TransFLP — metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Summary

Opisana jest szybka metoda modyfikacji genomu V. cholerae. Modyfikacje te obejmują delecję pojedynczych genów, klastrów genów i wysp genomowych, a także integrację krótkich sekwencji (np. elementów promotora lub sekwencji znaczników powinowactwa). Metoda opiera się na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP.

Abstract

Dostępnych jest kilka metod manipulowania chromosomami^{bakteryjnymi 1-3}. Większość z tych protokołów opiera się na insercji warunkowo replikujących plazmidów (np. zawierających zależne od PIR lub wrażliwe na temperaturę replikony^1,2). Plazmidy te są zintegrowane z chromosomami bakteryjnymi w oparciu o rekombinację za pośrednictwem homologii. Takie mutanty insercyjne są często bezpośrednio stosowane w warunkach eksperymentalnych. Alternatywnie można przeprowadzić selekcję do wycięcia plazmidu, a następnie jego utratę, co w przypadku bakterii Gram-ujemnych często opiera się na kontrselekcjiewalnym enzymie sacharazy lewanowej kodowanym przez gen sacB ⁴. Wycięcie może albo przywrócić genotyp sprzed insercji, albo spowodować wymianę między chromosomem a kodowaną plazmidem kopią zmodyfikowanego genu. Wadą tej techniki jest to, że jest czasochłonna. Plazmid musi zostać najpierw sklonowany; wymaga poziomego przeniesienia do V. cholerae (w szczególności przez krzyżowanie ze szczepem dawcy E. coli) lub sztucznego przekształcenia tego ostatniego; A wycięcie plazmidu jest losowe i może albo przywrócić początkowy genotyp, albo stworzyć pożądaną modyfikację, jeśli nie zostanie dokonana pozytywna selekcja. W tym miejscu przedstawiono metodę szybkiej manipulacji chromosomem (chromosomami) V. cholerae5 (ryc. 1). Ta metoda TransFLP opiera się na niedawno odkrytej indukcji naturalnej kompetencji za pośrednictwem chityny^u tego organizmu 6 i innych przedstawicieli rodzaju Vibrio, takich jak V. fischeri⁷. Naturalna kompetencja umożliwia wychwyt wolnego DNA, w tym fragmentów DNA generowanych metodą PCR. Po pobraniu DNA rekombinuje z chromosomem, biorąc pod uwagę obecność co najmniej 250-500 pz flankującego regionu^{homologicznego 8}. Umieszczenie znacznika wyboru pomiędzy tymi obszarami bocznymi umożliwia łatwe wykrywanie często występujących transformantów.

Ta metoda może być używana do różnych manipulacji genetycznych V. cholerae i potencjalnie także innych naturalnie kompetentnych bakterii. Przedstawiamy trzy nowatorskie przykłady tego, co można osiągnąć za pomocą tej metody, oprócz naszego wcześniej opublikowanego badania nad delecjami pojedynczych genów i dodawaniem sekwencji znaczników powinowactwa⁵. W tym protokole TransFLP zawarto kilka etapów optymalizacji dotyczących początkowego protokołu naturalnej przemiany^indukowanej chityną 6. Obejmują one m.in. zastąpienie fragmentów skorupy kraba dostępnymi na rynku płatkami chityny⁸, oddanie DNA pochodzącego z PCR jako materiału transformacyjnego⁹ oraz dodanie docelowych miejsc rekombinacji FLP (FRT)⁵. Miejsca FRT umożliwiają ukierunkowane na miejsce wycięcie markera selekcyjnego, w którym pośredniczy rekombinaza Flp¹⁰.

Protocol

Metoda TransFLP (Rysunek 1) jest zilustrowana trzema różnymi podejściami: I) delecja dwóch sąsiadujących genów kodujących determinanty wirulencji V. cholerae (np. ΔctxAB); II) usunięcie wyspy chorobotwórczości (np. ΔVPI-1); oraz III) integracja sekwencji promotora zależnej od polimerazy RNA T7 przed genem będącym przedmiotem zainteresowania, która następnie umożliwia jego sztuczną ekspresję w odpowiednim tle szczepu (np. T7-tfoX) (Figura 2).

1. Przygotowanie płatków chitynowych

1. Waga 50-80 mg płatków chityny w standardowej plastikowej tubie o pojemności 1,5 ml. Można to przygotować luzem. Płatki chitynowe są dostępne w handlu firmy Sigma (nr kat. C9213).
2. Płatki należy sterylizować w autoklawie, trzymając otwarte pokrywki probówek.
3. Natychmiast zamknij pokrywy po ostygnięciu autoklawu.
4. Przechowuj autoklawowane płatki chityny w temperaturze pokojowej.

