Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydajności dla Drosophila melanogaster

Summary

Opisujemy pierwszy protokół treningu wytrzymałościowego dla ważnego gatunku modelu genetycznego, Drosophila melanogaster, i przedstawiamy kilka testów, aby nakreślić poprawę mobilności po treningu.

Abstract

Jednym z najbardziej palących problemów, przed którymi stoją współcześni badacze medyczni, jest rosnący poziom otyłości, a co za tym idzie wzrost powiązanych zaburzeń, takich jak cukrzyca i choroby układu krążenia ^1-3. Ważnym tematem badań nad tymi powiązanymi problemami zdrowotnymi jest rola ćwiczeń wytrzymałościowych jako korzystnej interwencji.

Trening fizyczny to niedroga, nieinwazyjna interwencja, która przynosi wiele korzystnych rezultatów, w tym redukcję nadmiaru tkanki tłuszczowej ⁴, zwiększoną wrażliwość na insulinę w mięśniach szkieletowych ⁵, zwiększoną reakcję przeciwzapalną i antyoksydacyjną ⁶ oraz poprawę zdolności kurczliwości kardiomiocytów ⁷. Wiadomo, że ćwiczenia o niskiej intensywności zwiększają aktywność mitochondriów i biogenezę u ludzi ⁸ i myszy, z koaktywatorem transkrypcji PGC1-α jako ważnym pośrednim ^9,10.

Pomimo znaczenia ćwiczeń jako narzędzia do walki z kilkoma ważnymi chorobami związanymi z wiekiem, obszerne badania genetyczne zostały utrudnione przez brak protokołu treningu wytrzymałościowego dla krótko żyjącego gatunku modelu genetycznego. Różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych do stosowania w przypadku Drosophila, wraz z jej krótką żywotnością i niedrogą konserwacją, sprawiają, że jest to atrakcyjny model do dalszych badań nad tymi mechanizmami genetycznymi. Mając to na uwadze, opracowaliśmy nowatorskie urządzenie, znane jako Power Tower, do ćwiczeń na dużą skalę u Drosophila melanogaster ¹¹. Power Tower wykorzystuje instynktowne negatywne zachowanie geotaksji much, aby powtarzalnie indukować szybkie wspinanie się. Za każdym razem, gdy maszyna podnosi się, a następnie opada, platforma much, muchy są nakłaniane do wspinania się. Muchy reagują tak długo, jak długo maszyna pracuje lub dopóki nie staną się zbyt zmęczone, aby zareagować. W ten sposób badacz może użyć tej maszyny do jednoczesnego szkolenia dużej liczby muszek w tym samym wieku i genetycznie identycznych. Dodatkowo opisujemy powiązane testy przydatne do śledzenia postępu podłużnego kohort much podczas treningu.

Protocol

1. Konfiguracja i obsługa wieży zasilającej

1. Wieża zasilająca jest umieszczona na prostokątnym kawałku sklejki, który jest przymocowany do stołu. Motoreduktor 4,5 obr./min firmy Grainger spoczywa na czterech płytach 2"x6" i jednej płycie ze sklejki 3/4 cala. Silnik, regulator prędkości AC/DC, bezpiecznik i włącznik/wyłącznik są połączone ze sobą w skrzynce połączeniowej.
2. Aby schłodzić silnik, otwór o średnicy 3 cali jest wycinany w pionowym kawałku sklejki o średnicy 1/2 cala. Z jednej strony do sklejki przymocowany jest 3-calowy wentylator, a z drugiej przymocowany jest metalowy cylinder o średnicy 3 cali.
3. Do silnika podłączone jest wykonane na zamówienie ramię obrotowe z rolką zamontowaną na końcu. Silnik i dołączone ramię obracają się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, dociskając jedną stronę wygiętej kwadratowej rurki o średnicy 3/4 cala, która jest przymocowana do sklejki za pomocą zawiasu drzwi. Koło jest przymocowane do górnej części rury pod platformą, aby umożliwić jej toczenie się po platformie, która znajduje się bezpośrednio nad nią.
4. Ramię naciska na jeden koniec rury i podnosi drugi koniec, podnosząc dwupoziomową platformę (rysunek 1D). Gdy rolka na ramieniu wyczyści materiał rury, umożliwia ramieniu powrót do pozycji wyjściowej, upuszczając platformę z powrotem w dół (Rysunek 1F).
5. Platformy składają się ze stojaków, które są umieszczone na wierzchu sklejki i zabezpieczone linkami bungee, które są zaczepione na oczkach śrubowych. Platformy przesuwają się w górę iw dół wzdłuż suwaków szuflad, które są przymocowane do sklejki za pomocą wsporników.
6. Fiolki są umieszczane w stojakach i zabezpieczane przez kwadratową siatkę, która jest utrzymywana na miejscu za pomocą linek bungee.
7. Pod platformą umieszczona jest poduszka styropianowa, która tłumi wstrząsy spowodowane upadkiem.
8. Moc silnika jest regulowana w taki sposób, aby pełny okres obrotu trwał 15 sekund.

