Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3759

⸱

27 marca 2012

 , 
1Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 2Department of Chemical Engineering, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Streszczenie

Komórki macierzyste zarodkowe (ESC) charakteryzują się dwiema głównymi cechami: mogą być propagowane w nieskończoność in vitro w stanie niedróżnicowanym i są pluripotencjalne, co oznacza, że mają potencjał do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Takie właściwości sprawiają, że ESC są niezwykle atrakcyjne w zastosowaniach w terapii komórkowej oraz leczeniu regeneracyjnym 1Jednak aby w pełni wykorzystać ich potencjał, komórki muszą zostać zróżnicowane w dojrzałe i funkcjonalne fenotypy, co stanowi ogromne wyzwanie. Obiecującym podejściem w indukowaniu różnicowania komórkowego jest ścisłe naśladowanie przebiegu organogenezy w in vitro Kontekst. Wiadomo, że rozwój trzustki przebiega w określonych etapach 2zaczynając od endodermy, która może przekształcić się w kilka organów, w tym w wątrobę i trzustkę. Indukcję endodermy można osiągnąć poprzez modulację szlaku nodal za pomocą dodania aktywiny A 3 w połączeniu z kilkoma czynnikami wzrostu 4-7Komórki ostatecznej endodermy przechodzą następnie w proces różnicowania w kierunku trzustki poprzez hamowanie szlaku sygnałowego białka sonic hedgehog, co można osiągnąć in vitro poprzez dodanie cyklopaminy 8Dojrzewanie trzustki jest mediowane przez kilka równoległych procesów, do których należą między innymi: hamowanie sygnalizacji notch, agregacja prekursorów trzustki w klastry trójwymiarowe oraz indukcja unaczynienia. Do tej pory najskuteczniejszym in vitro dojrzalanie komórek progenitorowych trzustki pochodzących z ESC osiągnięto poprzez hamowanie sygnalizacji Notch za pomocą suplementacji DAPT 9Mimo że metoda ta jest skuteczna, skutkuje ona niską wydajnością uzyskiwania dojrzałego fenotypu o obniżonej funkcjonalności. Mniej zbadanym obszarem jest wpływ sygnalizacji komórek śródbłonka na dojrzewanie trzustki, co jest coraz częściej uznawane za istotny czynnik przyczyniający się do dojrzewania wysepek trzustkowych in vivo. 10,11.

Niniejsze badanie analizuje wpływ sygnalizacji komórek śródbłonka na dojrzewanie ludzkich komórek progenitorowych trzustki pochodzących z hESC w insulinotwórcze komórki przypominające wyspy trzustkowe. Przedstawiamy wieloetapowy protokół ukierunkowanej dyferencjacji, w którym hESC są najpierw indukowane w kierunku endodermy za pomocą aktywiny A przy jednoczesnym hamowaniu szlaku PI3K. Specyfikacja trzustkowa komórek endodermy jest osiągana poprzez hamowanie sygnalizacji białka sonic hedgehog za pomocą cyklopaminy oraz indukcję retinoidową poprzez dodanie kwasu retinowego. Końcowy etap dojrzewania jest indukowany przez sygnalizację komórek śródbłonka, osiągniętą dzięki konfiguracji kokultury. Choć w kokulturze testowano kilka rodzajów komórek śródbłonka, w niniejszej pracy prezentujemy dane uzyskane z wykorzystaniem mikro naczyniowych komórek śródbłonka serca szczura (RHMVEC), przede wszystkim ze względu na łatwość analizy.

Protokół

1. Hodowla komórek

  1. Komórki hESC H1 (WiCell) hodowano w studzienkach powlekanych Matrigelem kwalifikowanym dla hESC w pożywce mTeSR1, z codzienną wymianą pożywki. Studzienki powlekano rozcieńczonym roztworem Matrigelu, przygotowanym poprzez dodanie 300 μl Matrigelu dla hESC do 25 ml DMEM:F12. Do każdej studzienki płytki 6-studzienkowej dodawano 1 ml tego roztworu Matrigelu, lub 400 μl do każdej studzienki płytki 12-studzienkowej, po czym pozostawiano do powlekania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki pasażowano mechanicznie w stosunku rozdzielenia 1:4 poprzez zeskrobywanie kolonii, gdy osiągnęły średnicę od 1 do 1,5 mm.
  2. Komórki RHMVEC (VEC technologies) hodowano w pożywce MCDB-131 z wymianą pożywki co drugi dzień. Komórki rozdzielano poprzez trypsynizację w stosunku 1:3 po osiągnięciu 80% konfluencji. Do niniejszego badania wykorzystano komórki śródbłonka z pasażów od 3 do 7.