2. Opcjonalnie: Sztuczna transformacja V. cholerae z plazmidem kodującym rekombinazę Flp

1. Przygotować elektrokompetentne komórki V. cholerae przy użyciu standardowych metod¹¹. Przechowywać podwielokrotności właściwych komórek w temperaturze -80 °C.
2. Dodać 1-2 μl zwykłego minipreparatu plazmidu pBR-flp⁵ do elektrokompetentnych komórek V. cholerae i przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji (szerokość szczeliny 0,2 cm).
3. Zastosuj impuls przy napięciu 1,6 kV.
4. Dodać 0,9 ml pożywki SOC, delikatnie przenieść komórkę do standardowej probówki o pojemności 14 ml. Inkubować nieruchomo przez 2,5 do 3 godzin w temperaturze 30 °C.
5. Umieścić 100 μl i 300 μl na płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.
6. Oczyść pojedynczy klon i przechowuj go jako zapas glicerolu do przyszłych eksperymentów TransFLP.

3. Projektowanie oligonukleotydów i reakcja łańcuchowa polimerazy

1. Co najmniej sześć oligonukleotydów jest wymaganych do amplifikacji regionu (regionów) DNA będącego przedmiotem zainteresowania, a także kasety antybiotykowej z flankami FRT za pomocą PCR (Figura 3). Zaleca się również dołączenie pary oligonukleotydów gruntujących na zewnątrz wstawionego fragmentu PCR. Pozwala to na sprawdzenie integracji i prawidłowego wycięcia kasety oporności na antybiotyki z flankami FRT (np. przedstawionej jako startery "chk-up" i "chk-down" na rysunkach od 3 do 5).
2. Zaprojektuj oligonukleotydy #2, #3, #4 i #5 z rozwagą. Powinny być w stanie wyżarzyć się w wystarczającym stopniu (np. ~28 pz) do matrycowego DNA. Matrycowy DNA to genomowe DNA (gDNA) dla starterów #2 i #5 oraz plazmidowego DNA zawierającego FRT-Kan-FRT, takiego jak pROD17¹² i pBR-FRT-KAN-FRT (to badanie) dla starterów #3 i #4 (Figura 3A).
3. Zaprojektuj startery od #2 do #5 tak, aby umożliwić obszerne parowanie zasad na ich końcu 5' odpowiednio między #2 / #3 i #4 / #5 (wstawka Rysunek 3A). Następnie przeprowadzane są dwie rundy PCR.
4. Wykonaj trzy niezależne reakcje PCR jako 1 rundę PCR. Pierwszy z nich będzie amplifikował górny region genu / DNA za pomocą oligonukleotydów #1 i #2. W wyniku PCR powinien powstać fragment o długości co najmniej 500 pz, aby umożliwić rekombinację homologiczną w komórkach. Krótsze fragmenty (~250 pz) mogą być wystarczające⁸, ale nie są zalecane.
5. Równolegle wykonaj drugi PCR, który amplifikuje kasetę z antybiotykiem po bokach FRT. W podanych tutaj przykładach używaliśmy głównie aph (kan^R). Użyj oligonukleotydów #3 i #4 do tej reakcji (ryc. 3A).
6. Jednocześnie amplifikować dalszy region DNA za pomocą PCR (trzecia próbka). Fragment PCR powinien również mieć co najmniej 500 pz długości. Wykonaj PCR z gDNA jako matrycą i oligonukleotydami #5 i #6 (Figura 3A).
7. Po oczyszczeniu ze wszystkich trzech fragmentów PCR wykonaj 2 rundę PCR. Użyj równej mieszanki wszystkich trzech fragmentów uzyskanych w pierwszej rundzie jako szablonu. Amplifikacja jest katalizowana przez oligonukleotydy #1 i #6. Powstały fragment PCR (Figura 3B) służy jako transformacja DNA w eksperymencie naturalnej transformacji (Figura 1).

