TransFLP — Metoda genetycznej modyfikacji Vibrio cholerae oparta na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP

Podsumowanie

Opisano szybką metodę modyfikacji genomu V. cholerae. Modyfikacje te obejmują delecję pojedynczych genów, klastrów genowych i wysp genomicznych, a także integrację krótkich sekwencji (np. elementów promotora lub sekwencji znaczników powinowactwa). Metoda opiera się na naturalnej transformacji i rekombinacji FLP.

Streszczenie

Dostępnych jest kilka metod manipulacji chromosomami bakteryjnymi^1-3. Większość tych protokołów opiera się na insercji plazmidów replikujących się warunkowo (np. zawierających replikony zależne od białka pir lub wrażliwe na temperaturę^1,2). Plazmidy te są integrowane z chromosomami bakteryjnymi w oparciu o rekombinację zależną od homologii. Takie mutanty insercyjne są często bezpośrednio wykorzystywane w warunkach eksperymentalnych. Alternatywnie można przeprowadzić selekcję w kierunku wycięcia plazmidu, a następnie jego utraty, co w przypadku bakterii Gram-ujemnych często opiera się na kontraselektywnym enzymie lewan-sukrazie kodowanym przez gen sacB⁴. Wycięcie może albo przywrócić genotyp sprzed insercji, albo doprowadzić do wymiany między chromosomem a kopią zmodyfikowanego genu zakodowaną w plazmidzie. Wadą tej techniki jest to, że jest ona czasochłonna. Plazmid musi zostać najpierw sklonowany; wymaga on transferu horyzontalnego do V. cholerae (najczęściej poprzez kojenie z szczepem donorem E. coli) lub sztucznej transformacji tego ostatniego; ponadto wycięcie plazmidu jest losowe i może albo przywrócić pierwotny genotyp, albo stworzyć pożądaną modyfikację, jeśli nie zostanie zastosowana selekcja pozytywna. Przedstawiamy tutaj metodę szybkiej manipulacji chromosomem(ami) V. cholerae⁵ (Rysunek 1). Metoda TransFLP opiera się na niedawno odkrytej indukowanej chityną naturalnej kompetencji w tym organizmie⁶ oraz innych przedstawicielach rodzaju Vibrio, takich jak V. fischeri⁷. Naturalna kompetencja umożliwia pobieranie wolnego DNA, w tym fragmentów DNA generowanych metodą PCR. Po pobraniu DNA rekombinuje z chromosomem, pod warunkiem obecności minimum 250-500 bp flankujących regionów homologicznych⁸. Umieszczenie markera selekcyjnego pomiędzy tymi regionami flankującymi pozwala na łatwe wykrycie często występujących transformantów.

Metodę tę można stosować do różnych manipulacji genetycznych V. cholerae oraz potencjalnie innych bakterii naturalnie kompetentnych. Przedstawiamy trzy nowe przykłady tego, co można osiągnąć za pomocą tej metody, uzupełniając nasze wcześniej opublikowane badanie dotyczące delecji pojedynczych genów i dodawania sekwencji znaczników powinowactwa⁵. W niniejszym protokole TransFLP uwzględniono kilka kroków optymalizacyjnych w stosunku do pierwotnego protokołu naturalnej transformacji indukowanej chityną⁶. Obejmują one między innymi zastąpienie fragmentów pancerzy krabów komercyjnie dostępnymi płatkami chityny⁸, wykorzystanie DNA pochodzącego z PCR jako materiału transformującego⁹ oraz dodanie miejsc docelowych rekombinacji FLP (FRT)⁵. Miejsca FRT umożliwiają ukierunkowaną ekscyzję markera selekcyjnego opośredniczoną przez rekombinazę Flp¹⁰.

Protokół

Metoda TransFLP (Rysunek 1) została zilustrowana za pomocą trzech różnych podejść: I) delecji dwóch sąsiednich genów kodujących determinanty wirulencji V. cholerae (np. ΔctxAB); II) usunięcia wyspy patogenności (np. ΔVPI-1); oraz III) integracji sekwencji promotora zależnego od polimerazy RNA T7 powyżej genu zainteresowania, co następnie umożliwia jego sztuczną ekspresję w odpowiednim szczepie (np. T7-tfoX) (Rysunek 2).

1. Przygotowanie płatków chityny

1. Odważ 50-80 mg płatków chityny do standardowej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Można to przygotować w większej ilości. Płatki chityny są dostępne w sprzedaży od firmy Sigma (numer katalogowy C9213).
2. Zautoklawuj płatki, pozostawiając otwarte nakrętki probówek.
3. Natychmiast zamknij nakrętki po ostygnięciu autoklawu.
4. Przechowuj zautoklawowane płatki chityny w temperaturze pokojowej.

