$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Mikrofabrykowane urządzenia fluidyczne zapewniają dostępny mikrośrodowisko do badań in vivo na małych organizmach. Proste procesy fabrykacji urządzeń mikrofluidycznych są dostępne dzięki technikom soft litografii 1-3. Urządzenia mikrofluidyczne były wykorzystywane do obrazowania subkomórkowego 4,5, laserowej mikrochirurgii in vivo 2,6 oraz obrazowania komórkowego 4,7. Obrazowanie in vivo wymaga unieruchomienia organizmów. Osiągano to za pomocą ssania 5,8, kanałów zwężających się 6,7,9, odkształcalnych membran 2-4,10, ssania z dodatkowym chłodzeniem 5, gazów anestetycznych 11, żeli wrażliwych na temperaturę 12, kleju cyjanoakrylowego 13 oraz środków anestetycznych, takich jak lewamisol 14,15. Powszechnie stosowane środki anestetyczne wpływają na przekaźnictwo synaptyczne 16,17 i wiadomo, że mają szkodliwy wpływ na subkomórkowy transport neuronalny 4. W niniejszym badaniu prezentujemy urządzenie oparte na membranie z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), które pozwala na unieruchomienie bez użycia środków anestetycznych nienaruszonych genetycznych organizmów modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans), larwy Drosophila oraz larwy danio pręgowanego. Organizmy modelowe te nadają się do badań in vivo w urządzeniach mikrofluidycznych ze względu na ich niewielkie średnice oraz optycznie przezroczyste lub półprzezroczyste ciała. Średnice ciała wynoszą od ~10 μm do ~800 μm dla wczesnych stadiów larwalnych C. elegans oraz larw danio pręgowanego i wymagają urządzeń mikrofluidycznych o różnych rozmiarach w celu osiągnięcia pełnego unieruchomienia dla obrazowania time-lapse o wysokiej rozdzielczości. Organizmy te są unieruchamiane za pomocą ciśnienia przyłożonego przez sprężony azot przez kolumnę cieczy i obrazowane przy użyciu mikroskopu odwróconego. Zwierzęta uwolnione z pułapki powracają do normalnej lokomocji w ciągu 10 min.
Prezentujemy cztery zastosowania obrazowania poklatkowego u C. elegans, mianowicie: obrazowanie transportu mitochondriów w neuronach, transportu pęcherzyków presynaptycznych u mutanta z defektem transportu, transportu receptorów glutaminianu oraz podziału komórek neuroblastów Q. Dane uzyskane z takich filmów wykazują, że immobilizacja mikrofluidyczna jest użyteczną i dokładną metodą pozyskiwania danych in vivo dotyczących zdarzeń komórkowych i subkomórkowych w porównaniu do zwierząt poddanych anestezji (Rycina 1J i 3C-F 4).
Wymiary urządzenia zostały zmienione, aby umożliwić obrazowanie typu time-lapse różnych stadiów rozwoju C. elegans, larw Drosophila pierwszego stopnia oraz larw zebrafish. Transport pęcherzyków znakowanych synaptotagminą z GFP (syt.eGFP) w neuronach sensorycznych wykazuje ukierunkowany ruch markerów pęcherzyków synaptycznych ekspresowanych w cholinergicznych neuronach sensorycznych w nienaruszonych larwach Drosophila pierwszego stopnia. Podobne urządzenie zostało wykorzystane do przeprowadzenia obrazowania time-lapse pracy serca w larwach zebrafish około 30 h po zapłodnieniu (hpf). Dane te pokazują, że opracowane przez nas proste urządzenia mogą być zastosowane w różnych systemach modelowych do badania wielu zjawisk biologii komórki i rozwoju in vivo.