Protokół długotrwałej hipertermii całego ciała u myszy

1. Etyka zwierząt

Zanim przeprowadzisz długotrwałą hipertermię na myszach, upewnij się, że procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Wszystkie procedury omówione w tym artykule i pokazane w dołączonym filmie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Narodowego Instytutu Immunologii.

2. Zrozumienie hipertermii

Hipertermia całego ciała (WBH) jest dostarczana poprzez umieszczenie zwierząt w wstępnie ogrzanych klatkach, które są umieszczane w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 39,5°C. Podczas standaryzacji protokołu myszom chirurgicznie wszczepiono czujnik temperatury, a ich temperaturę ciała monitorowano w różnych warunkach eksperymentalnych. Zaobserwowano, że po umieszczeniu zwierząt w gorącym otoczeniu ich temperatura stopniowo wzrastała z 37 °C do do 42 °C w ciągu 100 minut (ryc. 1). Wynikający z tego "skok" temperatury jest intrygujący, ponieważ wewnętrzna temperatura ciała wystrzeliła nawet wyżej niż zewnętrzna temperatura otoczenia.

Gdy temperatura ciała przekroczyła 40 °C, zwierzę wykazywało oznaki stresu i odwodnienia, takie jak moczenie wokół pyska. Wzrost temperatury ciała powyżej 40 °C doprowadzi do zmoczenia i nieodwracalnego stresu, a nawet śmierci zwierząt z powodu stresu cieplnego. Dlatego ważne jest, aby zapobiegać skokom temperatury w trakcie hipertermii.

To zjawisko wysokich skoków temperatury jest związane z fizyczną nadpobudliwością zwierzęcia podczas ekspozycji na hipertermię. Podobne skoki temperatury zaobserwowano również w innych grupach i były one związane z fizyczną nadpobudliwością zwierzęcia po wprowadzeniu do środowiska o wyższych temperaturach ¹⁰.

W naszym protokole, myszy są unieruchomione podczas ekspozycji na hipertermię. Jak pokazano na rysunku 2, unieruchomienie zwierzęcia zapobiega skokom temperatury.

Użyliśmy 8-12 tygodniowych myszy BALB/Cj do zademonstrowania tego protokołu. Protokół nie jest ograniczony do konkretnego typu/szczepu myszy.

3. Przygotowanie do eksperymentu

3.1 Inkubator

Ten eksperyment można przeprowadzić w normalnym inkubatorze_CO2, ponieważ mają one dobrą kontrolę temperatury. Odłączyć dopływ gazu CO₂ i wyjąć tackę na wodę z inkubatora CO₂ . W niektórych modelach inkubatorów istnieje możliwość wyłączenia regulatora CO₂ . Ułóż półki inkubatora tak, aby w środku można było wygodnie umieścić klatkę dla myszy. Ustawić temperaturę inkubatora na 39,5 °C.

3.2 Klatki

Zazwyczaj eksperyment z hipertermią przeprowadza się na 4 myszach jednocześnie. Wymagane są dwie klatki; Jeden umieszcza się wewnątrz inkubatora, a drugi na zewnątrz w temperaturze pokojowej. Unika się ściółkowania klatek, ponieważ plamy ściółki z czasem stają się mokre, co skutkuje nierównomierną temperaturą wewnątrz klatki. W zewnętrznej klatce powinny znajdować się granulki żywności i butelka z wodą.

3.3 Rurki unieruchamiające myszy

Podczas pierwszych 4 cykli hipertermii myszy są unieruchomione w perforowanych rurkach. Te probówki unieruchamiające mogą być wykonane z probówek "wirówkowych" o pojemności 50 ml poprzez przekłucie 3 mm otworów na całym korpusie i wymagane będą cztery takie probówki. Tubka o pojemności 50 ml może wygodnie unieruchomić myszy BALB/Cj, które są starsze niż 8 tygodni. Probówki o odpowiednich rozmiarach mogą być wymagane dla niektórych niezwykle różnych szczepów myszy lub dla myszy, które są bardzo młode lub starsze niż 50 tygodni.

Umieść rurki do unieruchamiania i klatkę wewnątrz inkubatora utrzymywane w temperaturze 39,5 °C. Poczekaj co najmniej 2 godziny, aby klatka i rurki unieruchamiające osiągnęły temperaturę inkubatora.

4. Pierwszy cykl hipertermii

Myszy mogą doświadczyć odwodnienia podczas ekspozycji na hipertermię. Dlatego przed rozpoczęciem eksperymentu należy podać dootrzewnowo 0,5 ml soli fizjologicznej dootrzewnowej. Użyć igły 26 G ze strzykawką o pojemności 1 ml.

Szybko wyjmij klatkę umieszczoną w inkubatorze, umieść po jednym zwierzęciu w każdej probówce unieruchamiającej i umieść klatkę z powrotem w inkubatorze. Zapisz czas. Bardzo ważne jest, aby klatka znajdowała się za każdym razem w tym samym miejscu w inkubatorze.

Po 90 minutach wyjmij klatkę z inkubatora. Uwolnij zwierzęta z rurek unieruchamiających i umieść je w klatce o normalnej temperaturze z łatwym dostępem do jedzenia i wody. Umieścić puste probówki unieruchamiające z powrotem w inkubatorze.

Po 15 minutach, rozpoczyna się drugi cykl hipertermii, podając dootrzewnowo 0,5 ml soli fizjologicznej każdej myszy.

Następnie są unieruchamiani w 50 ml perforowanych probówkach do unieruchamiania i umieszczani w inkubatorze.

5. Kolejne cykle hipertermii

Przez pierwsze 4 cykle konieczne jest unieruchomienie myszy podczas ekspozycji na hipertermię, a przez pierwsze dwa cykle, zastrzyk soli fizjologicznej jest podawany przed rozpoczęciem okresu hipertermii.

Po zakończeniu tych cykli hipertermii, po których następuje odpoczynek, myszy aklimatyzują się i nie stają się nadpobudliwe podczas ekspozycji na hipertermię. Dootrzewnowe wstrzyknięcie soli fizjologicznej może nie być konieczne, jeśli myszy chętnie przyjmują pokarm i wodę w czasie spoczynku.

6. Po zakończeniu wszystkich cykli, ostatnim krokiem jest zbadanie zwierząt

Podczas cykli hipertermii nie powinno być żadnej śmierci. Każde zwierzę musi być bardzo uważnie obserwowane w pierwszych kilku cyklach. Szybko poszukaj zamoczeń wokół pyska. Ten objaw jest sygnaturą odwodnienia. Myszom z takimi objawami należy natychmiast podać 0,5 ml soli fizjologicznej i odpoczywać w temperaturze pokojowej. Większość unieruchomionych myszy nie będzie wymagała dodatkowej opieki i z powodzeniem zniesie stres związany z hipertermią.

Po zakończeniu wymaganych cykli, zwierzęta mogą wyglądać na słabe i odwodnione, ale szybko zregenerują się w ciągu kilku godzin.

Rysunek 1. Zmiana temperatury głębokiej ciała myszy, gdy klatka została umieszczona w inkubatorze w temperaturze 39,5 °C. Po 90 minutach klatkę wyjęto z inkubatora i umieszczono w temperaturze 25 °C. Czerwone kółka wskazują na wysokie skoki temperatury.

Rysunek 2. Zmiana temperatury głębokiej ciała unieruchomionych myszy podczas cykli hipertermii. Po unieruchomieniu zwierzęcia nie zaobserwowano skoków wysokich temperatur, gdy klatka została umieszczona w temperaturze 39,5 °C.

Nie mamy nic do ujawnienia.