Artykuł metodologiczny

Wykrywanie za pomocą GC pochodnych octowych aldonionitryli glukozaminy i kwasu muraminowego w celu oznaczenia pozostałości mikrobiologicznych w glebie

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3767

⸱

19 maja 2012

 ,  , 
1DOE-Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin, Madison, 3Department of Soil and Water Science, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół metody do analizy pochodnych octanu aldonitrylu glukozaminy i kwasu muraminowego ekstrahowanych z gleby za pomocą chromatografii gazowej (GC). W celu wyjaśnienia mechanizmu chemicznego przedstawiamy również strategię potwierdzenia struktury pochodnej oraz fragmentów jonowych powstających podczas jonizacji elektronowej.

Streszczenie

Ilościowe podejścia do charakterystyki mikroorganizmów są kluczowe dla szerszego zrozumienia stanu i funkcji drobnoustrojów w ekosystemach. Obecne strategie analizy mikrobiologicznej obejmują zarówno tradycyjne laboratoryjne techniki zależne od hodowli, jak i metody oparte na bezpośredniej ekstrakcji i oznaczeniu określonych biomarkerów1, 2. Niewiele z różnorodnych gatunków drobnoustrojów zasiedlających glebę nadaje się do hodowli, w związku z czym metody zależne od hodowli wprowadzają istotne obciążenia systematyczne, co jest ograniczeniem nie występującym w analizie biomarkerów.

Glukozamina, mannozamina, galaktozamina i kwas muraminowy są powszechnie stosowane jako wskaźniki zarówno żywej, jak i martwej biomasy mikrobowej, z czego glukozamina (najbardziej obfita) oraz kwas muraminowy (obecny wyłącznie w komórkach bakteryjnych) stanowią najważniejsze składniki w systemach glebowych3, 4. Jednak brak wiedzy na temat przeprowadzania analiz ogranicza powszechne rozpowszechnienie tej metody w środowisku naukowym. spośród wszystkich istniejących metod analitycznych, pochodniowanie do octanów aldononitryli z następującą po nim analizą metodą GC okazało się korzystną opcją pod względem optymalnego zrównoważenia precyzji, czułości, prostoty, dobrego rozdziału chromatograficznego oraz stabilności podczas przechowywania próbek5.

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół wiarygodnej i stosunkowo prostej analizy glukozaminy i kwasu muramowego z gleby po ich konwersji do octanów aldonitryli. Protokół składa się głównie z czterech etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania próbek, derywatyzacji oraz oznaczania metodą GC. Procedura krok po kroku została zmodyfikowana na podstawie wcześniejszych publikacji6, 7. Ponadto przedstawiamy strategię strukturalnej walidacji jonu molekularnego pochodnej oraz jego fragmentów jonowych powstałych podczas jonizacji elektronowej. Zastosowaliśmy metody GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS oraz odczynniki znakowane izotopowo, aby określić masę cząsteczkową derywatyzowanej glukozaminy i kwasu muramowego w formie octanów aldonitryli; przesunięcia masy pochodnych znakowanych izotopowo w widmie jonowym wykorzystaliśmy do zbadania fragmentów jonowych każdej z pochodnych8. Oprócz wyjaśnienia teoretycznego, walidacja jonu molekularnego pochodnej i jego fragmentów jonowych będzie przydatna badaczom wykorzystującym δ13C lub fragmenty jonowe tych biomarkerów w badaniach biogeochemicznych9, 10.

Protokół

1. Przygotowanie próbek i ekstrakcja kwasowa

  1. Liofilizować próbki gleby po pobraniu z terenu.
  2. Rozmieć i zhomogenizować próbki gleby za pomocą młyna kulowego, rozdrabniacza do gleby lub moździerza z tłuczkiem.
  3. Odważyć próbki gleby (zawierające > 0,3 mg N) do kolby hydrolizy o pojemności 25 mL.
  4. Dodać 10 mL 6M HCl do każdej kolby hydrolizy, napełnić kolby gazem N2 i szczelnie zamknąć.
  5. Hydrolizować w temperaturze 105 °C w inkubatorze przez 8 godzin, korzystając z automatycznego przełącznika czasowego.