2. Opcjonalnie: Sztuczna transformacja V. cholerae plazmidem kodującym rekombinazę Flp

1. Przygotować elektrokompetentne komórki V. cholerae metodami standardowymi¹¹. Alikwoty kompetentnych komórek przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Do elektrokompetentnych komórek V. cholerae dodać 1-2 μl standardowej mini-preparacji plazmidu pBR-flp⁵ i przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji (szerokość przerwy 0,2 cm).
3. Przyłożyć impuls o napięciu 1,6 kV.
4. Dodać 0,9 ml pożywki SOC, a następnie delikatnie przenieść komórki do standardowej probówki o pojemności 14 ml. Inkubować bez mieszania przez 2,5 do 3 hr w temperaturze 30 °C.
5. Wysiać 100 μl oraz 300 μl na płytki LB zawierające 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
6. Oczyścić pojedynczy klon i przechowywać jako stok w glicerolu do przyszłych eksperymentów TransFLP.

3. Projektowanie oligonukleotydów i reakcja łańcuchowa polimerazy

1. Do amplifikacji regionu(ów) DNA zainteresowania oraz kasety antybiotykowej flankowanej sekwencjami FRT za pomocą PCR wymaganych jest co najmniej sześć oligonukleotydów (Rysunek 3). Zaleca się również uwzględnienie pary oligonukleotydów stanowiących primery na zewnątrz wstawionego fragmentu PCR. Pozwala to na sprawdzenie integracji oraz prawidłowego wycięcia kasety oporności na antybiotyk flankowanej sekwencjami FRT (np. przedstawione jako primery „chk-up” i „chk-down” na Rysunkach 3 do 5).
2. Oligonukleotydy #2, #3, #4 i #5 należy zaprojektować z należytą starannością. Powinny one zapewniać wystarczający annealing (np. ~28 bp) do matrycy DNA. Matrycą DNA dla primerów #2 i #5 jest genomowe DNA (gDNA), natomiast dla primerów #3 i #4 jest to plazmidowe DNA zawierające sekwencję FRT-Kan-FRT, takie jak pROD17¹² oraz pBR-FRT-KAN-FRT (niniejsze badanie) (Rysunek 3A).
3. Primery #2 do #5 należy zaprojektować tak, aby umożliwić rozległe parowanie zasad na ich końcach 5' odpowiednio pomiędzy #2 / #3 oraz #4 / #5 (Rysunek 3A, wstawka). Następnie przeprowadza się dwie rundy PCR.
4. W ramach 1^st rundy PCR należy przeprowadzić trzy niezależne reakcje. Pierwsza z nich posłuży do amplifikacji regionu powyżej (upstream) genu / regionu DNA zainteresowania przy użyciu oligonukleotydów #1 i #2. PCR powinien przynieść fragment o długości co najmniej 500 bp, aby umożliwić rekombinację homologiczną w komórkach. Krótsze fragmenty (~250 bp) mogą być wystarczające⁸, lecz nie są zalecane.
5. Równolegle należy przeprowadzić drugą reakcję PCR, która amplifikuje kasetę antybiotykową flankowaną sekwencjami FRT. W przedstawionych tutaj przykładach stosowano głównie aph (kan^R). Do tej reakcji należy użyć oligonukleotydów #3 i #4 (Rysunek 3A).
6. Jednocześnie za pomocą PCR należy amplifikować region DNA poniżej (downstream) (trzecia próbka). Fragment PCR powinien również mieć długość co najmniej 500 bp. Reakcję PCR należy przeprowadzić z gDNA jako matrycą oraz oligonukleotydami #5 i #6 (Rysunek 3A).
7. Po oczyszczeniu wszystkich trzech fragmentów PCR należy przeprowadzić 2^nd rundę PCR. Jako matrycę należy zastosować równą mieszaninę wszystkich trzech fragmentów otrzymanych w pierwszej rundzie. Amplifikacja jest katalizowana przez oligonukleotydy #1 i #6. Otrzymany fragment PCR (Rysunek 3B) służy jako DNA transformacyjne w eksperymencie transformacji naturalnej (Rysunek 1).

