Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Opisujemy pierwszy protokół treningu wytrzymałościowego dla ważnego gatunku modelowego genetycznie, Drosophila melanogaster, oraz przedstawiamy kilka testów pozwalających monitorować poprawę mobilności po treningu.

Streszczenie

Jednym z najpilniejszych problemów, z jakimi mierzą się współcześni badacze medyczni, jest gwałtowny wzrost poziomu otyłości, a w konsekwencji wzrost liczby powiązanych z nią zaburzeń, takich jak cukrzyca i choroby układu sercowo-naczyniowego ^1-3. Ważnym obszarem badań nad tymi powiązanymi problemami zdrowotnymi jest rola ćwiczeń wytrzymałościowych jako korzystnej interwencji.

Trening fizyczny jest niedrogą, nieinwazyjną interwencją przynoszącą szereg korzystnych rezultatów, w tym redukcję nadmiaru tkanki tłuszczowej ⁴, zwiększenie wrażliwości mięśni szkieletowych na insulinę ⁵, nasilenie reakcji przeciwzapalnych i przeciwutleniających ⁶ oraz poprawę zdolności skurczowych kardiomiocytów ⁷. Wiadomo, że ćwiczenia o niskiej intensywności zwiększają aktywność i biogenezę mitochondriów u ludzi ⁸ oraz myszy, przy czym istotnym pośrednikiem jest koaktywator transkrypcyjny PGC1-α ^9,10.

Pomimo znaczenia aktywności fizycznej jako narzędzia do walki z wieloma istotnymi chorobami związanymi z wiekiem, rozległe podłużne badania genetyczne były utrudnione przez brak protokołu treningu wytrzymałościowego dla krótkożyjących gatunków modelowych. Różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych dla Drosophila, w połączeniu z krótką długością życia i niskimi kosztami utrzymania, czyni tę muszkę atrakcyjnym modelem do dalszego badania tych mechanizmów genetycznych. Mając to na uwadze, opracowaliśmy nowatorski aparat, znany jako Power Tower, do wielkoskalowego treningu fizycznego u Drosophila melanogaster ¹¹. Power Tower wykorzystuje instynktowną u muszek ujemną geotaksję do wielokrotnego indukowania szybkiego wspinania się. Za każdym razem, gdy maszyna podnosi, a następnie opuszcza platformę z muszkami, indukuje się ich wspinanie. Muszki reagują tak długo, jak maszyna jest w działaniu lub dopóki nie staną się zbyt zmęczone, by odpowiadać. Dzięki temu badacz może wykorzystać to urządzenie do jednoczesnego treningu dużych grup muszek w tym samym wieku i identycznych pod względem genetycznym. Dodatkowo opisujemy powiązane testy przydatne do monitorowania postępów podłużnych kohort muszek podczas treningu.

Protokół

1. Konfiguracja i obsługa Power Tower

1. Wieża zasilająca (Power Tower) jest umieszczona na prostokątnym kawałku sklejki przymocowanym zaciskami do stołu. Silnik przekładniowy o prędkości 4,5 rpm firmy Grainger opiera się na czterech deskach o wymiarach 2"x6" i jednej płycie ze sklejki o grubości ¾ cala. Silnik, regulator prędkości AC/DC, bezpiecznik oraz przełącznik włącz/wyłącz są połączone przewodami w puszce przyłączeniowej.
2. W celu chłodzenia silnika w pionowym kawałku sklejki o grubości ½ cala wycięto otwór o średnicy 3 cali. Po jednej stronie do sklejki przymocowano wentylator o średnicy 3 cali, a po drugiej metalowy cylinder o średnicy 3 cali.
3. Do silnika podłączono wykonane na zamówienie ramię obrotowe z zamontowanym na końcu rolkiem. Silnik wraz z przymocowanym ramieniem obracają się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, naciskając jedną stronę zgiętej profilowej rury kwadratowej o przekroju ¾ cala, która jest przymocowana do sklejki za pomocą zawiasu drzwiowego. Do górnej części profilu rury, poniżej platformy, przymocowano kółko, aby umożliwić jego toczenie się po platformie znajdującej się bezpośrednio nad nim.
4. Ramię naciska na jeden koniec profilu rury i unosi koniec przeciwległy, podnosząc dwupoziomową platformę (Rycina 1D). Gdy rolka na ramieniu mija profil rury, ramię może powrócić do pozycji wyjściowej, co powoduje opadnięcie platformy (Rycina 1F).
5. Platformy składają się z regałów umieszczonych na sklejce i zabezpieczonych linkami bungee zahaczonymi o śruby z oczkiem. Platformy przesuwają się w górę i w dół wzdłuż prowadnic szufladowych przymocowanych do sklejki za pomocą wsporników.
6. Fiolki umieszcza się w regałach i zabezpiecza kwadratową siatką przymocowaną linkami bungee.
7. Pod platformą umieszczono poduszkę ze styropianu, aby amortyzować wstrząs podczas opadania.
8. Moc silnika jest dostosowana w taki sposób, aby pełny okres obrotu trwał 15 sekund.

