przypadku samych rejestracji elektrofizjologicznych można zastosować różne rodzaje elektrod. Wybór elektrody zależy od wymaganej lokalizacji i rodzaju rejestracji. Wybór elektrody do rejestracji u myszy w stanie czuwania jest taki sam, jakiego badacz używa u myszy znieczulonej. Do połączonych rejestracji elektrofizjologicznych z wstrzykiwaniem barwnika/znacznika stosuje się elektrodę z mikropipety10. Mikropipeta jest napełniona wybranym barwnikiem/znacznikiem, aby możliwe było jego wstrzyknięcie jontoforetycznie po zakończeniu eksperymentów elektrofizjologicznych. Można również stosować elektrody wielokanałowe, aby umożliwić manipulacje farmakologiczne. Elektroda wielokanałowa jest zamontowana na pojedynczej mikropipecie rejestrującej (Rys. 8). Techniki te są standardowe w literaturze i nie różnią się w przypadku rejestracji u zwierząt znieczulonych i czuwających.
- Rejestracje mogą być prowadzone przez 4-5 godzin przez 3-4 kolejne dni.
- Pod koniec sesji rejestracyjnej można wstrzyknąć barwnik/znacznik. Ponieważ w mózgu nie ma receptorów bólu, jontoforetyczne wstrzyknięcie barwnika lub znacznika do mózgu prawdopodobnie nie spowoduje dyskomfortu. Jednak po scharakteryzowaniu właściwości odpowiedzi elektrofizjologicznej w obszarze, w którym ma zostać wykonane wstrzyknięcie, zwierzę można znieczulić izofluranem na czas iniekcji. Pozwoli to wyeliminować wszelkie potencjalne niepożądane odczucia. Ponieważ barwnik/znacznik znajduje się już w mikropipetach, przewody aktywne i uziemiające można przełączyć z zestawu do rejestracji elektrofizjologicznej na generator prądu, aby jontoforetycznie wstrzyknąć barwnik/znacznik. Należy zastosować odpowiedni protokół dla barwnika/znacznika znajdującego się w elektrodzie. Zdjąć zwierzę z mocowania trzpienia głównego oraz ogranicznika ciała i przenieść do klatki macierzystej.
- Po zakończeniu eksperymentu postępować zgodnie z odpowiednim protokołem eutanazji i przetwarzania tkanek w celu odzyskania miejsca wstrzyknięcia i analizy znakowania.
7. Reprezentatywne wyniki
Prawidłowa implantacja trzpienia głownego pozwala eksperymentatorowi na rejestrację odpowiedzi pojedynczych i wielounitowych od niezestetyzowanej, czuwającej myszy przez wiele dni. System unieruchomienia umożliwia stabilne rejestracje elektrofizjologiczne pojedynczych neuronów w mózgu. Przez wiele dni z tej samej struktury mózgu można rejestrować doskonałą izolację pojedynczych jednostek i silne odpowiedzi na bodźce, na przykład w wzgórku dolnym myszy (Rys. 9A, dzień pierwszy; Rysunek 9B, dzień drugi). Przy prawidłowej implantacji trzpienia głownego każda mysz będzie konsekwentnie wyrównana względem aparatu stereotaksycznego oraz atlasu stereotaksycznego mózgu myszy,13 co skutkuje niezawodną lokalizacją konkretnych jąder mózgu. Ta niezawodna lokalizacja umożliwia wstrzykiwanie barwników i tracerów do specyficznych struktur po wielu dniach rejestracji. Na przykład, aby ocenić projekcje zstępujące z ośrodka słuchowego śródmózgowia do pnia mózgu, można wstrzyknąć biotynilowaną aminę dekstranową (wizualizowaną przy użyciu diaminobenzydyny jako chromogenu) do wzgórka dolnego myszy (Rys. 10A) po elektrofizjologicznej identyfikacji właściwości odpowiedzi neuronalnych w miejscu wstrzyknięcia (na Rys. 10A zarejestrowano neuron z częstotliwością optymalną wynoszącą 51 kHz), a po opracowaniu tkanki można zwizualizować i nanieść na mapę znakowanie anterogradne w przeciwległym jądrze grzbietowym ślimakowym (Rys. 10B). Można również uzyskać mikrofotografie o wyższej rozdzielczości, aby obejrzeć anterogradnie znakowane aksony i terminale (Rys. 10C).
Rycina 1.
Rycina 2.
Rysunek 3.
Rycina 4.
Rycina 5.
Rysunek 6.
Rysunek 7.
Rycina 8.
Rysunek 9.
Rysunek 10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zaletą systemu unieruchamiania głowy za pomocą bolca (head-post) w eksperymentach elektrofizjologicznych i neuroanatomicznych u myszy jest możliwość prowadzenia badań na zwierzętach nieznieczulonych i czuwających, co eliminuje potencjalne zniekształcenia odpowiedzi wywołane lekami anestezjologicznymi. Ponadto konfiguracja ta może być wykorzystywana przez wiele dni, co pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie zwierząt.
Większość komponentów do trzpienia głowowego jest dostępna w sprzedaży. J...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Wspierane przez grant NSF 0920060, grant NIH DC004395, grant NHMRC 1009482, NSW Office of Science and Medical Research oraz Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Żel do trawienia do oczyszczania czaszki przed nałożeniem cementu stomatologicznego | Henry Schein | 101-5396 | opakowanie 12 szt. z strzykawkami 1,2 mL |
| Primer do cementu stomatologicznego | Kerr Optibond | 25881 | butelka 8 mL |
| Adhezyw do cementu stomatologicznego | Kerr Optibond | 25882 | butelka 8 mL |
| Aplikatory do cementu stomatologicznego | Kerr Optibond | 24680 | opakowanie 200 szt. |
| Cement stomatologiczny | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | wkład do strzykawki 4 g |
| Pręt wolframowy (pin szlifowany) | A-M Systems | 717200 | średnica 0,010" |
| Ekonomiczna lampa do polimeryzacji UV | Henry Schein | CU-80 | |
| Słupek głowowy | Wytworzony wewnętrznie | ||
| Pręt montażowy | Wytworzony wewnętrznie | ||
| Blok montażowy | Wytworzony wewnętrznie | ||
| Stereotaksyczny przyrząd utrwalający | David Kopf Instruments | 902 | |
| Adapter dla myszy i noworodkowych szczurów | Stoelting Co. | 51625 | |
| Izotermiczna mata Deltaphase | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
Bibliografia
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
