Monitorowanie redukcyjnych i oksydacyjnych półreakcji monooksygenazy zależnej od flawiny za pomocą spektrofotometrii z zatrzymanym przepływem

Summary

Opisujemy użycie przyrządu do badania zarówno redukcyjnych, jak i oksydacyjnych reakcji połowicznych Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA), monooksygenazy zależnej od flawiny. Następnie pokazujemy widma odpowiadające gatunkom w reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Abstract

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) to monooksygenaza zawierająca FAD, która katalizuje hydroksylację ornityny w biosyntezie sideroforów hydroksamianowych, które są niezbędne do wirulencji (np. ferrykrokyna lub N',N",N'''-triacetylofuzarynina C)¹. Reakcję katalizowaną przez SidA można podzielić na półreakcje redukcyjne i utleniające (schemat 1). W redukcyjnej półreakcji utleniony FAD związany z Af SidA jest redukowany przez NADPH^2,3. W półreakcji utleniania zredukowany kofaktor reaguje z tlenem cząsteczkowym, tworząc produkt pośredni C4a-hydroperoksyflawiny, który przenosi atom tlenu do ornityny. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru szybkości i wykrywania różnych form spektralnych SidA za pomocą przyrządu z zatrzymanym przepływem zainstalowanego w beztlenowej komorze rękawicowej. W przyrządzie z zatrzymanym przepływem małe objętości reagentów są szybko mieszane, a po zatrzymaniu przepływu przez strzykawkę zatrzymującą (rysunek 1) rejestrowane są zmiany spektralne roztworu umieszczonego w komórce obserwacyjnej w czasie. W pierwszej części eksperymentu pokazujemy, w jaki sposób możemy używać przyrządu do zatrzymania przepływu w trybie pojedynczym, w którym bezpośrednio mierzy się beztlenową redukcję flawiny w Af SidA przez NADPH. Następnie używamy ustawień podwójnego mieszania, w których Af SidA jest najpierw beztlenowo redukowany przez NADPH przez określony czas w pętli starzenia, a następnie reaguje z tlenem cząsteczkowym w komórce obserwacyjnej (ryc. 1). Aby przeprowadzić ten eksperyment, konieczne są beztlenowe, ponieważ gdy monitorowana jest tylko redukcyjna półreakcja, cały tlen w roztworach zareaguje ze zredukowanym kofaktorem flawiny i utworzy półprodukt C4a-hydroperoksyflawiny, który ostatecznie rozpadnie się z powrotem na utlenioną flawinę. Nie pozwoliłoby to użytkownikowi na dokładne zmierzenie szybkości redukcji, ponieważ nastąpiłaby całkowita rotacja enzymu. Gdy badana jest półreakcja utleniania, enzym musi być redukowany przy braku tlenu, tak aby obserwowane były tylko etapy między redukcją a utlenianiem. Jeden z użytych w tym eksperymencie jest nasycony tlenem, dzięki czemu możemy badać półreakcję utleniania przy wyższych stężeniach tlenu. Są to często procedury przeprowadzane podczas badania redukcyjnych lub oksydacyjnych półreakcji z monooksygenazami zawierającymi flawiny. Skala czasowa eksperymentów w stanie wstępnym przeprowadzonym przy zatrzymanym przepływie wynosi od milisekund do sekund, co pozwala na wyznaczenie wewnętrznych stałych szybkości oraz wykrycie i identyfikację produktów pośrednich w reakcji⁴. Opisane tutaj procedury można zastosować do innych monooksygenaz zależnych od flawin. ^5,6 TGL

Protocol

1. Przygotowanie buforu beztlenowego

1. Przygotować 1 l 100 mM buforu fosforanu potasu o pH 7,5. Wlać 250 ml buforu do 500-mililitrowej kolby Büchnera z mieszadłem.
2. Uszczelnić kolbę gumowym korkiem i umieścić ją na płytce mieszającej. Podłączyć krótką rurkę kolby do przewodu Schlenka.
3. Odgazować bufor w próżni przez 5 godzin w temperaturze pokojowej z mieszaniem. W tym czasie co godzinę wykonuj 5 kolejnych rund odgazowywania próżniowego i płukania argonem.
4. Przepłukać kolbę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić kolbę w schowku na rękawiczki.
5. Pozostawić na noc otwartą kolbę w schowku na rękawiczki, energicznie mieszając.