2. Protokół ćwiczeń

1. Muchy są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%, przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Zarówno trening wysiłkowy, jak i ocena wydolności fizycznej są przeprowadzane w pomieszczeniu z temperaturą kontrolowaną na poziomie 25 °C.
2. Muchy są zbierane i dobierane pod względem wieku z dokładnością do 1-2 dni. Do podłużnego monitorowania wytrzymałości oraz zdolności do negatywnej geotaksji (wspinania się) – dwóch wskaźników fizjologicznych odzwierciedlających efekty treningu – wymagane jest minimum 240 much. Monitorowanie podłużne pozwala wyizolować indukowane zmiany w stosunku do wartości początkowych dla każdej kohorty, eliminując zakłócenia wynikające z różnic między kohortami. Muchy do dodatkowych eksperymentów należy zbierać w zależności od potrzeb.
3. Po zebraniu muchy są dzielone na 120 osobników doświadczalnych, które zostaną poddane reżimowi treningowemu, oraz 120 osobników kontrolnych, które nie będą ćwiczyć. Muchy są przechowywane w fiolkach po 20 osobników każda. Fiolki z muchami doświadczalnymi są zatykane twardymi korkami z octanu celulozy (Flugs), a fiolki z muchami kontrolnymi (nietrenowanymi) są zatykane miękkimi gąbkowymi zatyczkami, które można docisnąć, aby unieruchomić muchy podczas przebywania na urządzeniu Power Tower. Gąbka jest stosowana do unieruchomienia, ponieważ jej elastyczny rozmiar umożliwia łatwe umieszczenie jej blisko dna fiolki. Miększy materiał gąbkowy ogranicza również urazy powodowane przez twardsze korki Flugs.
4. Muchy na urządzeniu Power Tower są przechowywane i trenowane w fiolkach zawierających 5 mL pożywki, co zapewnia im miękkie lądowanie w porównaniu do much trenowanych w pustych fiolkach. Pożywka składa się zazwyczaj z 10% sacharozy, 10% drożdży i 2% agaru w wodzie, choć nie zaobserwowano, aby muchy często żerowały w trakcie sesji treningowej. W przypadku użycia pustych fiolek podczas treningu, odsetek much ulegających urazom gwałtownie wzrasta.
5. Urządzenie Power Tower jest obsługiwane w pomieszczeniu z temperaturą kontrolowaną i utrzymywaną na poziomie 25 °C. Muchy doświadczalne są umieszczane na Power Tower i zmuszane do wspinania się. Muchy kontrolne są również umieszczane na Power Tower, ale gąbkowa zatyczka jest dociskana do fiolki na wysokość około 3 mm nad muchami w celu ograniczenia ich ruchu. Grupa ta służy jako kontrola dla wszelkich efektów wynikających z przebywania na urządzeniu Power Tower, które nie są związane z wysiłkiem fizycznym. Choć muchy te wciąż mają pewną przestrzeń do manewrowania, wielokrotnie obserwowano, że w tych warunkach poruszają się one bardzo mało i nie wykazują fizjologicznej odpowiedzi na wysiłek. Wskazane może być również włączenie dodatkowej grupy kontrolnej, która w ogóle nie jest umieszczana na urządzeniu Power Tower.
6. Muchy ćwiczą przez pięć kolejnych dni w każdym tygodniu, zgodnie z harmonogramem stopniowego zwiększania obciążenia (Rysunek 2). W pierwszym tygodniu muchy ćwiczą przez 2 godziny na sesję, w drugim tygodniu przez 2,5 godziny na sesję, a w trzecim tygodniu przez 3 godziny na sesję. Chociaż testowano inne reżimy, protokół ten daje spójne wyniki dla różnych genotypów i w zróżnicowanych warunkach. Protokół ten może być jednak modyfikowany na wiele sposobów, aby dostosować go do konkretnego eksperymentu.