2. Przygotowanie roztworów zapasowych

  1. Aktywina A została zrekonstytuowana w stężeniu 50 μg/mL w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Roztwór podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.
  2. EGF został zrekonstytuowany w stężeniu 500 μg/mL w sterylnym 10 mM kwasie octowym. Roztwór podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.
  3. Insulinę zrekonstytuowano w stężeniu 10 mg/ml poprzez dodanie zakwaszonej wody H2O (pH ≤2), przygotowanej przez dodanie 0,1 ml lodowatego kwasu octowego do 10 ml wody.
  4. DAPT zrekonstytuowano w DMSO w stężeniu 18 mg/ml. Następnie rozcieńczono go do stężenia 300 μM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.
  5. KAAD-cyklopamina została zrekonstytuowana w DMSO w stężeniu 5mg/ml. Następnie rozcieńczono ją do stężenia 2 μM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.
  6. Kwas retinowy all-trans zrekonstytuowano w stężeniu 2,7 mg/ml w 95% etanolu. Następnie rozcieńczono go do stężenia 2mM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -80 °C.

3. Indukcja ostatecznej endodermy (DE) i progenitorów trzustki (PP)

  1. Gdy kolonie hESC osiągnęły średnicę od 1 do 1,5 mm, przeprowadzono indukcję DE poprzez dodanie DMEM:F12 uzupełnionego o B27, 0,2% BSA, 100 ng/ml aktywiny A i 1 μM wortmanniny na 4 dni (Dzień 0-Dzień 4), przy codziennej wymianie pożywki.
  2. Po zakończeniu indukcji DE zaindukowano różnicowanie w kierunku progenitorów trzustki, zmieniając pożywkę na DMEM:F12 uzupełnioną o B27, 0,2% BSA oraz KAAD-cyklopaminę w stężeniu 0,2 μM na 24 godziny (Dzień 4-Dzień 5).
  3. Po 24 godzinach pożywkę zmieniono na DMEM:F12 uzupełnioną o B27, 0,2% BSA, KAAD-cyklopaminę w stężeniu 0,2 μM oraz all-trans kwas retinowy w stężeniu 2 μM na 3 dni, przy codziennej wymianie pożywki (Dzień 5-Dzień 8).

4. Dojrzewanie trzustki

  1. Po indukcji PP wszystkie grupy przeniesiono do pożywki dojrzewania składającej się z DMEM:F12 uzupełnionego o B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotynamidu, 25 μg/ml insuliny, 30 nM Na2SeO3 oraz 50 μg/ml transferryny na 2 dni, z codzienną wymianą pożywki (Dzień 8-Dzień 10).
  2. Po 2 dniach w pożywce dojrzewania, końcowy etap dojrzewania jest przeprowadzany równolegle w kilku różnych warunkach w celu porównania. Różnicowanie indukowano w następujących warunkach: (i) przy użyciu inhibitora notch DAPT (ii) przy użyciu wyłącznie pożywki do kokultury, bez komórek śródbłonka jako kontroli oraz (iii) przy użyciu kokultury kontaktowej z komórkami RHMVEC. Komórki utrzymywano w pożywce z DAPT lub pożywce do kokultury przez tydzień (Dzień 10-Dzień 17) z codzienną wymianą pożywki.
    1. Pożywka z DAPT została przygotowana poprzez uzupełnienie pożywki dojrzewania o 30 μM DAPT. Komórki w tych grupach były najpierw eksponowane na pełną pożywkę MCDB131 przez 24 godziny, a następnie na pożywkę z DAPT przez 6 dni (Dzień 11-Dzień 17).
    2. Pożywka do kokultury została przygotowana poprzez uzupełnienie pożywki MCDB-131 o B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotynamidu, 10 ng/ml EGF, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 10 mg EndoGro, 90 μg/ml heparyny. W warunkach kontroli pożywki różnicujące się komórki eksponowano na pełną pożywkę MCDB-131 przez 24 godziny (Dzień 10-Dzień 11), po czym pożywkę zmieniono na pożywkę do kokultury na 6 dni (Dzień 11-Dzień 17) (bez komórek śródbłonka).
    3. W przypadku kokultury kontaktowej jeden milion komórek RHMVEC dodano do różnicujących się komórek w pełnej pożywce MCDB-131 (VEC technologies) na 24 godziny (Dzień 10-Dzień 11), aby umożliwić ich przytwierdzenie. Po 24 godzinach pożywkę zmieniono na pożywkę do kokultury na 6 dni (Dzień 11-Dzień 17) z codzienną wymianą pożywki.