2. Usuwanie tlenu z systemu zatrzymanego przepływu

1. Przygotować 1 l 0,1 M octanu sodu o pH 5,0. Wlać 125 ml tego buforu do kolby Büchnera o pojemności 250 ml i wykonać czynności 1.2-1.4.
2. Odważyć 5 mg oksydazy glukozowej z Aspergillus niger (181300 j./g) i 0,9 g glukozy, używając odpowiednio 1,5 ml probówki Eppendorfa i 50 ml probówki stożkowej Falcon. Umieść oba pojemniki w schowku na rękawiczki.
3. Rozpuścić oksydazę glukozową i glukozę w 50 ml beztlenowego 0,1 M octanu sodu o pH 5,0 (końcowe stężenia odpowiednio 18,13 U/ml i 100 mM). Napełnić strzykawki z zbiornikiem tym roztworem (Rysunek 1).
4. Upewnij się, że zawory napędowe znajdują się w pozycji "obciążenia" i napełnij strzykawki napędu (Rysunek 1). Przekręć zawór F do pozycji "napęd". Opróżnij strzykawkę zatrzymującą, klikając przycisk Opróżnij w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Powtórz ten krok w sumie dziesięć razy. Wykonać tę samą procedurę z pozostałymi trzema strzykawkami napędowymi. Poczekaj godzinę.
5. Zastąpić roztwór strzykawek zbiornikowych tym samym buforem zawierającym oksydazę glukozową i glukozę. Powtórz krok 2.4.
6. Powtórz krok 2.5 i pozostaw roztwór na noc w systemie przepływowym.
7. Po całonocnej inkubacji powtórzyć krok 2.5.

3. Przygotowanie buforu nasyconego tlenem

1. Przygotować 100 ml buforu fosforanu potasu (pH 7,5) i wlać 50 ml do 50 ml fiolki z mieszadłem. Zakręcić fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową uszczelką Wheaton.
2. Umieścić fiolkę na lodzie. Zanurz w roztworze długą igłę podłączoną do zbiornika zawierającego 100% tlenu. Wprowadzić kolejną krótką igłę przez korek fiolki jako odpowietrznik.
3. Bąbelkować roztwór 100% tlenem przez 1 godzinę z mieszaniem.
4. Najpierw wyjmij krótką igłę z fiolki i odczekaj 10 sekund przed wyjęciem długiej igły. Umieścić zamkniętą fiolkę w schowku na rękawiczki.

4. Przygotowanie roztworu NADPH

1. Odważyć 1 mg NADPH w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i umieścić ją w schowku na rękawiczki.
2. Rozpuścić NADPH w 300 μl beztlenowego 100 mM buforu fosforanu potasu o pH 7,5. Wyjąć 30 μl tego roztworu ze schowka na rękawiczki w celu oznaczenia stężenia NADPH za pomocą spektrofotometru (ε_{340 nm} = 6,270 ^{M-1 cm-1}).

5. Usuwanie tlenu z roztworu enzymatycznego

1. Pobrać 400 μl roztworu podstawowego enzymu z zamrażarki i rozmrozić w schowku na rękawiczki. Roztwór podstawowy enzymu (360 μM) przygotowano wcześniej w 100 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,5) zawierającym 100 mM NaCl i zamrożono w ciekłym azocie.
2. Przenieść roztwór enzymu do fiolki o pojemności 25 ml z mieszadłem, zakryć fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową uszczelką Wheaton i wyjąć z pojemnika na rękawiczki.
3. Umieścić fiolkę na lodzie i podłączyć ją do przewodu Schlenka, wprowadzając igłę przez korek fiolki.
4. Odgazowuje roztwór enzymatyczny, wykonując 5 kolejnych rund odgazowywania próżniowego i płukania argonem co 20 minut przez 1 godzinę.
5. Przepłukać fiolkę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić fiolkę na lodzie w schowku na rękawiczki.

