Artykuł metodologiczny

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3803

⸱

18 marca 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy zastosowanie spektrometru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) do badania reakcji redukcyjnej i utleniającej sideroforu A Aspergillus fumigatus (SidA), który jest monooksygenazą zależną od flawiny. Następnie przedstawiamy widma odpowiadające produktom reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Streszczenie

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) to zawierająca FAD monooksygenaza, która katalizuje hydroksylację ornityny w biosyntezie sideroforów hydroksymatowych, niezbędnych dla wirulencji (np. ferrycyrocyny lub N',N",N'''-triacetylfuzaryniny C)1. Reakcję katalizowaną przez SidA można podzielić na półreakcje redukcyjną i oksydacyjną (Schemat 1). W półreakcji redukcyjnej utleniony FAD związany z Af SidA ulega redukcji przez NADPH2,3. W półreakcji oksydacyjnej zredukowany kofaktor reaguje z tlenem cząsteczkowym, tworząc produkt pośredni w postaci C4a-hydroperoksyflawiny, która przenosi atom tlenu na ornitynę. W niniejszej pracy opisujemy procedurę pomiaru szybkości reakcji oraz detekcji różnych form spektralnych SidA przy użyciu urządzenia typu stopped-flow zainstalowanego w beztlenowej komorze rękawicowej. W urządzeniu stopped-flow małe objętości substratów są szybko mieszane, a po zatrzymaniu przepływu przez strzykawkę stopową (Rysunek 1) rejestrowane są zmiany spektralne roztworu umieszczonego w komorze obserwacyjnej w funkcji czasu. W pierwszej części eksperymentu pokazujemy, jak można wykorzystać urządzenie stopped-flow w trybie pojedynczym, w którym bezpośrednio mierzy się beztlenową redukcję flawiny w Af SidA przez NADPH. Następnie stosujemy ustawienia podwójnego mieszania, w których Af SidA jest najpierw beztlenowo redukowany przez NADPH przez określony czas w pętli starzenia, a następnie reaguje z tlenem cząsteczkowym w komorze obserwacyjnej (Rysunek 1). Do przeprowadzenia tego eksperymentu niezbędne są beztlenowe bufory, ponieważ podczas monitorowania wyłącznie półreakcji redukcyjnej jakikolwiek tlen w roztworach zareagowałby z zredukowanym kofaktorem flawinowym, tworząc produkt pośredni C4a-hydroperoksyflawiny, który ostatecznie rozpadłby się z powrotem do utlenionej flawiny. Uniemożliwiłoby to dokładny pomiar szybkości redukcji ze względu na pełny obrót enzymatyczny. Podczas badania półreakcji oksydacyjnej enzym musi zostać zredukowany w obecności tlenu, aby zaobserwować wyłącznie etapy pomiędzy redukcją a utlenianiem. Jeden z buforów użytych w tym eksperymencie jest nasycony tlenem, co pozwala na badanie półreakcji oksydacyjnej przy wyższych stężeniach tlenu. Są to standardowe procedury stosowane podczas badania półreakcji redukcyjnych lub oksydacyjnych w monooksygenazach zawierających flawinę. Skala czasowa eksperymentów przedstanowych przeprowadzanych metodą stopped-flow wynosi od milisekund do sekund, co pozwala na wyznaczenie wewnętrznych stałych szybkości oraz detekcję i identyfikację produktów pośrednich w reakcji4. Opisane tutaj procedury można zastosować do innych monooksygenaz zależnych od flawiny.5,6

Protokół

1. Przygotowanie buforu beztlenowego

  1. Przygotować 1 L 100 mM buforu fosforanowego potasu o pH 7,5. Wlać 250 mL buforu do kolby Büchnera o pojemności 500 mL z magnesem do mieszania.
  2. Zamknąć kolbę korkiem gumowym i ustawić na mieszadle magnetycznym. Podłączyć krótką rurkę kolby do linii Schlenka.
  3. Odgazować bufor pod próżnią przez 5 godzin w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. W tym czasie przeprowadzić 5 kolejnych cykli odgazowania próżniowego i przepłukiwania argonem w odstępach godzinnych.
  4. Przepłukać kolbę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić kolbę w komorze glove box.
  5. Pozostawić otwartą kolbę w komorze glove box przez noc przy intensywnym mieszaniu.