4. Naturalna transformacja indukowana chityną

1. Hodować komórki V. cholerae tlenowo w bogatej pożywce w temperaturze 30 °C, aż osiągną gęstość optyczną przy 600 nm wynoszącą około 0,5.
2. Zebrać bakterie poprzez wirowanie. Przemyć osad raz w zdefiniowanej pożywce sztucznej (DASW⁶) przed resuspensją komórek w 2 objętościach DASW. Dodać 1 ml hodowli do 50-80 mg sterylnych płatków chityny (wyjaśniono w punkcie 1). Jeśli bakterie posiadają plazmid pBR-flp (opcjonalny punkt 2), dodać do hodowli ampicylinę (50 μg/ml). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 16-24 hr bez mieszania.
3. Dodać ≥ 200 ng fragmentu uzyskanego z 2^nd-rundy PCR (wyjaśniono w punkcie 3). Wymieszać ostrożnie, aby nie odrywać nadmiernie bakterii od powierzchni chityny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 hr bez mieszania.
4. Intensywnie mieszać hodowlę na vortexie przez ≥ 30 sec. Wysiać 100-300 μl na selektywne płytki z podłożem LB (np. płytki LB zawierające kanamycynę lub gentamycynę dla przykładów przedstawionych tutaj). W przypadku bakterii posiadających plazmid pBR-flp użyć płytek z podwójną selekcją, dodając ampicylinę równocześnie z innymi antybiotykami. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 16-24 hr lub do momentu pojawienia się widocznych kolonii.
5. Wyizolować pojedyncze transformanty z płytek selektywnych. Transformanty te zastąpiły oryginalny locus chromosomowy fragmentem PCR w wyniku zdarzenia podwójnego crossing-over. Szczepy te można wykorzystać bezpośrednio w dalszych eksperymentach, jeśli usunięcie kasety antybiotykowej nie jest konieczne.

5. Usuwanie selektywnej kasety (kaset) poprzez rekombinację Flp

1. Przeprowadź sztuczną transformację transformantów plazmidem pBR-flp zgodnie z opisem w punkcie 2, jeśli nie zostało to zrobione przed testem transformacji naturalnej.
2. Hoduj bakterie na płytkach z agarem LB zawierającym ampicylinę w temperaturze 37 °C przez 16-24 hr. Opcje: zmień temperaturę na 40 °C na 2-3 hr, ponieważ ekspresja flp z plazmidu pBR-flp ulega derepresji w wyższych temperaturach^5,10; przenieś bakterie na świeże płytki po ok. 8 hr inkubacji.
3. Przeprowadź test wrażliwości na antybiotyki (zademonstrowany tutaj dla kanamycyny; Rysunek 1) poprzez równoległe ponowne wysiewanie kolonii na płytki agarowe z antybiotykiem i bez antybiotyku. Izoluj pojedyncze wrażliwe kolonie. Zamroź klon oporny na ampicylinę jako stok glicerolowy, jeśli zamierzasz dalej modyfikować szczep poprzez inne delecje/insercje za pomocą TransFLP.

6. Usuwanie plazmidów

1. Hodowlę inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 30 °C. Należy użyć pożywki bogatej bez dodatku antybiotyków.
2. Opcjonalnie: Hodować świeżą kulturę przez 3-6 h, rozcieńczając kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce bez antybiotyków.
3. Rozcieczenia hodowli wysiać metodą wylewną lub kreskową na zwykłe płytki z agarem LB i inkubować w temperaturze 30 °C przez 8-16 h (do momentu pojawienia się widocznych kolonii).
4. Przeprowadzić test wrażliwości klonów na ampicylinę, przesiewając klony równolegle na płytki z agarem z antybiotykiem oraz bez antybiotyku (Rysunek 1). Szczep wrażliwy na ampicylinę zamrozić w formie zapasu w glicerolu.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki trzech przykładów przedstawiono na rycinach 4 do 6. Pierwsze podejście miało na celu usunięcie sąsiednich genów ctxA oraz ctxB. Razem kodują one główny czynnik wirulencji V. cholerae, toksynę choleryczną. Zaprojektowaliśmy oligonukleotydy dla metody TransFLP, zgodnie z powyższym opisem i ryciną 3. Przebadano genotyp szczepu wyjściowego, szczepu pośredniego zawierającego flankowaną sekwencjami FRT kasetę oporności na antybiotyki w oryginal...

Dyskusja

Opisana powyżej oraz w innych publikacjach⁵ metoda TransFLP była szeroko stosowana w naszym laboratorium. Możliwe manipulacje genetyczne obejmują między innymi: delecję pojedynczych genów i klastrów genowych, delecję wysp genomicznych (np. VPI-1), insercję sekwencji powyżej genu zainteresowania (np. sekwencji promotorowych) oraz insercję sekwencji na końcu konkretnego genu (np. kodujących znaczniki powinowactwa).

Ważnym warunkiem wstępnym dla TransFLP jest...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płatki chityny	Sigma	C9213	Wymagane autoklawowanie
OPCJONALNIE: Mikropulser (w przypadku konieczności wycięcia kasety antybiotykowej przez rekombinazę Flp kodowaną na pBR-flp)	Biorad	165-2100	Lub porównywalne elektroporatory