6. Redukcyjna półreakcja: monitorowanie redukcji flawinów

1. Przygotuj przyrząd do zatrzymania przepływu i oprogramowanie sterujące Pro-Data do trybu pojedynczego mieszania zgodnie z protokołem producenta.
2. Włączyć łaźnię z wodą obiegową (15 °C). Usuń tlen z wody, bulgocząc przez nią azotem przez 20 minut. Zapobiega to zanieczyszczeniu tlenem przez obieg przepływu.
3. Utrzymywać temperaturę strzykawek napędowych i komory obserwacyjnej na poziomie 15 °C, podłączając obudowę łaźni wodnej zatrzymanego przepływu do łaźni obiegowej.
4. W oknie Panelu sterowania w oprogramowaniu sterującym Pro-Data wybierz Matryca fotodiod, Wyzwalacz zewnętrzny (aby aktywować operację zatrzymanego przepływu) i Skala logarytmiczna.
5. Uruchom przeglądarkę Pro-Data i zdefiniuj katalog, w którym będą przechowywane pliki danych.
6. Zastąp roztwór strzykawek C i F beztlenowym 100 mM buforem fosforanu potasu (pH 7,5). Przekręć zawory C i F do pozycji "drive". Opróżnij strzykawkę zatrzymującą, klikając przycisk Opróżnij w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor z obu strzykawek napędowych przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc w sumie odpowiedni suwak napędu pięć razy (kliknij przycisk Opróżnij przed każdym ruchem suwaka).
7. Aby upewnić się, że oksydaza glukozowa została całkowicie usunięta z obwodu przepływu, wykonaj krok 6.6 łącznie cztery razy.
8. Kliknij Baseline w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.
9. Zmieszać 100 μl roztworu podstawowego enzymu z 1100 μl beztlenowego 100 mM buforu fosforanu potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w zatrzymanym przepływie 15 μM).
10. Zastąp roztwór strzykawki F roztworem enzymu. Przekręć zawór F do pozycji "napęd". Opróżnij strzykawkę zatrzymującą, klikając przycisk Opróżnij w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Wykonaj to w sumie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustaw czas akwizycji na 60 s.
11. Upewnij się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a siłowniki napędowe stykają się z tłokami strzykawki napędowej. Przekręć oba zawory do pozycji "napęd" i kliknij Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby uruchomić napęd. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech egzemplarzach. W ten sposób uzyskuje się widma utlenionej formy enzymu.
12. Korzystając z wartości A_{452 nm} uzyskanej z napędów, oznacz stężenie enzymu przed zmieszaniem (ε_{452 nm} = 13 700 ^{M-1 cm-1}) i przygotuj 4 ml roztworu NADPH 1,5-krotnie bardziej skoncentrowanego.
13. Zastąpić roztwór strzykawki z zbiornikiem C roztworem NADPH, a następnie opróżnić i ponownie napełnić strzykawkę zatrzymującą trzy razy, jak opisano w ppkt 6.10.
14. Powtórz krok 6.11. W ten sposób powstają widma podczas redukcji enzymu.

7. Półreakcja utleniająca: monitorowanie utleniania flawinów

1. Przygotuj przyrząd do zatrzymania przepływu i oprogramowanie sterujące Pro-Data do trybu podwójnego mieszania zgodnie z protokołem producenta.
2. Powtórz kroki 6.2-6.5.
3. Zastąpić roztwór w czterech strzykawkach zbiornikowych beztlenowym 100 mM buforem fosforanu potasu (pH 7,5). Przekręć zawór F do pozycji "napęd". Opróżnij strzykawkę zatrzymującą, klikając przycisk Opróżnij w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor ze strzykawki napędowej F przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Wykonaj ten krok łącznie pięć razy z każdą strzykawką napędową.
4. Wykonaj krok 7.3 łącznie cztery razy, aby całkowicie usunąć zawartość z obwodu przepływu.
5. Kliknij opcję Baseline (Linia bazowa) w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.
6. Zmieszać 200 μl roztworu podstawowego enzymu z 1000 μl beztlenowego 100 mM buforu fosforanu potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w zatrzymanym przepływie 15 μM).
7. Zastąp roztwór strzykawki zbiornikowej A roztworem enzymu. Przekręć zawór A do pozycji "napęd". Opróżnij strzykawkę zatrzymującą, klikając przycisk Opróżnij w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej A przez obwód przepływu, ręcznie podnosząc odpowiedni suwak napędu. Wykonaj ten krok w sumie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustaw czas opóźnienia na 0,5 s, a czas akwizycji na 60 s.
8. Upewnij się, że wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a siłowniki napędowe stykają się z tłokami strzykawki napędowej. Przekręć wszystkie zawory do pozycji "napęd" i kliknij Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby wykonać napęd. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech egzemplarzach. W ten sposób uzyskuje się widma utlenionej formy enzymu.
9. Zastąpić roztwór strzykawki B roztworem NADPH 1,5-krotnie bardziej skoncentrowanym niż roztwór enzymu w strzykawce A. Przekręcić zawór B do pozycji "napędu", a następnie opróżnić i ponownie napełnić strzykawkę zatrzymującą, jak opisano w ppkt 7.7.
10. Zastąp roztwór strzykawki C zbiornikiem buforowym natlenionym. Przekręcić zawór C do pozycji "napędu", a następnie opróżnić i ponownie napełnić strzykawkę zatrzymującą, jak opisano w ppkt 7.7. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustaw opóźnienie i czas akwizycji odpowiednio na 15 i 900 s.
11. Powtórz krok 7.8. W ten sposób powstają widma podczas reoksydacji w pełni zredukowanego enzymu.