3. Ćwiczenia fizyczne i zmęczenie lokomotoryczne

1. Czas do wystąpienia zmęczenia podczas wysiłku wytrzymałościowego jest użytecznym wskaźnikiem fizjologicznym służącym do potwierdzenia i/lub ilościowego określenia wydolności wysiłkowej danej kohorty. Testy zmęczeniowe mogą być prowadzone w sposób podłużny w kohortach, które zostaną wykorzystane w eksperymentach treningowych. Analizy mogą być przeprowadzane przed rozpoczęciem treningu, po zakończeniu protokołu treningowego lub w obu tych terminach. Jeśli istnieje potrzeba monitorowania postępów w trakcie treningu, można dodać inne punkty czasowe pośrednie. Test zmęczeniowy może być również wykorzystany do pomiaru wytrzymałości wysiłkowej w odpowiedzi na inne interwencje niż protokół treningowy, np. zmianę diety (Rysunek 3B).
2. Testy zmęczeniowe należy przeprowadzać w dniu, w którym nie odbywa się trening. Zarówno muchy eksperymentalne, jak i kontrolne, umieszcza się w fiolkach po 20 osobników w urządzeniu Power Tower i zmusza do wspinaczki aż do momentu zmęczenia. Zmęczenie definiuje się jako brak reakcji w postaci wspinania się na bodziec ujemnej geotaksji. Zachowanie zmęczeniowe jest oceniane poprzez obserwację wizualną.
3. Fiolkę z muchami uznaje się za „zmęczoną”, gdy 5 lub mniej much jest w stanie wspiąć się wyżej niż 2 cale podczas czterech kolejnych opadnięć. Zmęczone fiolki są usuwane z urządzenia Power Tower podczas jego pracy, a czas usunięcia zostaje odnotowany. Czasy usunięcia można przedstawić w formie histogramu zagnieżdżonego lub wykresu „czasu do wystąpienia zmęczenia” (time-to-failure). Przykład danych przedstawionych na wykresie „czasu do wystąpienia zmęczenia” pokazano na Rysunku 3B.
4. Fiolki są monitorowane w odstępach 10-minutowych przez maksymalnie 10 godzin (Rysunek 3B).

4. Ćwiczenia fizyczne, wiek a sprawność lokomotoryczna

1. Ponieważ niniejszy protokół treningowy opiera się na indukowanym zachowaniu biegowym, głównym testem służącym do ilościowego określenia efektów treningu jest podłużny pomiar zmiany średniej prędkości biegu w trakcie treningu. W trakcie treningu kohorty po 120 much (grupa ćwicząca i niećwicząca) są codziennie badane pod kątem reakcji na bodziec negatywnej geotaksji. Do pomiaru zdolności wspinaczkowych much stosuje się technikę RING opisaną przez Gargano i wsp. (2005) ¹². W skrócie technika ta mierzy średnią wysokość wspinaczki przebytej przez muchy w fiolce w określonym czasie po indukcji negatywnej geotaksji. Wysokość wspinaczki w określonym czasie jest równoważna prędkości wspinania się. Pomiary wykonuje się przed umieszczeniem much na urządzeniu do codziennego treningu, aby uniknąć komplikacji wynikających ze zmęczenia po dziennym biegu.
2. W naszym standardowym protokole muchy ćwiczą łącznie przez trzy tygodnie, a zdolność wspinania się jest badana przez łącznie pięć tygodni: trzy tygodnie podczas treningu wysiłkowego i dwa tygodnie po zakończeniu ćwiczeń (Rysunek 2). Pozwala to eksperymentatorowi określić, czy efekty ćwiczeń w zakresie mobilności utrzymują się po zakończeniu programu.
3. Do analizy zdolności wspinaczkowych wykorzystuje się cztery zdjęcia dziennych wyników RING każdej kohorty. Na każdym zdjęciu znajduje się sześć fiolek. Po indukcji negatywnej geotaksji, przy użyciu kamery z timerem, wykonuje się zdjęcie po określonej liczbie sekund. Zazwyczaj stosujemy dwie sekundy, choć czas ten można zmieniać w zależności od warunków eksperymentalnych. Dla każdego zdjęcia każda fiolka jest dzielona na cztery kwadranty o równej wysokości, a oprogramowanie do przetwarzania obrazu służy do przypisania każdej musze punktacji na podstawie kwadrantu, do którego dotarła w wyznaczonym czasie. Muchy, które wspinają się do najwyższego kwadrantu, otrzymują 4 punkty, muchy w kolejnym najwyższym kwadrancie otrzymują 3, muchy w drugim najwyższym kwadrancie otrzymują 2, a muchy w najniższym kwadrancie otrzymują 1. Muchom, które w ogóle nie wspinają się z dna, przypisuje się 0 punktów.
4. Dla każdej fiolki na danym zdjęciu generowany jest „indeks wspinaczkowy” poprzez wyciągnięcie średniej z punktacji wszystkich much w tej fiolce. Następnie indeksy każdej fiolki z czterech zdjęć są uśredniane, aby uzyskać ostateczny indeks wspinaczkowy na dany dzień.
5. Wszystkie eksperymenty z negatywną geotaksją są prowadzone podłużnie. Wyniki są normalizowane do początkowej punktacji „przed ćwiczeniami”, aby zredukować wpływ zmienności kohort w zdolności wspinania się i podkreślić względną zmianę podłużną zdolności wspinaczkowych kohorty w wyniku treningu wysiłkowego. Punktacja początkowa jest określana jako średnia z indeksów wspinaczkowych z pierwszych trzech dni i przyjmuje wartość 1. Kolejne próby są następnie wyrażane jako procent indeksu początkowego.