2. Oczyszczanie próbek

  1. Wyjmij kolby z inkubatora i ostudź do temperatury pokojowej.
  2. Do każdej kolby dodaj 100 μL wewnętrznego standardu myo-inozytolu (1 mg mL-1 w wodzie); wymieszaj poprzez delikatne potrząsanie.
  3. Przygotuj plastikowe lejki odprowadzające ciecz do kolb gruszkowatych o pojemności 200 mL ze szlifami ST/NS 24/40, ustawiając je na plastikowych podstawkach dla stabilności.
  4. Złóż filtry jakościowe Whatman #2 (średnica 11 cm) w ćwiartki i umieść w lejkach.
  5. Zamieszaj zawartość każdej kolby po hydrolizie i przelej zawiesinę do lejka w celu przefiltrowania (każdą kolbę można dodatkowo przepłukać ~3 mL wody).
  6. Wysusz filtrat za pomocą ewaporatora rotacyjnego w temperaturze ~45 °C pod próżnią.
  7. Resztki z każdej kolby gruszkowatej resuspenduj w 3~5 mL wody (w razie potrzeby użyj kąpieli ultradźwiękowej) i przelej do teflonowej probówki o pojemności 40 mL; przepłucz kolbę drugą porcją wody.
  8. Dostrój pH do wartości 6,6 - 6,8 za pomocą 1M roztworu KOH, aby wytrącić jony metali i inne cząsteczki organiczne.
  9. Usuń osad poprzez wirowanie przy 2000 rcf przez 10 minut.
  10. Przelej nadsącz do szklanej probówki o pojemności 40 mL, zakryj otwór probówki parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, a następnie wykonaj otwory w parafilmie.
  11. Liofilizuj zamrożony nadsącz, aby usunąć cały płyn.
  12. Rozpuść pozostałość w 3 mL suchego metanolu, dokładnie mieszając w wstrząsaczu vortex (w razie potrzeby użyj kąpieli ultradźwiękowej); zakręć probówkę, a następnie wiruj przy 2000 rcf przez 10 minut, aby osadzić sole.
  13. Przenieś nadsącz do stożkowej probówki reakcyjnej o pojemności 3 mL; odparuj do suchości za pomocą urządzenia RapidVap w temperaturze 45 °C (lub, jeśli preferowane, pod łagodnym strumieniem suchego azotu).
  14. Do każdej probówki dodaj 100 μL standardu odzysku N-metyloglukaminy (1 mg mL-1 w wodzie) oraz 1 mL H2O, zakryj ujścia probówek parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, wykonaj perforację w parafilmie, a następnie poddaj liofilizacji.
  15. Przygotuj standardy: dodaj 100 μL kwasu muraminowego (0,5 mg mL-1 w metanolu), 100 μL glukozaminy (1 mg mL-1 w wodzie), 100 μL myo-inozytolu (1 mg mL-1 w wodzie), 100 μL N-metyloglukaminy (1 mg mL-1 w wodzie) oraz 1 mL H2O, każdą probówkę zakryj parafilmem, zamroź w temperaturze -20 °C, wykonaj perforację w parafilmie, a następnie poddaj liofilizacji.

3. Derywatyzacja

  1. Przygotować odczynnik do derywatyzacji zawierający 32 mg mL-1 chlorowodorku hydroksyloaminy oraz 40 mg mL-1 4-dimetyloaminopirydyny w mieszaninie pirydyna-metanol (4:1 v/v).
  2. Do każdej z probówek reakcyjnych dodać 300 μL odczynnika do derywatyzacji, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie.
  3. Probówki umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 75-80 °C na 35 minut (probówki muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec przedostawaniu się wody do wnętrza).
  4. Wyjąć probówki z łaźni wodnej i schłodzić do temperatury pokojowej.
  5. Do każdej z probówek reakcyjnych o pojemności 3 mL dodać 1 mL bezwodnika octowego, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać na wortexie, a następnie ponownie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 75-80 °C przez 25 minut.
  6. Wyjąć probówki z łaźni wodnej i schłodzić do temperatury pokojowej.