8. Analiza danych

1. Uruchom oprogramowanie konwertujące Pro-Data. Kliknij ikonę Opcje i wybierz opcję Zapisz w ProDataCSV.
2. Otwórz katalog, w którym były przechowywane pliki danych. Przeciągnij pliki do okna konwertera APL Pro-Data. Dane zostaną automatycznie zapisane jako pliki w formacie CSV w tym samym katalogu.
3. Otwórz pliki w formacie CSV za pomocą programu Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Znormalizować linię podstawową śladów zatrzymanego przepływu, odejmując odpowiednią absorpcję przy 700 nm.
4. Przeanalizuj skorygowane ślady za pomocą KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA), dopasowując wykres absorbancji przy odpowiednim maksimum w funkcji czasowej do odpowiedniej funkcji wykładniczej. Jak pokazano na rysunku 2B, absorbancję przy 452 nm wykreślono w funkcji czasu w celu określenia szybkości redukcji flawin po zmieszaniu enzymu i NADPH w przyrządzie do zatrzymania przepływu. W tym przypadku najlepsze dopasowanie danych uzyskano za pomocą równania dwuwykładniczego, a dla pierwszej i drugiej fazy redukcji obliczono współczynniki 0,65 i 0,23 ^s-1. Aby określić szybkość tworzenia się półproduktu C4a-hydroperoksyflawiny i reoksydacji po reakcji zredukowanego enzymu z tlenem, przeanalizowaliśmy ślady zatrzymanego przepływu odpowiednio przy 380 i 452 nm (Figura 3B). Używając pojedynczego równania wykładniczego, obliczyliśmy szybkości 1,4 i 0,006 ^s-1 odpowiednio dla pierwszego i drugiego etapu półreakcji utleniania.

9. Reprezentatywne wyniki

Wyniki eksperymentów opisanych w poprzednich sekcjach pokazują, jak można monitorować redukcyjną reakcję połówkową Af SidA, mierząc zmiany absorbancji przy 452 nm, które odpowiadają zmianom stanu redoks flawiny. Szybkość tego etapu można określić, dopasowując dane do odpowiedniego równania (rysunek 2; Krok 8.4). Uzyskana szybkość redukcji (0,65 ^s-1) jest podobna do wartości k_cat obliczonej w eksperymentach w stanie ustalonym², co sugeruje, że redukcja jest etapem determinującym szybkość reakcji. Korzystając z trybu podwójnego mieszania zatrzymanego przepływu, można określić szybkość utleniania i produkty pośrednie w tej półreakcji (rysunek 3; Krok 8.4). W reakcji katalizowanej przez Af SidA wyraźnie wykrywa się C4a-hydroperoksyflawinę (_{λ maksimum} 380 nm) i można obliczyć szybkość powstawania i rozpadu. Powolna szybkość uzyskanego reoksydacji (0,006 ^s-1) wskazuje, że C4a-hydroperoksyflawina jest bardzo stabilna pod nieobecność ornityny.