2. Usuwanie tlenu z układu stopped-flow

  1. Przygotować 1 L 0,1 M octanu sodu o pH 5,0. Wlać 125 mL tego buforu do kolby Büchnera o pojemności 250 mL i wykonać kroki 1.2-1.4.
  2. Odważyć 5 mg oksydazy glukozowej z Aspergillus niger (181300 U/g) do probówki Eppendorfa 1,5 mL oraz 0,9 g glukozy do stożkowej probówki Falcon 50 mL. Umieścić oba pojemniki w komorze rękawicowej.
  3. Rozpuścić oksydazę glukozową i glukozę w 50 mL anaerobowego 0,1 M octanu sodu o pH 5,0 (stężenia końcowe odpowiednio 18,13 U/mL i 100 mM). Napełnić strzykawki zbiornikowe tym roztworem (Rycina 1).
  4. Upewnić się, że zawory napędowe znajdują się w pozycji „load” (ładowanie) i napełnić strzykawki napędowe (Rycina 1). Przekręcić zawór F do pozycji „drive” (napęd). Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przetłoczyć bufor ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Powtórzyć ten krok łącznie dziesięć razy. Wykonać tę samą procedurę z pozostałymi trzema strzykawkami napędowymi. Odczekać jedną godzinę.
  5. Wymienić roztwór w strzykawkach zbiornikowych na ten sam bufor zawierający oksydazę glukozową i glukozę. Powtórzyć krok 2.4.
  6. Powtórzyć krok 2.5 i pozostawić roztwór w układzie przepływowym na noc.
  7. Po inkubacji nocnej powtórzyć krok 2.5.

3. Przygotowanie buforu nasyconego tlenem

  1. Przygotować 100 mM bufor fosforan potasu (pH 7.5) i przelać 50 mL do fiolki o pojemności 50 mL z mieszadłem magnetycznym. Zamknąć fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową plombą Wheaton.
  2. Umieścić fiolkę w lodzie. Zanurzyć w roztworze długą igłę podłączoną do zbiornika z 100% tlenem. Wprowadzić przez korek fiolki drugą, krótką igłę, pełniącą funkcję odpowietrznika.
  3. Napowietrzać roztwór 100% tlenem przez 1 godzinę przy jednoczesnym mieszaniu.
  4. Najpierw wyjąć z fiolki krótką igłę, a po 10 sekundach wyjąć długą igłę. Umieścić zamkniętą fiolkę w komorze rękawicowej.

4. Przygotowanie roztworu NADPH

  1. Odważ 1 mg NADPH do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL i umieść ją w komorze rękawicowej.
  2. Rozpuść NADPH w 300 μL anaerobowego buforu fosforanowego potasu o stężeniu 100 mM i pH 7,5. Pobierz 30 μL tego roztworu z komory rękawicowej, aby określić stężenie NADPH za pomocą spektrofotometru (ε340 nm= 6,270 M-1cm-1).

5. Usuwanie tlenu z roztworu enzymu

  1. Pobrać 400 μL roztworu enzymu z zamrażarki i rozmrozić w komorze rękawicowej. Roztwór enzymu (360 μM) został wcześniej przygotowany w 100 mM buforze fosforanowym potasu (pH 7.5) zawierającym 100 mM NaCl i zamrożony w ciekłym azocie.
  2. Przenieść roztwór enzymu do fiolki o pojemności 25 mL z mieszadełkiem magnetycznym, zamknąć fiolkę korkiem Wheaton i aluminiową plombą Wheaton, a następnie wyjąć z komory rękawicowej.
  3. Umieścić fiolkę w lodzie i podłączyć do linii Schlenka, wprowadzając igłę przez korek fiolki.
  4. Odgazować roztwór enzymu, wykonując 5 kolejnych cykli odgazowywania próżniowego i przepłukiwania argonem co 20 minut przez 1 godzinę.
  5. Przepłukać fiolkę argonem przez 10 sekund i odłączyć ją od kolektora próżniowego. Umieścić fiolkę w lodzie wewnątrz komory rękawicowej.