5. Analiza qRT-PCR

  1. Pod koniec każdego etapu różnicowania (endodermy, progenitora trzustki, dojrzałej wysepki) przeprowadzono lizę komórek i wyekstrahowano RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji NucleoSpin RNA II zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Jakość RNA analizowano poprzez pomiar absorbancji RNA przy 260 nm i 280 nm, a następnie przeprowadzono kwantyfikację RNA przy użyciu spektrofotometru SmartSpec Plus.
  3. Transkrypcję odwrotną przeprowadzono za pomocą zestawu do transkrypcji odwrotnej ImProm II zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie reakcje przeprowadzono z użyciem 100 ng RNA.
  4. Reakcję qRT-PCR przeprowadzono przy użyciu systemu Mx3005P QPCR (Agilent) oraz mieszaniny Brilliant II SYBR Green QPCR master mix zgodnie z instrukcjami producenta. Użyte primery wymieniono w tabeli 1. Etap inicjalizacji przeprowadzono w temperaturze 50 °C przez 2 minuty, a następnie w 95 °C przez 10 minut. Przeprowadzono 50 cykli amplifikacji według następującego schematu: 95 °C przez 30 sekund, 54 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę.
  5. Krotność zmiany ekspresji docelowego mRNA względem komórek nieróżnicujących się obliczono z wartości CT, korzystając z następujących wzorów:
    ΔCT(Markeri)= CT(Markeri) - CT (GAPDH)
    Δ ΔCT(Markeri)= ΔCT(Markeri)(Próbka)- ΔCT(Markeri)(Komórki nieróżnicujące się)
    Ekspresja względna (Markeri)= 2-ΔΔCT(markeri)

6. Immunocytochemia

  1. Na koniec każdego etapu różnicowania (endoderma, progenitorów trzustkowych, dojrzałych wysepek) komórki utrwalono w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Utrwalone komórki poddano permeabilizacji z użyciem 0,25% Triton X-100 (TX) przez 15 minut.
  3. Barwienie nieswoiste zablokowano poprzez inkubację w 10% surowicy osła w 0,05% TX przez 30 minut.
  4. Inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym przeprowadzono przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym, stosując zalecane rozcieńczenie przeciwciała (patrz tabela 1).
  5. Komórki przemyto trzykrotnie 0,05% TX przez 5 minut.
  6. Inkubację z przeciwciałem drugorzędowym przeprowadzono przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, stosując odpowiednie przeciwciała rozcieńczone w buforze blokującym.
  7. Komórki przemyto trzykrotnie 0,05% TX przez 5 minut.
  8. Barwienie jąder przeprowadzono poprzez inkubację z barwnikiem Hoescht w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS przez 5 minut, a następnie trzykrotnie przemyto komórki w PBS.
  9. Utrwalone i zabarwione komórki obrazowano przy użyciu odwróconego mikroskopu Olympus IX81 oraz oprogramowania do obrazowania Metamorph.