4. Naturalna przemiana wywołana chityną

1. Komórki V. cholerae hodować tlenowo w bogatym podłożu w temperaturze 30 °C, aż osiągną gęstość optyczną około 0,5 nm przy 600 nm.
2. Zbierz bakterie przez odwirowanie. Umyć osad raz w określonym sztucznym podłożu (DASW⁶) przed ponownym zawieszeniem komórek w 2 objętościach DASW. Dodać 1 ml kultury do 50-80 mg sterylnych płatków chitynowych (wyjaśnionych w pkt 1). Jeśli bakterie są nosicielami plazmidu pBR-flp (opcjonalnie punkt 2), dodać ampicylinę (50 μg/ml) do hodowli. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 16-24 godziny bez ruchu.
3. Dodać ≥ 200 ng fragmentu pochodzącego z PCR w drugiej rundzie (wyjaśnionego w pkt 3). Dokładnie wymieszaj, nie odrywając zbytnio bakterii od powierzchni chityny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny bez ruchu.
4. Intensywnie wirować kulturę przez ≥ 30 sek. Rozprowadzić 100-300 μl na selektywnych płytkach LB (np. płytkach LB zawierających kanamycynę lub gentamycynę, dla przykładów podano tutaj). Stosować płytki podwójnie selektywne, jeśli bakterie są nosicielami plazmidu pBR-flp, dodając ampicylinę jednocześnie z innymi antybiotykami. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 16-24 godzin lub do momentu, gdy widoczne będą kolonie.
5. Odizolować pojedyncze transformanty od płytek selektywnych. Takie transformanty zastąpiły pierwotne locus chromosomu fragmentem PCR w wyniku podwójnego skrzyżowania. Szczepy te mogą być bezpośrednio wykorzystane do dalszych eksperymentów w przypadku, gdy usunięcie kasety z antybiotykiem nie jest konieczne.

5. Usuwanie selektywnych kaset przez rekombinację Flp

1. Sztucznie przekształcić transformatory za pomocą plazmidu pBR-flp, jak opisano w punkcie 2, jeśli nie zostanie to zrobione przed testem naturalnej transformacji.
2. Hodować bakterie na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę w temperaturze 37 °C przez 16-24 godziny. Opcje: zmienić temperaturę pomiędzy nimi na 2-3 godziny na 40 °C, ponieważ ekspresja flp z plazmidu pBR-flp jest depresyjna w wyższych temperaturach^5,10; przenieść bakterie na świeże płytki po ok. 8 godzinach inkubacji.
3. Test na nadwrażliwość na antybiotyki (wykazany tutaj dla kanamycyny; Rysunek 1) poprzez równoległe nawożenie klonów na płytkach agarowych zawierających antybiotyki i wolnych od antybiotyków. Odizoluj pojedyncze wrażliwe kolonie. Zamroź klon odporny na ampicylinę jako zapas glicerolu, jeśli zamierzasz dalej modyfikować szczep za pomocą innej delecji / insercji za pomocą TransFLP.

6. Utwardzanie plazmidu

1. Uprawiaj kulturę przez noc w warunkach tlenowych i w temperaturze 30 °C. Używaj bogatego podłoża bez dodatku antybiotyków.
2. Opcjonalnie: Hoduj świeżą kulturę przez 3-6 godzin, rozcieńczając kulturę przez noc w stosunku 1:100 w świeżej pożywce wolnej od antybiotyków.
3. Rozcieńczenie (rozcieńczenia) kultury na zwykłej płytce (płytkach) agarowej LB lub smugach i inkubować w temperaturze 30 °C przez 8-16 godzin (do momentu, gdy widoczne są kolonie).
4. Przetestuj wrażliwość klonów na ampicylinę, przesuwając klony równolegle na płytkach agarowych zawierających antybiotyki i wolnych od antybiotyków (ryc. 1). Zamrozić szczep wrażliwy na ampicylinę jako zapas glicerolu.

Results

Reprezentatywne wyniki trzech przykładów są pokazane na rysunkach od 4 do 6. Pierwsze podejście miało na celu usunięcie sąsiednich genów ctxA i ctxB. Razem kodują główny czynnik zjadliwości V. cholerae, toksynę. Zaprojektowaliśmy oligonukleotydy dla metody TransFLP zgodnie z powyższym opisem i rysunkiem 3. Szczep rodzicielski, szczep pośredni zawierający kasetę oporności na antybiotyki po flankach FRT w pierwotnym locus DNA ctxAB oraz szczep końcowy us...

Discussion

Metoda TransFLP opisana powyżej i w innych miejscach⁵ jest szeroko stosowana w naszym laboratorium. Do rodzajów manipulacji genetycznych, które są wykonalne, należą między innymi: delecja pojedynczych genów i klastrów genów, delecja wysp genomowych (np. VPI-1), insercja sekwencji przed genem będącym przedmiotem zainteresowania (np. sekwencje promotorowe) oraz insercja sekwencji na końcu określonego genu (np. kodowanie znaczników powinowactwa).

Warunkiem ws...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płatki chitynowe	Sigma	C9213	Wymagane autoklawowanie
OPCJONALNIE: Mikropulser (w przypadku, gdy kaseta z antybiotykiem powinna być wycinana przez rekombinazę Flp kodowaną na pBR-flp)	Biorad	165-2100	Lub porównywalne elektroporatory