6. Redukcyjna półreakcja: Monitorowanie redukcji flawiny

  1. Przygotować aparat stopped-flow oraz oprogramowanie sterujące Pro-Data do trybu pojedynczego mieszania zgodnie z protokołem producenta.
  2. Włączyć cyrkulacyjną kąpiel wodną (15 °C). Usunąć tlen z wody poprzez przepuszczanie azotu przez 20 minut. Zapobiega to zanieczyszczeniu tlenem układu przepływowego.
  3. Utrzymać temperaturę strzykawek napędowych i komory obserwacyjnej na poziomie 15 °C, podłączając obudowę kąpieli wodnej urządzenia stopped-flow do łaźni cyrkulacyjnej.
  4. W oknie Control Panel oprogramowania sterującego Pro-Data wybrać wyzwalacz Photodiode Array, External (aby aktywować działanie stopped-flow) oraz skalę logarytmiczną.
  5. Uruchomić oprogramowanie Pro-Data viewer i określić katalog, w którym przechowywane będą pliki z danymi.
  6. Zastąpić roztwór w strzykawkach rezerwuarowych C i F beztlenowym 100 mM buforem fosforanowym potasu (pH 7.5). Przekręcić zawory C i F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor z obu strzykawek napędowych przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiednie tłoki napędowe łącznie pięć razy (przed każdym ruchem tłoka kliknąć Empty).
  7. Aby upewnić się, że oksydaza glukozowa została całkowicie usunięta z układu przepływowego, wykonać krok 6.6 łącznie cztery razy.
  8. Kliknąć Baseline w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.
  9. Zmieszać 100 μL roztworu enzymu z zapasu z 1100 μL beztlenowego 100 mM buforu fosforanowego potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w układzie stopped-flow wyniesie 15 μM).
  10. Zastąpić roztwór w strzykawce rezerwuarowej F roztworem enzymu. Przekręcić zawór F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiedni tłok napędowy. Wykonać tę czynność łącznie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas akwizycji na 60 s.
  11. Upewnić się, że obie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek. Przekręcić oba zawory do pozycji „drive” i kliknąć Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby wykonać napęd. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech powtórzeniach. Pozwala to na uzyskanie widm utlenionej formy enzymu.
  12. Wykorzystując wartość A452 nm uzyskaną z pomiarów, wyznaczyć stężenie enzymu przed mieszaniem (ε452 nm= 13,700 M-1cm-1) i przygotować 4 mL roztworu NADPH o stężeniu 1,5-krotnie wyższym.
  13. Zastąpić roztwór w strzykawce rezerwuarowej C roztworem NADPH oraz opróżnić i napełnić strzykawkę stopową trzy razy, zgodnie z opisem w punkcie 6.10.
  14. Powtórzyć krok 6.11. Pozwala to na uzyskanie widm podczas redukcji enzymu.