7. Reprezentatywne wyniki

Dodatek aktywiny A oraz wortmanniny do niezróżnicowanych hESC przez 4 dni indukuje powstawanie endeodermy definitywnej, co potwierdzono analizą qRT-PCR dla markerów DE: Sox17, Cxcr4 i Foxa2 oraz barwieniem immunologicznym dla Sox17, jak przedstawiono na Rysunku 2. Różnicowanie do komórek progenitorowych trzustki po dodaniu cyklopaminy i kwasu retinowego potwierdzono za pomocą qRT-PCR dla markerów progenitorowych trzustki oraz barwienia immunologicznego dla Pdx1, jak pokazano na Rysunku 3.

W końcowej fazie różnicowania kontaktowa kokultura z komórkami RHMVEC silnie indukowała zwiększenie ekspresji insuliny w komórkach progenitorowych trzustki pochodzących z hESC. Efektywność różnicowania pośredniczonego przez kokulturę przeanalizowano poprzez porównanie z warunkiem kontrolnym z zastosowaniem DAPT. DAPT posłużył jako kontrola pozytywna, ponieważ jest obecnie jedną z najszerzej stosowanych metod osiągania dojrzewania trzustki. Ponieważ kokulturę przeprowadzono w zmodyfikowanym medium uzupełnionym o czynniki wspierające komórki śródbłonka, wykonano dodatkową kontrolę z użyciem medium bez komórek śródbłonka, aby zweryfikować wpływ medium na różnicowanie. Szczegóły tej analizy przedstawiono na Rysunku 4.

Schemat różnicowania ludzkich komórek macierzystych do progenitorów trzustkowych; proces dojrzewania w kokulturze.
Rysunek 1. Wieloetapowy protokół różnicowania hESC w komórki wykazujące ekspresję insuliny.

Wykres słupkowy ekspresji genów i mikroskopia barwienia SOX17/DAPI; porównanie białek, wyniki badania komórek.
Rycina 2. Indukcja endeodermy definitywnej z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. A) Analiza qRT-PCR reprezentatywnych markerów DE w komórkach hESC poddanych działaniu Aktywiny A i wortmanniny przez 4 dni. Wyniki zostały znormalizowane względem nieróżniczkowanych hESC. B) Barwienie Sox17 (zielone) i DAPI (niebieskie) wykazuje jądrową ekspresję Sox17. Pasek skali: 50 μm.

Wykres słupkowy ekspresji genów i obraz mikroskopii fluorescencyjnej dla analizy PDX1/DAPI.
Rycina 3. Indukcja progenitorów trzustki w komórkach endodermy pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych. A) Analiza qRT-PCR wczesnych markerów trzustkowych w komórkach endodermy pochodzących z hESC, poddanych działaniu cyklopaminy i kwasu retinowego przez 4 dni po indukcji DE. Wyniki znormalizowane względem niezróżnicowanych hESC. B) Barwienie Pdx1 (fiolet) i DAPI (niebieski) wykazuje jądrową ekspresję Pdx1. Pasek skali: 50 μm.

Wykres ekspresji glukagonu i insuliny, mikroskopia immunofluorescencyjna C-peptydu, barwienie DAPI.
Rysunek 4. Etap dojrzewania trzustki. A) Analiza qRT-PCR hormonów trzustkowych w hESC po dojrzewaniu trzustki z użyciem DAPT, kokultury kontaktowej lub pożywek do kokultury (kontrola). Wyniki znormalizowane względem niedróżnicowanych hESC. Wartości p wyznaczone testem t-Studenta. B) Kokultura z RHMVEC znakowanymi Dil-Ac-LDL (kolor czerwony) pokazuje obszary, w których komórki śródbłonka (EC) przylegają do płytki w przypadku występowania pustych przestrzeni (góra); inne RHMVEC znajdują się w bezpośrednim kontakcie z różnicującymi się ESC (dół). C) Barwienie C-peptydu (kolor zielony) dla komórek różnicowanych metodą kokultury. Pasek skali: 12,5 μm (góra) i 50 μm (dół). D) Immunobarwienie RHMVEC wykazuje brak ekspresji insuliny w RHMVEC.