2. Protokół ćwiczeń

1. Muchy są trzymane w inkubatorze o temperaturze 25 °C o wilgotności 50% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Zarówno trening fizyczny, jak i ocena wydolności wysiłkowej prowadzone są w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 25 °C.
2. Muchy są zbierane i dopasowywane do wieku w ciągu 1-2 dni od siebie. Do podłużnego monitorowania wytrzymałości i negatywnej zdolności geotaksji (wspinaczki) wymaganych jest co najmniej 240 much, dwóch wskaźników fizjologicznych, które odzwierciedlają efekty treningu fizycznego. Monitorowanie podłużne pozwala na izolację indukowanej zmiany w stosunku do wartości początkowych dla każdej kohorty, bez zakłócania skutków wynikających ze zmienności między kohortami. W razie potrzeby należy zbierać muchy do dodatkowych eksperymentów.
3. Po zebraniu muchy dzielą się na 120 much doświadczalnych, które zostaną poddane reżimowi ćwiczeń, oraz 120 much kontrolnych, które nie będą ćwiczone. Muchy są przechowywane w fiolkach po 20 much każda. Fiolki eksperymentalnych much są zatykane twardymi flugami z octanu celulozy, a fiolki much kontrolnych (niećwiczonych) są zatykane miękkimi korkami z gąbki, które można wcisnąć w dół, aby unieruchomić muchy podczas przebywania na Wieży Energetycznej. Gąbka służy do unieruchomienia, ponieważ jej adaptacyjny rozmiar umożliwia łatwe umieszczenie w pobliżu dna fiolki. Bardziej miękki materiał gąbki zmniejsza również obrażenia spowodowane przez bardziej solidne Flugs.
4. Muchy na Power Tower są przechowywane i ćwiczone w fiolkach zawierających 5 ml pokarmu, co zapewnia im bardziej miękkie lądowanie niż muchy ćwiczone w pustych fiolkach. Pokarm składa się zazwyczaj z 10% sacharozy, 10% drożdży i 2% agaru w wodzie, chociaż nie obserwujemy częstych posiłków much w trakcie sesji treningowej. Jeśli podczas treningu używa się pustych fiolek, odsetek much, które doznają urazów, znacznie wzrasta.
5. Wieża Power Tower jest eksploatowana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, która jest utrzymywana na poziomie 25 °C. Eksperymentalne muchy są umieszczane na Power Tower i zmuszane do wznoszenia się. Muchy kontrolne są również umieszczane na Power Tower, ale korek z gąbki jest wciskany do fiolki około 3 mm nad muchami, aby ograniczyć ruch. Ta grupa służy jako kontrola dla wszelkich efektów Wieży Mocy, które nie są związane z ćwiczeniami. Chociaż nadal istnieje pewne pole manewru dla tych much, wielokrotnie zaobserwowaliśmy, że muchy w tych warunkach biegają bardzo mało i nie wykazują fizjologicznej reakcji na ćwiczenia. Pożądane może być również dołączenie dodatkowej grupy kontrolnej, która w ogóle nie jest umieszczona na wieży zasilającej.
6. Muchy są ćwiczone przez pięć kolejnych dni w tygodniu, z wykorzystaniem napiętego harmonogramu (ryc. 2). W pierwszym tygodniu muchy ćwiczą przez 2 godziny na sesję, w drugim tygodniu przez 2,5 godziny na sesję, a w trzecim tygodniu przez 3 godziny na sesję. Chociaż przetestowano inne schematy, protokół ten daje spójne wyniki dla różnych genotypów i w rozbieżnych warunkach. Protokół ten podlega jednak szerokiej gamie możliwych wariantów, które mogą pasować do konkretnego eksperymentu.