7. Utleniająca półreakcja: monitorowanie utleniania flawiny

  1. Przygotować aparat do pomiarów stop-flow oraz oprogramowanie sterujące Pro-Data do pracy w trybie podwójnego mieszania zgodnie z protokołem producenta.
  2. Powtórzyć kroki 6.2-6.5.
  3. Wymienić roztwór w czterech strzykawkach zbiorczych na beztlenowy 100 mM bufor fosforanowy potasu (pH 7.5). Przekręcić zawór F do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć bufor ze strzykawki napędowej F przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wykonać ten krok łącznie pięć razy dla każdej strzykawki napędowej.
  4. Wykonać krok 7.3 łącznie cztery razy, aby całkowicie usunąć zawartość z układu przepływowego.
  5. Kliknąć Baseline w oprogramowaniu sterującym Pro-Data.
  6. Zmieszać 200 μL roztworu enzymu z zapasu z 1000 μL beztlenowego 100 mM buforu fosforanowego potasu (stężenie końcowe po zmieszaniu w stop-flow wynoszące 15 μM).
  7. Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej A na roztwór enzymu. Przekręcić zawór A do pozycji „drive”. Opróżnić strzykawkę stopową, klikając Empty w oprogramowaniu sterującym Pro-Data. Przepchnąć roztwór enzymu ze strzykawki napędowej A przez układ przepływowy, ręcznie podnosząc odpowiadający jej tłok napędowy. Wykonać ten krok łącznie trzy razy. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas opóźnienia (delay time) na 0.5 s i czas akwizycji (acquisition time) na 60 s.
  8. Upewnić się, że wszystkie strzykawki napędowe są wypełnione odpowiednimi roztworami, a tłoki napędowe stykają się z tłokami strzykawek napędowych. Przekręcić wszystkie zawory do pozycji „drive” i kliknąć Acquire w oprogramowaniu sterującym Pro-Data, aby wykonać pomiar. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać dane w trzech powtórzeniach. Pozwala to na uzyskanie widm utlenionej formy enzymu.
  9. Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej B na roztwór NADPH o stężeniu 1,5 raza większym niż roztwór enzymu w strzykawce A. Przekręcić zawór B do pozycji „drive”, a następnie trzy razy opróżnić i napełnić strzykawkę stopową, jak opisano w punkcie 7.7.
  10. Wymienić roztwór w strzykawce zbiorczej C na bufor natleniony. Przekręcić zawór C do pozycji „drive”, a następnie trzy razy opróżnić i napełnić strzykawkę stopową, jak opisano w punkcie 7.7. W oprogramowaniu sterującym Pro-Data ustawić czas opóźnienia i czas akwizycji odpowiednio na 15 i 900 s.
  11. Powtórzyć krok 7.8. Pozwala to na uzyskanie widm podczas reoksydacji całkowicie zredukowanego enzymu.

8. Analiza danych

  1. Uruchom oprogramowanie Pro-Data converter. Kliknij ikonę Options i wybierz Save in ProDataCSV.
  2. Otwórz katalog, w którym zapisano pliki danych. Przeciągnij pliki do okna konwertera APL Pro-Data. Dane zostaną automatycznie zapisane w formacie CSV w tym samym katalogu.
  3. Otwórz pliki w formacie CSV za pomocą programu Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Znormalizuj linię bazową zapisów stopped-flow poprzez odjęcie odpowiadającej im absorbancji przy 700 nm.
  4. Przeanalizuj skorygowane zapisy za pomocą programu KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA), dopasowując wykres absorbancji w odpowiadającym maksimum w funkcji czasu do odpowiedniej funkcji wykładniczej. Jak pokazano na Ryc. 2B, absorbancję przy 452 nm przedstawiono w funkcji czasu, aby określić szybkość redukcji flawiny po zmieszaniu enzymu i NADPH w urządzeniu stopped-flow. W tym przypadku najlepsze dopasowanie danych uzyskano przy użyciu równania dwuwykładniczego, a dla pierwszej i drugiej fazy redukcji obliczono szybkości wynoszące odpowiednio 0.65 i 0.23 s-1. Aby określić szybkość powstawania produktu pośredniego C4a-hydroperoksyflawiny oraz reoksydację po reakcji zredukowanego enzymu z tlenem, przeanalizowano zapisy stopped-flow odpowiednio przy 380 i 452 nm (Ryc. 3B). Przy użyciu równania jednowykładniczego obliczono szybkości wynoszące odpowiednio 1.4 i 0.006 s-1 dla pierwszego i drugiego etapu utleniającej półreakcji.