MarkerStarter 1 (5' do 3')Starter 2 (5' do 3')Ref.
SOX17CTCTGCCTCCTCCACGAACAGAATCCAGACCTGCACAA12
CXCR4CACCGCATCTGGAGAACCAGCCCATTTCCTCGGTGTAGTT4
FOXA2GGAGCGGTGAAGATGGAATACGTGTTCATGCCGTTCAT12
PDX1AAGTCTACCAAAGCTCACGCGGTAGGCGCCGCCTGC4
PTF1CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAGGCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC12
HLXB9CACCGCGGGCATGATCACTTCCCCAGGAGGTTCGA4
HNF6TGTGGAAGTGGCTGCAGGATGTGAAGACCAACCTGGGCT5
PAX6CGAATTCTGCAGGTGTCCAAACAGACCCCCTCGGACAGTAAT5
NKX6.1AGACCCACTTTTTCCGGACACCAACGAATAGGCCAAACGA5
ISL1GATCTATGTCACCTCGCAAGGTACAACCACCATTTCACTG12
GLUKAGONAGGCAGACCCACTCAGTGAAACAATGGCGACCTCTTCTG4
INSULINAAAGAGGCCATCAAGCAGATCACAGGAGGCGCATCCACA12

Tabela 1. Primery użyte do reakcji qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas rozwoju trzustki różnicujące się komórki trzustkowe znajdują się w bliskim sąsiedztwie komórek śródbłonkowych aorty; ponadto wyspy trzustkowe są gęsto unaczynione, aby umożliwić szybką wymianę glukozy we krwi i hormonów wyspkowych. Biorąc pod uwagę te fakty, nie dziwi fakt, że komórki śródbłonkowe odgrywają ważną rolę w procesie organogenezy trzustki. Chociaż znaczenie komórek śródbłonkowych podczas rozwoju trzustki jest coraz bardziej doceniane, ich rola w różnicowaniu komórek embrionalnych in vitro jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe z ramienia NIH New Innovator Award DP2 116520 oraz ORAU Ralph Powe Junior Faculty Enhancement Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mTeSR1 (z suplementem)Stem Cell Technologies5850
matrigel kwalifikowany dla hESCBD Biosciences354277
DMEM:F12Invitrogen11330-032
MCDB-131Invitrogen10372019
MCDB-131 (kompletne)VEC TechnologiesMCDB-131
Suplement B27Invitrogen17504044
Aktywina AR&D Systems338-AC100ng/ml
WortmanninaInvitrogenW31441μM
KAAD-CyclopamieSigma-AldrichC41160.2μM
All-trans kwas retinowySigma-AldrichR26252μM
DAPTSigma-AldrichD594230μM
NikotynamidSigma-AldrichN063610 mM
Selinian soduSigma-AldrichS526130 nM
InsulinaSigma-AldrichI188225 μg/ml
TransferynaSigma-AldrichT815850 μg/ml
EGFR&D Systems236-EG10ng/ml
EndoGroVEC TechnologiesENDOGRO10mg
HeparynaSigma-AldrichH314990μg/ml
HydrokortyzonSigma-AldrichH08881μg/ml
NucleoSpin RNA IIMacherey-Nagel740955
System odwrotnej transkrypcji ImProm IIPromega Corp.A3800
Brilliant II SYBR Green QPCR master mixStratagene, Agilent Technologies600548
Sox17 kozia poliklonalna IgGSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-173551/500
PDX1 kozia poliklonalna IgGSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-146621/500
C-Peptyd króliczy poliklonalnyCell Signaling Technology45931/500
Alexa Fluor 488 osiołkowy anty-króliczy IgGInvitrogenA-212061/1000
Alexa Fluor 647 osiołkowy anty-kozi IgGInvitrogenA-214471/1000
Tabela 2. Odczynniki i zestawy

Bibliografia

  1. De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
  2. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  3. Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
  4. D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
  5. Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
  6. Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
  7. Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
  8. Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
  9. Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
  10. Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
  11. Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
  12. Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
  13. Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie embrionalne kom rki macierzysteindukcja ostatecznej endodermyindukcja progenitor w trzustkisygnalizacja kom rek r db onkowychmikroskopia immunofluorescencyjnaanaliza QPCRmikro naczyniowe kom rki r db onka serca szczura
Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.