3. Ćwiczenia i zmęczenie lokomotoryczne

1. Czas do zmęczenia podczas ćwiczeń wytrzymałościowych jest użytecznym wskaźnikiem fizjologicznym potwierdzającym i/lub ilościowym określanie wydolności wysiłkowej danej kohorty. Testy zmęczenia można przeprowadzać podłużnie na kohortach, które zostaną wykorzystane w eksperymentach szkoleniowych. Testy mogą być przeprowadzane albo przed szkoleniem, albo po zakończeniu protokołu szkolenia, albo w obu tych przypadkach. Inne pośrednie punkty czasowe można dodać, jeśli pożądane jest tworzenie wykresów przyrostowych postępów podczas treningu. Test zmęczenia może być również wykorzystany do pomiaru wytrzymałości wysiłkowej w odpowiedzi na zabiegi inne niż protokół treningowy, takie jak zmiana diety (ryc. 3B).
2. Testy zmęczenia należy przeprowadzać w dniu, w którym nie odbywa się trening. Zarówno eksperymentalne, jak i kontrolne muchy są umieszczane na Wieży Mocy w fiolkach po 20 sztuk każda i zmuszane do wspinania się aż do zmęczenia. Zmęczenie jest rozpoznawane jako brak reakcji na negatywny bodziec geotaksyjny zachowaniem wspinaczkowym. Zachowanie zmęczenia jest oceniane na podstawie obserwacji wzrokowej.
3. Fiolka much jest uważana za "zmęczoną", gdy 5 lub mniej much jest w stanie wspiąć się wyżej niż 2 cale przez cztery kolejne krople. Zmęczone fiolki są wyjmowane z wieży energetycznej, gdy jest ona nadal działająca, a czas wyjęcia jest rejestrowany. Czasy usunięcia można wykreślić jako zagnieżdżony histogram lub jako wykres "czasu do awarii". Przykład danych wykreślonych jako wykres "czasu do awarii" pokazano na rysunku 3B.
4. Fiolki są monitorowane w odstępach 10-minutowych przez maksymalnie 10 godzin (Rysunek 3B).

4. Ćwiczenia, wiek i zdolności lokomotoryczne

1. Ponieważ ten protokół treningowy opiera się na indukowanym zachowaniu podczas biegania, podstawowym testem do ilościowego pomiaru efektów treningu jest podłużny pomiar zmiany średniej prędkości biegu podczas treningu. W trakcie treningu kohorty 120 much ćwiczących i niećwiczonych są codziennie testowane pod kątem ich reakcji na negatywny bodziec geotaksyjny. Technika RING opisana w Gargano et al. (2005) jest używana do pomiaru zdolności much do wspinania się ¹². Krótko mówiąc, technika ta mierzy średnią wysokość, jaką pokonała fiolka z muchami w określonym czasie po indukcji ujemnej geotaksji. Wysokość pokonana w określonym czasie jest równoważna prędkości wznoszenia. Pomiary są wykonywane przed umieszczeniem much na maszynie do codziennego treningu, aby uniknąć komplikacji związanych ze zmęczeniem po całym dniu biegu.
2. W naszym standardowym protokole muchy są ćwiczone przez łącznie trzy tygodnie, a zdolność do wspinania się jest badana przez łącznie pięć tygodni: trzy tygodnie podczas treningu fizycznego i dwa tygodnie po zaprzestaniu ćwiczeń (ryc. 2). Pozwala to eksperymentatorowi na sporządzenie wykresu, czy wpływ ćwiczeń na mobilność utrzymuje się po zaprzestaniu programu.
3. Do analizy zdolności wspinaczkowych wykorzystywane są cztery fotografie przedstawiające dzienne wyniki każdej kohorty w RING. Na każdym zdjęciu znajduje się sześć fiolek. Wywoływana jest geotaksja ujemna, a za pomocą aparatu z pomiarem czasu wykonywane jest zdjęcie po określonej liczbie sekund. Zazwyczaj używamy dwóch sekund, chociaż może się to zmieniać w zależności od warunków eksperymentalnych. Dla każdej fotografii każda fiolka jest dzielona na cztery ćwiartki o równej wysokości, a oprogramowanie do przetwarzania obrazu jest używane do przypisania każdej muchy wyniku na podstawie kwadrantu, który osiągnęła w wyznaczonym okresie czasu. Muchy, które wspinają się do najwyższego kwadrantu, otrzymują wynik 4, muchy z następnego najwyższego kwadrantu otrzymują 3, muchy z drugiego najwyższego kwadrantu otrzymują 2, a muchy z najniższego kwadrantu otrzymują 1. Muchy, które w ogóle nie odrywają się od dna, otrzymują wynik 0.
4. Dla każdej fiolki na danym zdjęciu generowany jest "indeks wspinaczkowy" poprzez uśrednienie wyników wszystkich much w owej fiolce. Wskaźniki każdej fiolki z czterech fotografii są następnie uśredniane, aby uzyskać ostateczny indeks wzrostowy dla tego dnia.
5. Wszystkie negatywne eksperymenty geotaksyjne są przeprowadzane podłużnie. Wyniki są normalizowane do początkowego wyniku "przed ćwiczeniami" w celu zmniejszenia wpływu zmienności kohorty na zdolność wspinania się i podkreślenia względnej zmiany podłużnej zdolności wspinaczkowej kohorty w wyniku treningu fizycznego. Początkowy wynik jest określany na podstawie średniej wskaźników wzrostowych z pierwszych trzech dni i przypisuje mu się wartość 1. Kolejne próby są następnie wyrażane jako procent początkowego wskaźnika.