9. Reprezentatywne wyniki

Wyniki eksperymentów opisanych w poprzednich sekcjach pokazują, w jaki sposób można monitorować reakcję połowiczną redukcji Af SidA poprzez pomiar zmian absorbancji przy 452 nm, które odpowiadają zmianom stanu redoks flawiny. Szybkość tego etapu można określić poprzez dopasowanie danych do odpowiedniego równania (Rycina 2; krok 8.4). Uzyskana szybkość redukcji (0,65 s-1) jest zbliżona do wartości kcat obliczonej w eksperymentach w stanie stacjonarnym2, co sugeruje, że redukcja jest etapem limitującym szybkość reakcji. Wykorzystując tryb podwójnego mieszania w technice stopped-flow, można określić szybkość utleniania oraz produkty pośrednie w tej reakcji połowicznej (Rycina 3; krok 8.4). W reakcji katalizowanej przez Af SidA wyraźnie wykryto C4a-hydroperoksyflawinę (λmax wynoszące 380 nm), a także obliczono szybkość jej powstawania i rozkładu. Niska uzyskana szybkość reoksydacji (0,006 s-1) wskazuje, że C4a-hydroperoksyflawina jest bardzo stabilna w obecności ornityny.

Kataliza enzymatyczna przedstawiająca reakcje połowiczne redukcyjne i utleniające, schemat struktury chemicznej.
Schemat 1. Mechanizm Af SidA. Przedstawiono pierścień izoallozaksyny kofaktora FAD. Utleniona flawina (A) wiąże NADPH (B) i reaguje, tworząc zredukowaną flawinę oraz NADP+ (C). Po reakcji z tlenem cząsteczkowym i związaniu ornityny powstaje C4a-hydroperoksyflawina (D). Jest to gatunek hydroksylujący. Po hydroksylacji ornityny hydroksyflawina (E) musi ulec odwodnieniu, aby utworzyć utleniony enzym. NADP+ pozostaje związany przez cały cykl katalityczny i jest ostatnim uwalnianym produktem (F).

Układ spektroskopowy ze stacją roboczą PC do pomiaru absorpcji przejściowej; schemat i etykiety sprzętu.
Rysunek 1. Instrument do pomiarów stopped-flow. A) Zdjęcie komponentów spektrofotometru stopped-flow Applied Photophysics SX20. B) Zdjęcie jednostki do obsługi próbek. C) Schemat obwodu przepływowego w trybie podwójnego mieszania.

Widma absorbancji i dane kinetyczne; analiza absorpcji przejściowej; pomiary fotoniczne.
Rycina 2. Beztlenowa redukcja SidA za pomocą NADPH w urządzeniu stopped-flow. A) Zmiany widmowe zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości 30 μM SidA i 45 μM NADPH. Pierwsze widmo (utlenione SidA) oraz ostatnie widmo (całkowicie zredukowane SidA) zaznaczono odpowiednio kolorem niebieskim i czerwonym. B) Przebieg absorbancji przy 452 nm zarejestrowany w funkcji czasu.

Wykres absorbancji w funkcji długości fali; spektroskopia UV-Vis; wskazuje na różne stężenia; piki spektralne.
Rycina 3. Utlenianie SidA w urządzeniu stopped-flow. A) Zmiany spektralne zarejestrowane po zmieszaniu równych objętości w pełni zredukowanego SidA oraz buforu natlenionego. Końcowe stężenia wynosiły 15 μM SidA, 22.5 μM NADPH oraz 0.95 mM tlenu. Widma zarejestrowane w czasie 0.034, 4.268 i 727.494 s odpowiadają odpowiednio w pełni zredukowanemu enzymowi, pośrednikowi w postaci C4a-hydroperoksyflawiny (λmax 380 nm) oraz utlenionemu enzymowi (λmax 450 nm). B) Przebieg absorbancji przy 382 i 452 nm zarejestrowany w funkcji czasu.