Schemat 1. Mechanizm Af SidA. Pokazano pierścień izoallozaksynowy kofaktora FAD. Utleniona flawina (A) wiąże się z NADPH (B) i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę i NADP⁺ (C). Po reakcji z tlenem cząsteczkowym i związaniu ornityny powstaje C4a-hydroperoksyflawina (D). To jest gatunek hydroksylujący. Po hydroksylacji ornityny hydroksyflawina (E) musi zostać odwodniona, aby wytworzyć utleniony enzym. NADP⁺ pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim produktem, który jest uwalniany (F).

Rysunek 1. Przyrząd do pomiaru zatrzymanego przepływu. A) Zdjęcie elementów spektrofotometru spektrofotometru z zatrzymanym przepływem Applied Photophysics SX20. B) Zdjęcie jednostki obsługi próbek. C) Schemat obwodu przepływu w trybie podwójnego mieszania.

Rysunek 2. Beztlenowa redukcja SidA za pomocą NADPH w przyrządzie do zatrzymania przepływu. A) Zmiany widmowe zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości 30 μM SidA i 45 μM NADPH. Pierwsze widmo (utleniony SidA) i ostatnie widmo (w pełni zredukowany SidA) są podświetlone odpowiednio na niebiesko i czerwono. B) Ślad absorpcji przy 452 nm zapisany w funkcji czasu.

Rysunek 3. Utlenianie SidA w przyrządzie do pomiaru zatrzymanego przepływu. A) Zmiany widmowe zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości w pełni zredukowanego SidA i natlenionego buforu. Końcowe stężenia wynosiły 15 μM SidA, 22,5 μM NADPH i 0,95 mM tlenu. Widmo zarejestrowane przy 0,034, 4,268 i 727,494 s odpowiada odpowiednio w pełni zredukowanemu enzymowi, półproduktowi C4a-hydroperoksyflawiny (_{λ maksimum} 380 nm) i utlenionemu enzymowi (λ_maksimum 450 nm). B) Ślad absorpcji przy 382 i 452 nm zapisany w funkcji czasu.

Discussion

Enzymy, które katalizują reakcje redoks, zwykle zawierają kofaktory, takie jak hemy i flawiny, które ulegają znacznym zmianom absorbancji podczas cyklu katalitycznego. Utleniona forma flawiny wykazuje maksima absorbancji przy ~ 360 i 450 nm, a jej redukcja jest zwykle monitorowana poprzez podążanie za spadkiem absorbancji przy 450 nm⁷. Ogólnie rzecz biorąc, niektóre przejściowe produkty pośrednie są obecne, ale tworzą się i rozpadają zbyt szybko, aby można je było zmierzyć w zwykłych spektrofotometrach. Za pomocą spektrofotometru z przepływem zatrzymanym Applied Photophysics SX20 (lub podobnych instrumentów) możliwy jest pomiar zmian absorbancji w milisekundowej skali czasu (czas martwy, 2 ms). Tutaj badaliśmy redukcyjne i utleniające półreakcje zależnej od flawiny monooksygenazy Af SidA, służąc jako model. Szybkość przenoszenia wodorków określono poprzez pomiar zmiany absorbancji przy 452 nm po zmieszaniu enzymu z NADPH w warunkach beztlenowych. Następnie, wykorzystując tryb podwójnego mieszania przyrządu z zatrzymanym przepływem, enzym najpierw przereagowano z NADPH, aż do osiągnięcia pełnej redukcji, a następnie zredukowany kompleks enzymatyczny NADP⁺ zmieszano z tlenem. Po tej procedurze możliwe jest wykrycie przejściowych utlenionych produktów pośrednich flawiny oraz zmierzenie szybkości powstawania i rozpadu. Identyfikacja tych produktów pośrednich dostarcza danych eksperymentalnych na temat charakteru gatunków reagujących w katalizie. W przypadku Af SidA, tworzenie C4a-hydroperoksyflawiny (zwykle monitorowanej przy 370-380 nm), która jest formą hydroksylującą. Ponadto pomiar stałej szybkości każdego kroku pozwala uzyskać informacje na temat etapu determinującego szybkość reakcji i pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów kinetycznych i chemicznych enzymu.