5. Reprezentatywne wyniki

Muchy typu dzikiego reagują na protokół wytrzymałościowy zmniejszonym związanym z wiekiem spadkiem zdolności wspinaczkowych, który utrzymuje się po zakończeniu treningu, co znajduje odzwierciedlenie w podłużnych testach RING w wieku pięciu tygodni (Rysunek 3A). Ten opóźniony spadek ujemnej geotaksji jest standardową reakcją fenotypową, która może służyć jako kontrola pozytywna, aby zapewnić, że reakcja na wysiłek fizyczny typu dzikiego przebiega normalnie. Ten zestaw danych jest przedstawiony jako przykład tego, w jaki sposób indukcja ćwiczeń przez program Power Tower może być wykorzystana jako dane wejściowe zachowania. Następnie można ocenić zdolność różnych czynników genetycznych lub środowiskowych do modulowania tego efektu.

Na odwrót, Power Tower może być również używany jako wyjście w różnych eksperymentalnych projektach. Na przykład genotyp, dieta lub inne warunki mogą być zróżnicowane. Następnie wpływ tych zmian na fizjologię ćwiczeń można przetestować za pomocą Power Tower. Tutaj pokazujemy przykład takiego podejścia. Kiedy muchy z różnym procentem sacharozy w diecie były testowane pod kątem czasu do zmęczenia, zwiększona zawartość sacharozy korelowała ze zwiększoną zdolnością wytrzymałościową (Figura 3B).

Rysunek 1. Eksploatacja wieży energetycznej. (A-C) Zmotoryzowane wygięte ramię z dołączoną rolką obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż zetknie się z wygiętą kwadratową rurą. (D,E) Ramię naciska na wygiętą kwadratową rurkę, powodując uniesienie się platformy załadowanej fiolkami z muchami. (F) Gdy ramię opuszcza probówkę, platforma może opaść z powrotem w dół, zmuszając muchy do powrotu na dno fiolki.

Rysunek 2. Sugerowany protokół ćwiczeń. Muchy poddane protokołowi treningowemu są zmuszane do ćwiczeń przez pięć dni w tygodniu pod trzytygodniowym schematem, który stopniowo wydłuża czas trwania ćwiczeń z początkowych 2 godzin do 30 minut każdego tygodnia. Standardowe analizy obejmują testy zmęczenia przed i po programie ćwiczeń oraz testy RING od 1. tygodnia do 5. tygodnia. Wszystkie testy przeprowadza się w dwóch egzemplarzach na takiej samej liczbie niećwiczonych much jako kontrolę ujemną. Można przeprowadzić inne różne testy fizjologiczne lub biochemiczne zgodnie z ustaleniami badacza.