Dyskusja

Enzymy katalizujące reakcje redoks zazwyczaj zawierają kofaktory, takie jak hem i flawiny, które ulegają znacznym zmianom absorbancji w cyklu katalitycznym. Utleniona forma flawiny wykazuje maksima absorbancji przy ~ 360 i 450 nm, a jej redukcję zazwyczaj monitoruje się, śledząc spadek absorbancji przy 450 nm7. Co do zasady obecne są pewne przejściowe produkty pośrednie, jednak powstają i zanikają one zbyt szybko, aby można je było zmierzyć w zwykłych spektrofotometrach. Wykorzystując spektrofotometr stop-flow Applied Photophysics SX20 (lub podobne instrumenty), możliwe jest pomiar zmian absorbancji w skali milisekundowej (czas martwy, 2 ms). W niniejszej pracy zbadaliśmy reakcje połowiczne redukcyjne i oksydacyjne monooksygenazy zależnej od flawiny Af SidA, służącej jako model. Szybkość przeniesienia wodorku określono poprzez pomiar zmiany absorbancji przy 452 nm po zmieszaniu enzymu z NADPH w warunkach anaerobowych. Następnie, wykorzystując tryb podwójnego mieszania instrumentu stop-flow, enzym zareagował najpierw z NADPH aż do osiągnięcia pełnej redukcji, a następnie zredukowany kompleks enzym-NADP+ zmieszano z tlenem. Stosując tę procedurę, możliwe jest wykrycie przejściowych utlenionych produktów pośrednich flawiny oraz pomiar szybkości ich powstawania i zanikania. Identyfikacja tych produktów pośrednich dostarcza danych eksperymentalnych na temat natury gatunków reagujących w katalizie. W przypadku Af SidA jest to powstawanie C4a-hydroperoksyflawiny (zazwyczaj monitorowanej przy 370-380 nm), która jest gatunkiem hydroksylującym. Ponadto pomiar stałej szybkości każdego etapu pozwala uzyskać informacje o etapie limitującym szybkość reakcji i pomaga wyjaśnić kinetyczne i chemiczne mechanizmy działania enzymu.

Ogólnie rzecz biorąc, podobne podejścia można zastosować do innych flawoenzymów lub białek, w których dochodzi do zmian absorbancji, takich jak białka zawierające hem, fosforan pyridoksalu lub żelazo niehemowe8-10. Ograniczeniem tej metody jest konieczność zastosowania dużych ilości oczyszczonego enzymu, co można jednak rozwiązać, wykorzystując system ekspresyjny o wysokiej wydajności. Optymalne stężenie białka do rejestracji widm ustala się tak, aby użyć ilości białka pozwalającej na zaobserwowanie wystarczająco silnego sygnału, ale nie tak dużej, aby nie marnować enzymu. Zazwyczaj najniższe stężenie enzymów zawierających flawinę stosowane w eksperymentach typu stopped-flow wynosi 6-10 μM (po zmieszaniu) i jest wyznaczane przy użyciu odpowiedniego molowego współczynnika ekstynkcji enzymu. W przypadku Af SidA procent enzymu z związanym FAD wynosi 50-65%2. Apo-białko jest w tych eksperymentach uważane za nieaktywne, ponieważ do katalizy niezbędny jest związany kofaktor FAD. Kolejnym możliwym ograniczeniem tej metody jest fakt, że procesy w enzymie zachodzące szybciej niż w ciągu 2 ms (czas martwy aparatury stopped-flow) nie zostaną zaobserwowane, jednak opisano strategie pozwalające na obniżenie szybkości reakcji w celu rozwiązania tego problemu. Przykładem takiego rozwiązania jest zastosowanie wysokiego stężenia NaCl w reakcji reduktazy ferredoksyny-NADP+11. Usuwanie tlenu z obwodu przepływowego urządzenia stopped-flow jest często trudnym etapem tego eksperymentu i wymaga szczególnej uwagi. Opisany tutaj system oksydaza glukozowa-glukoza jest z sukcesem stosowany w większości laboratoriów, ponieważ jest to metoda skuteczna i niedroga. Istnieją jednak pewne wady, do których należy produkcja H2O2, a w niektórych zastosowaniach należy rozważyć inne alternatywy, takie jak system dioksygenaza protokatechuanowa-protokatechuan12. Wykorzystanie beztlenowej komory rękawicowej (glove box) ułatwia zapewnienie warunków anaerobowych, ale nie jest ono niezbędne. Tlen musi zostać usunięty z obwodu przepływowego stopped-flow, ponieważ chcemy, aby enzym został zredukowany w obecności tlenu lub reagował z tlenem w określonych przez nas stężeniach. Mimo że urządzenie stopped-flow znajduje się w komorze rękawicowej, w obwodzie przepływowym może znajdować się tlen, jeśli w poprzednich eksperymentach stosowano bufory tlenowe. Oprócz pomiarów absorbancji, w spektrofotometrze stopped-flow Applied Photophysics SX20 z odpowiednimi akcesoriami można przeprowadzać analizy fluorescencyjne oraz dichroizmu kołowego.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych informacji do ujawnienia.