Ogólnie rzecz biorąc, podobne podejścia można zastosować do innych flawoenzymów lub białek, dla których wystąpiły zmiany absorbancji, takich jak białka zawierające hem, fosforan pirydoksalu lub żelazo^{niehemowe 8-10}. Ograniczeniem tej metody jest to, że wymagane są duże ilości oczyszczonego enzymu, ale można to przezwyciężyć za pomocą systemu ekspresji o wysokiej wydajności. Optymalne stężenie białka do rejestrowania widm określa się za pomocą wystarczającej ilości białka, aby można było zaobserwować wystarczająco silny sygnał, ale nie za dużo, aby enzym nie został zmarnowany. Zazwyczaj najniższe stężenie enzymu dla enzymów zawierających flawiny stosowanych w eksperymentach z zatrzymanym przepływem wynosi 6-10 μM (po zmieszaniu) i jest oznaczane przy użyciu odpowiedniego współczynnika ekstynkcji molowej enzymu. W przypadku Af SidA procent FAD związanego z enzymem wynosi 50-65%². Białko Apo jest uważane za nieaktywne w tych eksperymentach, ponieważ związany kofaktor FAD jest niezbędny do katalizy. Innym możliwym ograniczeniem tej metody jest to, że jeśli procesy w enzymie zachodzą szybciej niż 2 ms (czas martwy zatrzymanego przepływu), nie zostaną zaobserwowane, ale istnieją doniesienia o strategiach, w których można zmniejszyć szybkość, aby przezwyciężyć ten problem. Jednym z przykładów jest zastosowanie wysokiego stężenia NaCl w reakcji reduktazy ferredoksyny-NADP^{+ 11}. Oczyszczanie tlenu z obwodu przepływu zatrzymanego przepływu jest często trudnym krokiem w tym eksperymencie i wymaga szczególnej uwagi. Opisany tutaj system oksydaza glukoza-glukoza jest z powodzeniem stosowany w większości laboratoriów, ponieważ jest to skuteczna i niedroga metoda. Istnieją jednak pewne wady, do których należy produkcja_H2O2, a w przypadku niektórych zastosowań należy rozważyć inne alternatywy, takie jak system dioksygenazy-protokatechuat¹². Zastosowanie beztlenowej komory rękawicowej ułatwia zapewnienie warunków beztlenowych, ale nie jest konieczne. Tlen musi zostać usunięty z obwodu przepływu zatrzymanego, ponieważ chcemy, aby enzym został zredukowany przy braku tlenu lub reagował z tlenem w określonych przez nas stężeniach. Chociaż zatrzymany przepływ znajduje się w komorze rękawicowej, w obwodzie przepływu znajduje się tlen, jeśli użyliśmy tlenowych w poprzednich eksperymentach. Oprócz pomiarów absorbancji, w spektrofotometrze z zatrzymanym przepływem Applied Photophysics SX20 można wykonać testy fluorescencji i dichroizmu kołowego z odpowiednimi akcesoriami.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pompa próżniowa	Welch	Allyn-B
ü Kolby	Fisher Scientific	70340-500
Mieszadła	Fisher Scientific	14-512-129
Płytki mieszające	Fisher Scientific	11-100-49S
Linie Schlenk	Kontes	Corp-Argon
Zbiornik	Airgas	AR UPC300
Zbiornik azotu	Airgas	NI200
Zbiornik azotu, ultra wysoka czystość	Airgas	NI UHP200
Zbiornik tlenu	Airgas	OX 40
5% Zbiornik azotu równowagi wodorowej	Airgas	X02NI95B200H998
SX20 Spektrofotometr o zatrzymanym przepływie	AppliedPhotophysics-Schowek
na rękawiczki	Coy Laboratories, Inc.	-
Kąpiel wodna	Lauda Brinkmann-50
ml BD Probówki Falcon	Fisher Scientific	14-432-23
15 ml BD Falcon rurki stożkowe	Fisher Scientific	05-527-90
1,5 ml Probówki do mikrowirówek Eppendorf	Fisher Scientific	05-402-18
Fiolki szklane 50 i 25 ml	Fisher Scientific	06-402
Korki gumowe	Fisher Scientific	06-447H
Uszczelki aluminiowe	Fisher Scientific	06-406-15
Fosforan potasu, jednozasadowy	Fisher Scientific	AC2714080025
Fosforan potasu, dwuzasadowy	Fisher Scientific	P288-500
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S-2889
Oksydaza glukozowa z A. niger	Sigma-Aldrich	G7141-250KU
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-500
β -NADPH	Fisher Scientific	ICN10116783
Chlorowodorek L(+)-ornityny	Fisher Scientific	ICN10116783