Rysunek 3. Ćwiczenia wytrzymałościowe zmieniają wiele aspektów mobilności. (A) Testy RING przeprowadzone podłużnie w różnych grupach wiekowych w jednej parze kohort męskich Y¹W^67C23. Dopasowane do wieku, genetycznie identyczne ćwiczone i niećwiczone muchy kontrolne były mierzone codziennie pod kątem średniej prędkości wznoszenia. Wyniki są wyrażone w postaci wskaźnika wspinaczki, który jest znormalizowany do średniej wysokości wspinaczki w ciągu pierwszych trzech dni pomiaru. Muchy wytrenowane wysiłkowo wykazywały zmniejszony związany z wiekiem spadek negatywnej zdolności geotaksji w porównaniu z niećwiczonym rodzeństwem w różnym wieku (2-way ANOVA, p < 0,005). (B) Testy zmęczenia przeprowadzane przez 8 godzin na samicach much Canton S w tym samym wieku wykazują znaczący wpływ zawartości sacharozy w diecie na czas do zmęczenia (Log-rank, p < 0,0001). Przed eksperymentem muchy były karmione dietą drożdżową/sacharozowo-agarową, z 10% stężeniem wagowym/objętościowym drożdży i różnym procentem sacharozy w diecie. Pięć fiolek po 20 much każda zostało przetestowanych dla każdej diety. Wykres pokazuje, ile fiolek ma jeszcze pięć lub więcej much uruchomionych w danym punkcie czasowym. Wyniki te można traktować statystycznie i graficznie jako krzywą przeżycia (lub czasu do niepowodzenia), przy czym "niepowodzenie" dla fiolki definiuje się jako punkt w czasie, w którym mniej niż pięć much nadal reaguje na negatywny bodziec geotaksyjny. Należy pamiętać, że możliwych jest wiele innych projektów badań i zabiegów statystycznych, a przetwarzanie danych i pomiary powinny być dostosowane do indywidualnych celów.

Discussion

Przedstawiony tutaj ogólny protokół okazał się skuteczny w dokumentowaniu efektów fizjologicznych po treningu. Jednak kilka obszarów w tym protokole podlega modyfikacji w celu dopasowania do konkretnych potrzeb eksperymentalnych. Na przykład długość treningu i liczba walk mogą być potencjalnie zróżnicowane, aby program był mniej lub bardziej wymagający, zgodnie z życzeniem. Wysokość kontenera, w którym mierzona jest ujemna zdolność geotaksji, może zostać zmieniona w celu zwiększenia dostępnego obszaru do udokumentowania. Zastosowanie mogą mieć również różne metody automatyzacji ilościowego oznaczania prędkości wznoszenia. W zasadzie każdy program zdolny do odróżnienia muchy od tła może być użyty do przyspieszenia procesu gromadzenia danych.

Niektóre aspekty protokołu powinny być jednak modyfikowane tylko z dużą ostrożnością. Na przykład wstępne eksperymenty zdecydowanie wskazują, że co najmniej jeden dzień odpoczynku w tygodniu ułatwia większą poprawę niż nieustanne codzienne ćwiczenia. Ponadto wiadomo, że rytmy okołodobowe i temperatura wpływają na ruch zwierząt zmiennocieplnych. Pora dnia, w której odbywa się trening, może być zróżnicowana, ale zawsze powinna być spójna w obrębie poszczególnych porównywanych grup, aby uniknąć możliwości zakłóconego wpływu rytmów okołodobowych. Niezbędna jest również kontrola temperatury, w której zalecamy wydzielone pomieszczenie o stałej temperaturze do przechowywania sprzętu do ćwiczeń. Wreszcie, samce i samice muszą być hodowane i mierzone oddzielnie, aby uniknąć potencjalnego zakłócającego wpływu różnic w zdolności wysiłkowej płodności i płci.

Potencjalne zastosowania tej metodologii są ograniczone jedynie wyobraźnią badacza. W pracach wstępnych wykorzystaliśmy tę metodologię w trzech szerokich zastosowaniach:

1. Zmierzenie wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na różne aspekty biologii dzikiego typu na przestrzeni wieków.
2. Pomiar wpływu ćwiczeń wytrzymałościowych na określone zmutowane fenotypy.
3. Badanie przesiewowe pod kątem czynników genetycznych, które są niezbędne do czerpania korzyści z ćwiczeń.

Każda z tych aplikacji obejmuje szeroką gamę specyficznych możliwości. Opierając się na naszym wstępnym doświadczeniu, zmutowane fenotypy mają tendencję do zmieniania się w zależności od poziomu ćwiczeń w takim samym stopniu, jak różnią się w zależności od diety. Wykorzystanie modeli bezkręgowców w celu lepszego zrozumienia związku między dietą, ćwiczeniami i fizjologią starzenia się jest prawdopodobnie najważniejszym ogólnym zastosowaniem tego protokołu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motoreduktor Dayton	Grainger	1LRA6A Raco Skrzynka
elektryczna	Grainger	5A052
Pokrywa Raco	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Bezpiecznik	Grainger	6F043
Uchwyt bezpiecznika Cooper Bussmann	Grainger	1DD33
Carling Technologies Przełącznik	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC	Speed Grainger	4X796
Flugs do wąskich plastikowych fiolek	Genesee Scientific	49-102