5. Reprezentatywne wyniki

Muchy typu dzikiego reagują na protokół wytrzymałościowy zmniejszeniem związanego z wiekiem spadku zdolności wspinania się, który utrzymuje się po zakończeniu treningu, co odzwierciedlają podłużne testy RING przeprowadzone w ciągu pięciu tygodni życia (Rycina 3A). To opóźnione obniżenie poziomu negatywnej geotaksji jest standardową odpowiedzią fenotypową, która może służyć jako kontrola pozytywna w celu upewnienia się, że odpowiedź na wysiłek u typu dzikiego przebiega prawidłowo. Zbiór danych ten przedstawiono jako przykład tego, w jaki sposób indukcja wysiłku za pomocą programu Power Tower może być wykorzystana jako bodziec behawioralny. Następnie można ocenić zdolność różnych czynników genetycznych lub środowiskowych do modulowania tego efektu.

Z drugiej strony, Power Tower może być również wykorzystywany jako parametr wyjściowy w różnych schematach eksperymentalnych. Na przykład można zmieniać genotyp, dietę lub inne warunki. Następnie, za pomocą Power Tower można przetestować wpływ tych zmiennych na fizjologię wysiłku. Poniżej przedstawiamy przykład takiego podejścia. Gdy w testach czasu do wyczerpania badano muchy o różnej zawartości sacharozy w diecie, zwiększona zawartość sacharozy korelowała ze zwiększoną wydolnością organizmu (Rycina 3B).

Rycina 1. Zasada działania Power Tower. (A-C) Zmotoryzowane zagięte ramię z przymocowanym rolkiem obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do momentu zetknięcia się z zagiętą kwadratową rurką. (D,E) Ramię naciska w dół na zagiętą kwadratową rurkę, co powoduje uniesienie platformy z fiolkami zawierającymi muszki. (F) Gdy ramię mija rurkę, platforma opada z powrotem, zmuszając muszki do powrotu na dno fiolki.

Rycina 2. Sugerowany protokół ćwiczeń. Muchy poddane protokołowi treningowemu ćwiczą przez pięć dni w tygodniu w ramach trzytygodniowego programu stopniowanego, w którym czas trwania ćwiczeń zwiększa się co tydzień o 30 minut, zaczynając od początkowych 2 godzin. Standardowe analizy obejmują testy zmęczenia przed i po programie ćwiczeń oraz testy RING od 1. do 5. tygodnia. Wszystkie analizy są wykonywane w dubletach na równej liczbie much niećwiczących jako kontroli negatywnej. W zależności od decyzji badacza można przeprowadzić inne testy fizjologiczne lub biochemiczne.