4. Separacja i pomiar

  1. Do każdej probówki dodać 1,5 mL dichlorometanu, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać w wortexie.
  2. Do każdej probówki dodać 1 mL 1M HCl, szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać w wortexie, a następnie pozostawić roztwory w spokoju do czasu rozdzielenia się dwóch faz; górną fazę (wodną) odessać i odrzucić, używając pipety o objętości 1000 μL.
  3. W ten sam sposób przeprowadzić ekstrakcję fazy organicznej 3 razy, lecz z użyciem 1 mL H2O (podczas ostatniego etapu przemywania należy zwrócić szczególną uwagę, aby usunąć całą górną fazę wodną).
  4. Odsuszyć końcowy roztwór za pomocą urządzenia RapidVap w temperaturze 45 °C (lub osuszyć azotem, jeśli jest to preferowane).
  5. Rozpuścić w 300 μL mieszaniny octanu etylu i heksanu (1:1 v/v), a następnie przenieść do bursztynowych probówek z nakrętką o pojemności 2 mL z wkładką do małych objętości i szczelnie zamknąć.
  6. W celu ilościowego oznaczenia przeprowadzić analizę metodą GC-FID, używając niepolarnej kapilarnej kolumny z topionego krzemienia: długość 30 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, grubość warstwy 0,25 μm; faza stacjonarna 5% fenylo-, 95% metylo-polysiloksan (DB-5 lub odpowiednik) z wodorem lub helem jako gazem nośnym, przy stałym przepływie 0,5 mL min-1. Chromatografia przebiega lepiej na wysokiej jakości fazach „inertywnych” i przy użyciu wodoru jako gazu nośnego, jednak wyniki są akceptowalne również dla powszechniejszych wariantów i przy użyciu helu. Parametry detektora wynoszą 300 °C; 400 mL min-1 powietrza oraz 30 mL min-1 dla gazów pomocniczych azotu i wodoru. Parametry wtrysku i temperatury pieca są następujące: wtrysk dzielony 1 μL (30:1) przy temperaturze wlotu GC 250 °C; początkowa temperatura pieca 120 °C; czas utrzymania 1 min.; wzrost temperatury pieca o 10 °C min-1 do 250 °C; czas utrzymania 2,5 min.; wzrost temperatury do 270 °C w tempie 20 °C min-1; czas utrzymania 2 min.; wzrost temperatury do 290 °C w tempie 20 °C min-1; czas utrzymania 5 min. Dostosować szybkość przepływu gazu nośnego tak, aby pochodne inozytolu, glukozaminy i kwasu muraminowego eluowały w 270 °C, a N-metyloglukamina eluowała w 270 °C.

5. Walidacja pochodnej

  1. Zastosuj miękką jonizację LC-ESI-TOF-MS w celu identyfikacji jonu cząsteczkowego i wyznaczenia masy cząsteczkowej pochodnej.
  2. W celu zwiększenia czułości wykorzystaj GC-EI-MS-SIM lub GC-EI-MSMS do badania wybranych jonów pochodnej.
  3. Do przygotowania pochodnych użyj wielu reagentów znakowanych izotopowo, a następnie wykorzystaj przesunięcie masy tych pochodnych znakowanych izotopowo w MS do analizy jonu cząsteczkowego i fragmentów jonowych.

6. Reprezentatywne wyniki

Protokół metody składa się głównie z czterech etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania próbki, derywatyzacji i oznaczenia metodą GC (Rysunek 1). Przykład analizy glukozaminy i kwasu muramowego z roztworów wzorcowych oraz z próbki gleby przedstawiono na Rysunku 2. Oprócz glukozaminy i kwasu muramowego za pomocą tej metody można jednocześnie oznaczyć mannozaminę i galaktozaminę (dwa izomery glukozaminy). Na podstawie czynników odpowiedzi standardów względem standardu wewnętrznego myo-inozytolu można wyznaczyć ilość tych biomarkerów w próbkach gleby. Standard odzysku został wykorzystany do jakościowego monitorowania procesu derywatyzacji. Schematy powstawania derywatów octowych aldonitryli glukozaminy i kwasu muramowego przedstawiono na Rysunku 3.

Proponowane struktury pochodnych określono za pomocą GC-EIMS-SIM w celu zwiększenia czułości lub LC-ESI-TOF-MS z miękką jonizacją8; proponowane struktury fragmentów jonowych powstałych podczas jonizacji elektronowej zbadano poprzez porównanie widm jonowych próbek przygotowanych z różnymi wbudowaniami izotopowymi11. Rysunek 4 przedstawia przesunięcie masy dominującego jonu m/z 187 acetylowanej pochodnej aldonitrylu glukozaminy w trzech scenariuszach, przygotowanych z nieznakowanymi odczynnikami, D-bezwodnikiem octowym oraz U-13C-glukozaminą. Po dalsze szczegółowe informacje i wyjaśnienia można odnieść się do naszych ostatnich publikacji8, 11. Strategia ta może służyć jako model do badania chemii pochodnych.