Podziękowania

Badania wspierane przez grant NSF MCB-1021384.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa próżniowaWelch Allyn-
Bükolby EhrlenmeyeraFisher Scientific70340-500
Mieszadła magnetyczneFisher Scientific14-512-129
Mieszadła magnetyczneFisher Scientific11-100-49S
Linie SchlenkaKontes Corp-
Butla z argonem AirgasAR UPC300
Zbiornik z azotemAirgasNI200
Zbiornik z azotem, stopień ultrawysokiej czystościAirgasNI UHP200
Butla z tlenemAirgasOX 40
Zbiornik z mieszanką 5% wodoru w azocieAirgasX02NI95B200H998
SX20 Spektrofotometr z przepływem zatrzymywanymZastosowana Fotofizyka-
Pudło rękawicoweCoy Laboratories, Inc.-
Kąpiel wodnaLauda Brinkmann-
probówki BD Falcon o pojemności 50 mlFisher Scientific14-432-23
probówki stożkowate BD Falcon 15 mLFisher Scientific05-527-90
probówki do mikrocentryfugi Eppendorf o pojemności 1,5 mlFisher Scientific05-402-18
szklane fiolki o pojemności 50 i 25 mlFisher Scientific06-402
Korki gumoweFisher Scientific06-447H
Uszczelki aluminioweFisher Scientific06-406-15
Fosforan potasu(I) jednoprzestrzennyFisher ScientificAC2714080025
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ScientificP288-500
Octan soduSigma-AldrichS-2889
Oksydaza glukozowa z A. nigerSigma-AldrichG7141-250KU
D-glukozaFisher ScientificD16-500
β-NADPHFisher ScientificICN10116783
chlorowodorek L(+)-ornitynyFisher ScientificICN10116783

Bibliografia

  1. Hissen, A. H. The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence. Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).
  2. Chocklett, S. W., Sobrado, P. Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor. Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).
  3. Mayfield, J. A. Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase. J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).
  4. Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , Elsevier. USA. (2009).
  5. Palfey, B. A., McDonald, C. A. Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases. Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).
  6. van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).
  7. Chapman, S. K., Reid, G. A. Flavoprotein Protocols. , Humana Press. Totowa, USA. (1999).
  8. Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).
  9. Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. Substituent effects on the reaction of β-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase. Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).
  10. Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. (μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse. Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).
  11. Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry. Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).
  12. Patil, P. V., Allou, D. P. The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments. Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Po owa reakcji redukcyjnejpo owa reakcji utleniaj cejwarunki beztlenoweutlenianie NADPHreakcja tlenuanaliza spektralnakinetyka enzymatycznadetekcja produkt w po rednich

Powiązane artykuły