Rycina 3. Ćwiczenia wytrzymałościowe zmieniają wiele aspektów mobilności. (A) Testy RING przeprowadzone podłużnie w różnych grupach wiekowych w jednej parze kohort samców Y¹W^67C23. Codziennie mierzono średnią prędkość wspinania się u jednakowych pod względem wieku, genetycznie identycznych much ćwiczących oraz niećwiczących grup kontrolnych. Wyniki wyrażono w formie indeksu wspinania, który znormalizowano do średniej wysokości wspinania z pierwszych trzech dni pomiarów. Muchy trenowane wykazały mniejszy związany z wiekiem spadek zdolności do negatywnej geotaksji w porównaniu z jednakowymi pod względem wieku niećwiczącymi rodzeństwem w różnych grupach wiekowych (ANOVA 2-droginowa, p < 0.005). (B) Testy zmęczeniowe przeprowadzone przez 8 godzin na jednakowych pod względem wieku samic Canton S wykazują istotny wpływ zawartości sacharozy w diecie na czas do wystąpienia zmęczenia (test Log-rank, p < 0.0001). Przed eksperymentem muchy karmiono dietą drożdże/sacharoza/agar z 10% stężeniem drożdży (masa/objętość) i zmiennym procentem sacharozy w diecie. Dla każdej diety przetestowano pięć fiolek zawierających po 20 much. Wykres przedstawia liczbę fiolek, w których w danym punkcie czasowym wciąż biegło pięć lub więcej much. Wyniki te można traktować statystycznie i graficznie jako krzywą przeżycia (lub czas do wystąpienia awarii), gdzie „awarię” fiolki definiuje się jako punkt w czasie, w którym mniej niż pięć much nadal reaguje na bodziec negatywnej geotaksji. Należy zauważyć, że możliwe jest zastosowanie wielu innych projektów badań i metod statystycznych, a sposób przetwarzania i pomiaru danych powinien być dostosowany do indywidualnych celów.

Dyskusja

Ogólny protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu okazał się skuteczny w dokumentowaniu efektów fizjologicznych po treningu. Niemniej jednak, kilka etapów tego protokołu można modyfikować, aby dostosować je do konkretnych potrzeb eksperymentalnych. Na przykład, długość treningu oraz liczba sesji mogą zostać zmienione w celu zwiększenia lub zmniejszenia stopnia trudności programu, zależnie od potrzeb. Wysokość pojemnika, w którym mierzy się zdolność do negatywnej geotaksji, może zostać zmieniona, aby zwiększyć dostępny obszar do dokumentowania poprawy. Możliwe jest również zastosowanie różnych metod automatyzacji ilościowego pomiaru prędkości wspinania. W zasadzie każdy program komputerowy zdolny do odróżnienia muchy od tła może zostać wykorzystany w celu przyspieszenia procesu gromadzenia danych.

Niektóre aspekty protokołu należy jednak modyfikować z dużą ostrożnością. Na przykład wstępne eksperymenty silnie wskazują, że przynajmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu sprzyja większej poprawie niż nieustanny codzienny trening. Ponadto wiadomo, że rytmy okołodobowe i temperatura wpływają na aktywność zwierząt zimnokrwistych. Godzina treningu może być różna, ale powinna być zawsze stała w ramach porównywanych grup, aby uniknąć możliwości wystąpienia zakłócających efektów rytmów okołodobowych. Kontrola temperatury jest również niezbędna, dlatego zalecamy wydzielenie osobnego pomieszczenia o stałej temperaturze do przechowywania sprzętu treningowego. Na koniec, samce i samice muszą być hodowane i mierzone osobno, aby uniknąć potencjalnego wpływu różnic w płodności oraz wydolności fizycznej zależnej od płci.

Potencjalne zastosowania tej metodologii ogranicza jedynie wyobraźnia badacza. W ramach wstępnych prac wykorzystaliśmy tę metodologię w trzech szerokich zastosowaniach:

1. Pomiar wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na różne aspekty biologii typu dzikiego w różnym wieku.
2. Pomiar wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na specyficzne fenotypy mutantów.
3. Przesiewowe poszukiwanie czynników genetycznych niezbędnych do uzyskania korzyści płynących z ćwiczeń.

Każde z tych zastosowań obejmuje szeroki wachlarz konkretnych możliwości. Na podstawie naszych wstępnych doświadczeń fenotypy mutantów wykazują tendencję do zmienności w zależności od poziomu aktywności fizycznej w takim samym stopniu, w jakim zależą one od diety. Wykorzystanie modeli bezkręgowców do lepszego zrozumienia związku między dietą, ćwiczeniami a fizjologią starzenia się jest prawdopodobnie najważniejszym ogólnym zastosowaniem niniejszego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Silnik z przekładnią Dayton	Grainger	1LRA6A
Puszka elektryczna Raco	Grainger	5A052
Pokrywa Raco	Grainger	5A053
Bezpiecznik Cooper Bussmann	Grainger	6F043
Uchwyt bezpiecznika Cooper Bussmann	Grainger	1DD33
Przełącznik Carling Technologies	Grainger	2X464
Regulator prędkości AC/DC Dayton	Grainger	4X796
Zatyczki do wąskich probówek plastikowych	Genesee Scientific	49-102