Schemat pomiarowy, proces ekstrakcji; metoda GC, etapy pochodnowania i oczyszczania.
Rysunek 1. Schemat pomiarowy protokołu analizy glukozaminy i kwasu muramowego w próbkach gleby. Protokół składa się z 4 głównych etapów: trawienia kwasowego, oczyszczania, pochodnowania oraz oznaczenia metodą GC.

Wykres chromatograficzny analizujący związki; standard w porównaniu z próbką gleby w celu obliczenia czynnika odpowiedzi.
Rycina 2. Chromatogramy GC-FID octanów aldononitryli inozytolu, glukozaminy, kwasu muraminowego, mannozaminy, galaktozaminy i metyloglukaminy dla standardów oraz gleby.

Mechanizm reakcji chemicznej; wzory strukturalne; synteza organiczna; schemat wieloetapowej transformacji.
Rysunek 3. Schematy tworzenia acetylowanych pochodnych aldonitryli glukozaminy i kwasu muraminowego. Numer 1 oznacza reakcję nitrylową. Numer 2 oznacza acetylację.

Widma spektrometrii mas; analiza fragmentów; schemat ze wzorami strukturalnymi i pikami molekularnymi.
Rycina 4. Widma mas pochodnej octowej aldononitrylu glukozaminy wraz z dominującymi strukturami jonów w trybie EI, przygotowanej przy użyciu (A) odczynników nieznakowanych, (B) anhydrydu D-octowego, (C) U-13C-glukozaminy. Gwiazdka oznacza atom ciężkiego izotopu lub grupę izotopową. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona metoda oparta na GC do analizy glukozaminy i kwasu muraminowego zderywowanych do octanu aldonionitrylu stanowi stosunkowo szybki sposób ilościowego oznaczenia tych cukrów aminowych wyekstrahowanych z gleby. Pochodne te są stabilne chemicznie i mogą być oznaczane w ramach jednej analizy. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do próbek gleby i może zostać uproszczona w przypadku próbek pochodzących z macierzy nieglebowych.

Pompa próżniowa użyta w tej metodzie jest odporna na dział...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana z grantów przyznanych przez DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER office of Science DE-FC02-07ER64494). Jesteśmy wdzięczni dr. Xudong Zhangowi oraz członkom jego grupy za pomocne dyskusje techniczne i nieocenione uwagi przy finalizacji protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas muraminowySigma-AldrichM2503-25MG
Chlorowodorek D-(+)-glukozaminySigma-AldrichG1514-100G
N-metylo-D-glukaminaSigma-AldrichM2004-500G
Myo-inozytolFisher ScientificA307003G025
Metanol (bezwodny)Acros OrganicsAC326950010
4-dimetyloaminopirydynaAcros OrganicsAC148270050
Octan etyluVWR internationalBJGC100-4
Chlorowodorek hydroksyloaminyFisher ScientificH330-100
PirydynaFisher ScientificP368-500
Bezwodnik octowyFisher ScientificA10-100
Dichlorometan (chlorek metylenu)Fisher ScientificD37-500
HeksanFisher ScientificH303-4
Kwas solny (6M)Fisher ScientificS456-4
Chlorowodorek hydroksyloaminy-15NIcon servicesIN5280
Bezwodnik octowy-2H (D6C4O3)Acros OrganicsAC174670050
D-glukoza-U-13CCambridge Isotope LaboratoriesCLM-1396-1
Siarczan amonu-15N Cambridge Isotope LaboratoriesNLM-713-1
Rapid-VapLabconco Corp.790002
Pompa próżniowaKNF NeubergerD-79112
Kolba do hydrolizyFisher Scientific06 423A
Mikrofiolka do derywatyzacjiFisher Scientific06-100E
GCHewlett-Packard6890
MSHewlett-Packard5972
LC-ESI-TOF-MSAgilent TechnologiesSystem HPLC serii Agilent 1200 połączony z Agilent LC/MSD-TOF

Bibliografia

  1. Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
  2. Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
  3. Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
  4. Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
  5. Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
  6. Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
  7. Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
  8. Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
  9. He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
  10. Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
  11. Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
  12. Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza glukozaminydetekcja kwasu muramowegopochodne octanu aldononitryluanaliza oparta na GCtrawienie kwasoweoczyszczanie pr bekekstrakcja ciecz cieczdetekcja przez jonizacj p omieniowodczynniki znakowane izotopowowalidacja strukturalna

Powiązane artykuły